专利名称：：用于对谷物穗丝或其它多细长丝条计数的方法及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及以相对高吞吐量和可接受精确度自动或者半自动地对相对小的、离散的细长丝条或者物品计数的方法，特别地，涉及在各种应用中利用该计数的方法。本发明的一个具体应用是对植株的相对小的、细长的部分(例如玉蜀黍穗的穗丝)计数，并且将该计数有利地用于例如描绘植株或其基因型的特征，或者确定植株或其基因型是否具有用于进一步研究或者商业目的的期望特性或者特点。B现有技术中存在的问题非常期待植株特性的提升。最终用户需要在给定条件下良好生长的品种和杂种。因此种子公司花费大量的资源来开发不同品种和杂种以迎合用户的需要。然而，与植株有关的研发复杂、劳动强度大且耗时。植株科学存在改善研究方法的实质需求。以玉米为例，已经发现从玉米植株穗露出的穗丝的数量可以作为良好的指标，尤其是对植株的潜在种子产量而言。因此，科学家可手工对同系交配或者杂交基因连锁的穗丝计数，并预测品种或者杂种潜在产量或者产量的构成。这可以有助于作出特定的同系交配或者杂交对于持续开发或商业化是否为良好候选的决定。如在本
技术领域：
中众所周知的，实验评估经常同时涉及几百或几千不同种类或杂交的期待特性。然而，对穗丝计数的常规方法需要手工地对每条穗丝部分计数。在一定时期出现的玉米穗丝的特性，有时候通称为穗丝束具有的性质，使手工计数很费时并且是冗长乏味的(通常每穗近似几百条穗丝，每个穗丝都具有小的直径并且长到几英寸长度)。每条相对小的穗丝条必须被明确地确定，并且仅被计数一次。这多少有点像在头发辫或一簇头发中对每根头发进行计数；这不仅需要大量的时间，而且当工人在很长的时期内对多条穗的穗丝计数时，容易产生错误。在不必除去穗(从而使其与未被取样的植株无实质区别地获得授粉)的情况下获得穗丝数量是有利的。如果在户外对活的植株进行计数，不利的环境条件(例如风、高温、灰尘)导致更难处理。快速获得数值从而可以尽可能早地做出关于同系交配或者杂交连锁的决定也是有利的。穗计数的常规手工方法需要大量的劳动和时间，这可能耽搁有效使用穗计数信息的能力。可以理解，根据待计数植株的数量(在某些商业种子实验中可以是成千上万的)加大了劳动成本和延期。而且，特别地如果在穗丝出现时窗中较早地进行计数，则穗丝在不同时间以不同速率出现，使大量计数变得困难。因此，本领域实际需要提供一种穗丝计数方法，该方法改进以下方面a.吞吐量(每次计数的平均时间)；b.时间；c.精确度；d.可重复性和再现性；e.便利性；f.便携性；以及g.灵活性。需要至少部分自动计数且处理计数数据以及处理计数涉及的植株或者穗的能力。例如，这可以有利地应用于评定由环境、基因型或者农事管理实践影响的生产量。还可以有利于使授粉最大化且使偶然性的出现最小化。将安德森等人(Andersonetal.)于2004年在《农业科技》(CropSci.44:464-473)中讨论了授粉和麦粒畸形对产量的影响，其内容通过引用并入本文。因此，需要更快、更高吞吐量、更有效且更精确的穗丝计数方法。需要从玉米和其它植株提取穗丝样本的定量的、精确的、快速的、可靠的和可再生的方法。还需要对玉米和其它植株的穗丝计数的定量的、精确的、快速的、高可靠性和可再生的方法。同样地，需要改进的方法以便描绘穗丝从出现到生长以及植株其它特点的特征，比较植株或者多种植株之间的这些特点、评估环境或者培养实践，和/或评估植株或者多种植株涉及的特性或者特征，以及评估是否进一步在例如商业生产、植株育种或者研发中使用。其它类型的对玉米或者其它植株的相对小而细长的部分或者对象的计数方法也具有相似的问题，可以通过本发明的一个或多个方案以相似的方法进行处理。而且，在取得待计数部分或者对象的定量取样并对大量细长非植物丝条或碎片计数中也可以获得相似的益处。一些非限定性示例包括光纤、头发、线状物、纤维、细丝、线团、电线、钢筋束、细绳等等。例如，可以将该计数方法用于质量控制检查中，以确保许多连贯的丝条被包括在多束丝条中的每根中。另一个示例是检查多套或者多束丝条之间的差异。
发明内容本发明的一个方案涉及自动或者半自动地对玉米穗的穗丝计数的方法以便减少手工计数的劳动和时间。可以将本方法应用于其它类型植株穗丝的相似计数，或者其它植株部分或相关物质的计数，或者对非植物物质计数。本发明的另一方案提高了获取玉米穗的穗丝数量数据的速度。可将该数据有利地用于多种目的，包括但不限于，(a)更早更好地选择显示期望的表现型或基因型的植株，(b)为研发目的理解植株的生物过程，或者(c)计划与植株种子生产相关的商业管理。本发明的另一方案涉及以使用图像分析方法可以计数的形式来获得多种细长丝条或者片段的定量样本。在玉米穗丝的情况中，本发明的又一方案包括在对穗非不利影响的情况下获得样本的能力。本发明的又一方案包括用于确定相对小的、细长片段的高吞吐量方法。获取片段的定量的切屑物样本并使其悬浮在流体中。将样本隔离放置，且使得包括样本的切屑物大体均勻地分布在平面上。用预编程的图像测量或分析软件分析基本垂直于平面获得的并在平面上或平面附件聚焦的图像，以识别并对图像中的表示样本切屑物的每个对象计数。可以高效且连续地获取并存储每个样本的图像。图像分析也可以高效地进行。对比现有方法，这可以导致多样本的相对高的吞吐量。本发明的又一方案包括，基于片段切屑物样本的量化，对大量片段进行精确可靠的量化，然后使用该量化。该应用可以仅仅是统计有效的或者可接受的计数，或者可以用于描绘样本、样本提取来源的片段的特征或者与片段或样本有关的一些其它参数。例如，关于玉米穗，可以将穗计数量化用于，尤其是选择自植株育种、基因改进、作物生产、转基因处理效果评估中的目的，或者用于识别与穗丝生产或穗生长有关的分子标记。使用穗丝量化的又一方案是评定穗丝生产培养和环境因素的影响。还可以用于为商业或者研究目的识别具有期望特性或者特征的一种植株或者多种植株。例如本发明允许研究者快速地从单个玉米植株提取穗丝并且定量地确定每穗的穗丝数量。可以将该信息用于确定亲系的生产潜力，这可以用于确定在商业种子产品中亲系的应用。可以将该信息用作表现型信息以便寻找关于穗丝产品的分子标记。可以将该方法用于其它产生许多细长组织的植株。该方法可以适于以相对高的吞吐量且至少半自动地对其它许多丝条或者细长片段的数量进行量化，以用于不同的用途。下面的说明将参考附图进行。所述附图用于补充该说明书并且构成了说明书的一部分。1.切削工具图IA是适于切割玉米穗丝束以从每条穗丝获得基本上相等样本的切削工具的示例性实施方式的部分简化示意图，该切削工具还可以用于从植株和非植物的其它细长丝条或者片段获得一系列切屑物样本；图IB是显示为打开位置的图IA的整体切削工具的透视图；图IC是进入生长中玉米植株穗丝束相关主要位置的图IB的工具透视图；图ID是将穗丝束下移至外皮上准备取样的图IB中示出的工具的透视图；图IE和图IF是取样前后且示出植株上剩余穗丝束的透视图；2.实施方式一——通过对穗丝的切屑物进行成像进行计数图2是可放置图IE中获得的样本的容器的示意图；图3A是放置图2中的样本的培养皿示意图，用于根据本发明第一示例性实施方法对样本成像；图;3B是图3A的简化俯视图，示出如何分布样本片段以用于成像；图3C是实际的培养皿和图:3B的透视图样本的图片；图4是用于获得图3C中示出的图像类型的成像台(imagingstation)的简化示意图；图5是用于获得图3C图像的方法示意图；图6是图3C图像类型的简化示意图，示出了根据图像自动对样本片段计数的方法；图7是计算机屏幕显示，示出了样本图像和样本片段的自动计数结果；图8是由之前附图描述的计数方法流程图；3.实施方式二——检测器对穗丝切屑物计数如下图9是根据本发明第二实施方式的穗丝样本自动计数方法的示意图；图10是根据图9原型示意图11是根据第二示例性实施方式的可选方法的图片；图12A-E是图10或者11的元件的分离视图；4.实施方式三——对成束的穗丝的横截面计数图13放大地示出了本发明第三可选实施方式的一部分，其中获得被切割的玉米穗丝束的横截面并手工计数每条穗丝，或者获得关于横截面的图像；图14A示出制作准备用于切割的穗丝样本束的方法；图14B是图14A的穗丝束样本束一端的端面视图；图14C示出图13方法的可选步骤，也就是将暴露的横截面着色以试图从该束获得各个穗丝的更好对比。5.穗丝计数相关性和用法的示例图15是示出对第一实施方式的成像分析计数精确度的曲线图；图16是对第二实施方式的流体流动和照片检测器穗丝计数描述穗丝计数精确度的表格；图17是描述基因型之间穗丝数量差异并示出一定时间的穗丝生长曲线的曲线图。具体实施例方式A.综述为了更好地理解本发明，下面将详细地描述示例性实施方式。应理解这些实施方式并不是可以体现本发明的唯一方法，而是用来对本发明的原理和特性进行示例和非限制性的说明。B.背景出于简化目的，本文主要讨论对玉米穗丝的计数的示例性实施方式。应该理解，可以将这些实施方式和本发明应用于其它对象的计数，包括但不限于植株的其它相对小且细长的多丝条或者片段，或者其它与植株相关或无关的相对小且细长的丝条或者对象。C.概括示例性方法图8概括了从“资源(source)”提取样本的方法(一般性地称作方法90)。在该概括方法中，“资源”用于表示起初或原始收集的多个片段或对象束。这些片段或者物体可以是相对小直径的细长丝条。一个示例是植株穗丝。其它植株示例是芹菜纤维或丝条。非限定性的非植物示例是光纤、头发、线状物、纤维、细丝、线团、电线、钢筋束、细绳、昆虫或者昆虫的部分、卵、花粉粒、花粉管等等。图8的方法90还概括对初始收集的或原始的束进行量化的方法。1.样本采集对初始大量未量化的片段进行标识(图8，步骤91)，例如，为初始束给定唯一的标识符，以保持对该初始束的跟踪，并使其各自的片段计数与该唯一标识符相关联。工人预先能够识别束，并保持束标识与从初始束收集的样本的相关性。可以记下该唯一标识符，将该唯一标识符记载在相关的标签或标记上、记录在手提电脑或其他装置中或其他指定的地方。利用一种收集方法切割或分离、移除一部分初始束(图8，步骤92)。这些被分离的初始束的片段包括束的样本。可以将样本放置在分离的贴标签的容器内(图8，步骤9以便使每个样本与其它样本分离并提供样本的标识。该标签可以包括条形码，或者可以是从中得到初始束特性或得到唯一标识符的其它标记。标签上的信息可以是机读的。如果不使用容器，可以使用保持初始束和样本特性相关性的其它方法。可以使用各种方法获得样本。某些方法将在之后的更具体示例性实施方法中讨论。在一些示例中，从整个束获得的其中一部分趋于是分离的，并且保持了束中每根丝条中具有基本相似长度的切割部分。理想地，从束获得的切割部分包括束中每个丝条的切割部分(切屑物或切片)。如果初始束的丝条数量的样本不确切，则需要确定数量。因此，方法90概括了被公开用于提供相对快速地统计离散的、尺寸相似的、组成初始束的样本的方法。2.量化—旦进行采集，方法90还提供用于获得样本的统计上可接受的量化的方法。应注意的是，只要量化地获得了样本，不但可以将该量化方法用于步骤91-93的采集方法，而且还可以将该量化方法用于由其它方法采集的样本。通过量化地获得意味着样本能够在与初始束的实际丝条数量的统计上可接受的误差范围内进行测量。可以针对给定的应用选择误差范围。理想地，误差范围是确切的。但是对于许多目的而言，误差范围在+/-2%到5%是足够的。甚至在某些情况中，可以接受更大的误差范围。通过对切屑物或者切片进行分布使其构成通常位于平面中的样本来进行量化(图8，步骤％)。样本标识符可以先被读取、存储然后与样本结合(步骤94)。获取分布的样本的图像(步骤96)。在方法90中，样本的分布可选择地在隔离隔间或者容器中。可以对容器底部的全部面积或者预定的子面积成像。在任何情况中，在平面上相对均勻的样本分布都允许单个切屑物或者切片定量计数。在一个示例中，可选择地使样本悬浮在流体中以有助于在平面上均勻分布。在许多情况中，趋于通过重力使样本的切屑物或者切片沉在容器的底部，从而沉在平面中。而且，它们趋于以平行于平面的纵轴沉淀，使得平面的图像可以获取每个切屑物的长度尺寸。通常，流体不会对切屑物造成破坏或者改变尺寸(至少彼此不互相关联)。流体还可用于长期存储样本。通过使用成像台(例如基于具有数字成像功能的相机)可以获得样本图像或者与其有关的已知区域。大量的商用的成像系统都可以使用。成像台还可以是定制的。可以使用与图像兼容的图像分析软件来识别(步骤97)图像中什么看起来是样本单个切屑物或者切片并进行计数(步骤98)，无关的碎片或者不相干物质可能会混到样本中或者出现在图像中。通过对成像分析软件的适合的编程，可以将一个或者多个尺寸或者其它标准确定为表示切屑物，并且图像分析软件将识别在图像中适合编程的尺寸或者标准的物体。通过软件可自动地计数经确认的被识别的对象。该数值将是丝条初始束的全部丝条的确定数量。例如，计数的数值可以被存储在与样品标识相关的数据库(步骤99)中，也可以与样本出处的初始束的标识相互关联。因此，方法90的程序可以从大量丝条或者片段的初始束中获取丝条或者片段的统计上可接受的量化。如本领域技术人员可以理解的，至少与手工计数相比，即使是大量样本，也可十分快速地进行量化。如图8中所示的，可以对随后的样本重复步骤91-99。因此，可以以相对高的吞吐量完成量化并具有良好的统计精确度，然后以逐个样本为基础进行存储以便进一步的使用。而且，可以管理样本收集方法以快速且有效地连续提取大量样本并且将它们准备用于成像和计数。由于是方便的或可取的，因此在样本取样后或后期，可以对成像和/或计数进行纠正。例如，对于给定的应用而言以下方式被认为是更有效的，即，在第一时段内获得多个样本，将样本存储在贴标签的小瓶上，然后随后或在后期进行成像并分析图像。可选地，对于应用而言以下方式可以是优选的，即，获得样本并随后对它们成像，但延期至以后进行图像分析。作为示例，以下方式可以认为是时间利用更有效的，对大量样本成像，然后随后成批处理图像。因此方法90具有良好的灵活性以便人力和设备资源的使用和分配。方法90也被认为是可重复且可再生的，因此具有高度可靠性。可以增加诸如在实验室中已知的流体处理系统，以自动增加流体并从小瓶或者容器中提取样本，并将悬浮的样本移到已知容量的流体中以用于图像分析。该流体处理系统可以是商用的并且可以编程以用于实施需要的功能。这可以增加该方法的效率。方法90可用于确定初始束中丝条或片段的数量或者初始束中的切片样本的数量。可以将获得的信息用于其它目的。3.样本组织和存储如本领域技术人可以理解的，可以有许多有效且有序地处理并组织方法90中获得的大量样本的方法。一种在实验室中广泛使用的方法是使用迷你瓶、闪烁瓶或者其它用于容纳和分离单个样本的容器。另一种方法使用多井托盘，可便于隔离、存储和保持多样本特性的相互关系。可以将标签(例如诸如条形码等机器可读的)置于托盘或者其它容器上，并且标签可包括鉴定关于容器和容器中样本的信息。每个容器的容量可以足够大以便容纳悬浮在流体中的整个样本。例如在本领域中已知的自动流体处理系统或者是手工操作移液管都可用于将液态悬浮样本移除到成像系统或者从成像系统中移除，同时保持相关性以鉴定每个样本的信息。4.计数的应用可以理解，将样本或一组样本中每个样本的获得的量化计数可以应用于多种用途。一些示例包括如下。存在这样一些情况，其中检查丝条束是否被制造或组合成具有同样数目的丝条是有益处的。光纤束需要具有同样数目的丝条，使得对于束上的光调制通信而言，每根光纤都具有同样数目的通道或者容量。方法90可用于至少随机抽查束，以检验每个组合束具有在误差范围内的同样数目的丝条。如果测量出数值超出误差范围，则该方法可以产生警报或者预警。同样的方法可用于检查对封装的细丝、线缆等的计数是否一致。该方法可以将束的计数保持在误差范围内以进行质量控制。另一方面，存在一些情况，其中测量在束之间的丝条数目是否具有差异是有益处的。如上所述，示例可以是玉米穗丝。方法90可用于识别表现出预示更高产量的期望穗丝数量的玉米基因型。之后描述使用和应用穗丝计数的其它示例。因此，以上描述的总体方法阐述了本
技术领域：
中确定的需要。以下是可执行该整体方法各方案的具体的示例性的、非限定性类型的示例。D.具体示例性实施方式一-图像分析1.概述称为实施方式一的第一示例性实施方式，获得玉米穗的每根穗丝的短小切段或者切屑物，将它们基本上分布在平面中，对平面成像，且使用图像识别软件以识别表示单根穗丝片段图像的部分，并自动地对所有这种切段计数。按照结果与穗丝切段来源的穗的身份(或其品种或基因类型)相关的方式存储结果，因此允许对各种应用进行信息的电脑化数据处理。该实施方式允许在实质上不影响植株持续发育的情况下，从活的玉米上剥除小穗丝样本。由于穗丝持续生长，可以按照常规的方式使穗授粉并成熟。当需要时(例如在样本收集后或者后期相对快速地)实施计数。可以获得来自大量植株的样本，并且将样本带到计数台以进行有效的处理。这可以显著减少穗丝计数的时间，且计数精确度在可接受范围内。而且，该实施方式允许在第一时间获得穗丝样本，而后从同意植株上获得并对一个或者多个后续的样本(例如如果在采样时间中穗丝充分地生长)计数。例如，可以将其用于跟踪在一定时间内同样植株的穗丝生长或出现参数。a)切削工具图IA-E描述可从植株获取样本的切削工具10。两个刀片14和16(单个斜边15)彼此相隔固定的距离以平行的方向被夹持在工具10的一个臂18(图IB中的上臂)的刀架12中。第二臂22包括具有半圆形切口20的延伸部。切口21大体上限定具有适合刀片14/16之间的宽度的弧形凹面钝边。臂14/16可枢轴地附接(参照附图标记到邻近的端部(图1B)。在通常打开的位置(图1B)，钝边21远离刀片。通常通过弹性件沈(例如图1C)或者其它偏置装置可以使臂18/22保持分离。当工具臂18/22打开时，通过切口21可以定位紧拉的穗丝束38以准备用于取样(图1A、1C和1D)。工人将工具臂18/22挤压到一起后，两把刀片14/16剪断穗丝束38。某种程度上，切口21可用作砧板。当刀片14/16剪断穗丝时，钝边21是穗丝束接触的表面。如图IA中所示，因为刀片14/16可移动至切口21相对的边并通过切口21相对的边，所以刀片14/16可完全剪断穗丝束38。一旦完成切削冲程，工人释放工具10的臂18/22使其返回到正常打开位置。这将保持植株上穗丝束38的剩余部分完整以继续生长(图1F)。通过紧固件或者钳位作用，可以将刀片可移除地安装到工具10的头部12中。与有角的切削或者撕裂或者压缩穗丝相反，按照与穗丝大约90度角使用锋利的单个倾斜刀片的边缘15旨在产生通过穗丝的精确切削。通过平行且相隔一段距离的刀片14/16从穗丝束38切割的穗丝的短切段或者切屑物40可以由工人收集或者用工具10采集。在工具10的该实施方式中，小瓶30可连接到工具10的头部12的侧面，并且可将工具10翻转并喷洒流体(例如乙醇)以将穗丝冲入小瓶30(图1D)，从而使被采集到头部12内的切段或者切屑物40通过重力和/或工具10的操作落进小瓶30中。小瓶30可以具有外部带螺纹的开放端部，该外部带螺纹的开放端部可以匹配地穿入和穿出臂18的头部12的侧面中互补的内部带螺纹的孔28。孔28与刀片14和16之间的空间联通。通过将切口21移向刀片14/16的后部，可以基本上推出切屑物40或者将切屑物40移向刀片14和16的后部。当将小瓶30安装在头部12上，在工具10随小瓶30转动指向下方时，切屑物向与倾斜切割边缘15相反的方向运动进入头部12的腔且离开开口观进入小瓶30。还可以使用其它的连接方法和其它容器。如图IA-F所示的，样本切屑物40是从靠近穗丝束或者束38的末梢端的同样位置切割的长度相似的穗丝部分。这使玉米穗36上穗丝束38的邻近部分完整，可以持续生长并且可以被授粉。因此，该抽样对穗是非破坏性的，且就植株而言实质上不影响植株的生长或者健康，或者在植株处理中穗丝的机能。可以将条形码或者其它标签置于小瓶(例如20毫升体积容量)上以使其植株身份与样本(切屑物40)对应。因此可以理解在非实质影响植株持续生长能力的情况下，工具可从植株的一根或者多根穗丝束38分离相对均勻的、短的切段或者切屑物40(例如大约1.5mm到2mm的长度-刀片14和16之间的宽度)。在该示例中，锋利的、单独的倾斜刀片14/16间隔大约2mm，且工具剪刀的动作获取到了精确切削的切段、切片或者切屑物40。避免了穗丝的粉碎或者撕裂。因此对于植株穗丝束38的每根穗丝而言，工具10促进了基本上等尺寸的切段40的回收。在该示例中，在穗36外壳尖端上获取大于3cm的样本以便留下待自然授粉的穗丝束38。在一定时期内，穗丝从每个穗小花向顶部露头(穗到尖端的基部)。允许足够时间使穗丝露头对估算总体穗数量是重要的。可以使用其它方法和工具以获得全部大约同样长度的切屑物40的样本。对于获得相对短但均勻的切屑物，工具10使一步式的、相对精确且快速的方法变得容易。b)小瓶如上所述，可以将植株穗丝的样本切段40收集在包括机读标签34(例如美国伊利诺州弗农希尔斯的斑马技术(ZebraTechnologies)公司的105S1打印机创建的1”X1.25”的白热转换标签)的小瓶30或者其它容器中(例如美国新泽西的米尔威尔的麦科学产品(WheatonScienceProducts)公司的具有螺帽的高密度聚乙烯流体闪烁瓶)。在该实施方法中，小瓶30包括用于密封小瓶30的可移除帽32(图2)。而且，一但样本切段40在小瓶30中，在该示例中，小瓶30至少部分地装有流体46(例如乙醇)以保存样本(如果需要，则持续数月)，并且紧固帽32。流体46可以是美国宾夕法尼亚州西切斯特的VWR国际hternational(VffR国际)公司的适合的无水的、变性(SDA成分3A)试药等级的乙醇。乙醇用于保持样本很少降解或者没有降解。还可以使用其它保存用流体。即使计数台远离植株，这也允许样本40基本上被封装并且被保护以运输到计数台。工人可以继续工作以便获得下一样本40，且将其封装该样本的小瓶30等等。也可以使用具有流体或不具有流体的、其它用于隔离和/或存储样本的容器或者方法。c)培养皿之后描述在计数或者成像台50处可以将小瓶30的物质清空到培养皿42(图3A)。小心地将穗丝切屑物40从小瓶30排出。选择培养皿42的尺寸以便乙醇46在培养皿42(例如使VWR国际的结晶盘(10mmX50mm))中只有相对薄的层(例如大约1/4”和25毫升)。更大容量的流体46可以用于试图获得切屑物40更多的散布，但通常用极小量的流体46试图在粗糙平面中散布切屑物40。避免重叠或者接触穗丝是困难的或不可能的。为以下讨论的图像分析系统70的图像分析软件80存入专用计算机文稿编排程序，以估算重叠或者接触群组的穗丝数量。可以摇动盘42以尽可能地促进样本切段40均勻地分布在盘42底部表面的薄乙醇层中。而且，可以手工移除碎片(例如碎壳、其它碎块和昆虫)。如图;3B和图3C所示的，适当准备的培养皿42使切段或者切屑物40相当好地分布在整个平面。如图3B和图3C所示的，放置并分布的切屑物40将露出自身，使得它们的长度通常平行于盘42底部的平面。在成像期间，可以应用其它具有或不具有流体的用于保持样本的容器或者载体。d)成像台培养皿42(或者相似容器)通常垂直于成像台50中照相机M的光轴55、并沿着成像台50中照相机M的光轴55放置(图4)。这可以通过以下方式实现，即，在台架52上做标记；或者通过使用接收容器或者夹具，其中，在接收容器或者夹具中，盘42适于确保每个盘42以相对于相机M的相同位置或其视场中的相同位置成像。成像台50(例如美国密歇根州的生物图像阿伯(BioImaghArmArbor)公司的外表成像台(Visage)IlO)实质上是暗室或者机壳56。可将内壁(图4)涂漆或者覆盖黑色物以限制反射。照相机M悬挂在台架52之上使得整个培养皿42在照相机视场内。当在台架52上的适当位置时，将照相机M基本聚焦于培养皿42底表面的平面上。可以将灯箱或者发散光源60(例如，VWR的编号为21475-460的台式白光透照器)侧向(大约15cm)安装或者放置在台架52的一边。灯箱60产生(a)足够的光以获得图像中切屑物40和背景之间的足够对比度，但是(b)来自的窗口62的很多发散光侧向通过台架52以限制反射或者眩光，并且也优化了对比度。光可以是稳态的或者频闪的。可以使用使破坏图像的明晰和对比度的眩光和其它发光效应最小化的方法。这种方法在成像和摄影
技术领域：
中是常规的且众所周知的。当成像需要消除或者减少环境灯光时，可以设置暗罩或者暗门(图中未示出)或者使暗罩或者暗门移动遮住外壳56的前开口。作为本领域技术人员可以理解的，具体的成像台50及其元件可以根据需要和期望而改变。在具体的示例性实施方式中，照相机M是数码相机，更具体地是C⑶成像器。例如具有E系列25mm的12.5(179611)尼康镜头、光圈光学接口适配器和蒂芬(Tiffen)偏光镜(52mm)的改进型(MPColor5.1兆像素照相机)(美国马里兰州贝赛斯达东_西高速公路的媒体控制公司(MediaCybernetics,Inc,4340East-ffestHwy,Suite400，Bethesda，MDUSA))。另一示例是固定焦距的尼康AFNilckor手动聚焦镜头装置的黑白(12比特灰度)Quantix6303ECCD数码相机(来自美国亚利桑那州的土桑市的光度计(Photometries))。也可以使用其它用于获得可由图像分析软件进行分析的图像的装置。一个示例是数字扫描仪。可以获取每个盘42的3个复制图像以便提高精确度(3次计数值可以求平均或者统计使用)。可以将计数值输入软件应用程序(例如微软的Excel)以便进一步统计分析。可以使用增加目标样本和背景(或者非相关物质)之间对比度的其它或者附加方法。例如，一种选择是选择具有使切屑物40产生荧光(天然的或者粘附到切屑物的染料)波长的光源以增加对比度。另一个选择是增加适于识别切屑物40中基因存在的着色剂，如果是植株或动物材料，可以通过基于某种光能照明的荧光(识别染色法)。又一特别用于植株穗丝的选择是使用用于花粉或者花粉管的特别染色，使得图像可以识别在成像时发生了多少受精。当然，也可以应用其它方法和元件。还注意到如果在小瓶30(或者其它初始容器或者载体)中的发光对比度和切屑物40分布是充分的，使得图像在足够数量的切屑物40和背景之间进行区分，则从图2的小瓶30转换到图3A的盘42(或者在其它容器或者载体之间转换)不是必需的。e)计算机能够处理的系统计算机(例如PC72)包括图像识别或者分析软件80(例如商用的MediaCyberneticsInc(媒体控制公司)的“ImageProPlus6.2”软件)。该软件特别适用于对数字图像中对象的几何测量。该软件允许用户通过特别应用文稿编排程序定制程序设计。该软件还允许以多种方法存储和处理其产生的分析信息。该软件与许多近期的(如果不是最近期的)典型PC型计算机兼容。在该示例中，可以将PC72连接(通过合适的接口74)到成像台50的照相机M，以便根据PC72的命令操作照相机M。PC72还可以被连接(通过合适的接口78)到条形码阅读器76(具有相关的软件)以便阅读小瓶30(或者培养皿)的条形码信息，并使之与同一样本的图像相互关联。在该示例中，计算机72还包括电子制表软件程序82(例如微软的Excel)，以显示和存储数据和图像。关于“ImagePro”图像分析软件80的细节可以参见www.mediacy.com。在通过图1-3的工具10获得的玉米穗丝切屑物40的情况中，可以将软件80编程以识别图像中尺寸大约2mm长的穗丝切段的对象。在分析之前，可以将软件80编程以除去图像的不相关部分。例如，可以将照相机M的视场设置成足够大以便捕获盘42的平面图(例如图:3B和C)的每个部分(从而不可能漏掉切屑物40)。然而，这可能使盘42外的部分区域进入图像。软件80中的工具用于将盘42图像周缘外的任何分析的事物除去。将软件80编程用于按照如下方式计数穗丝切屑物40执行的分析程序包括1)自动识别培养皿并且设置排除边缘和盘外区域的感兴趣区域，幻应用滤波器改善穗丝与背景的对比度，幻识别图像中的对象且测量对象在像素中的面积，4)基于与单根穗丝的估算面积相关的区域，将对象分类成16个“小格(bin)”或者类(因此允许估算接触的成团的穗丝或者重叠的穗丝的数量)，幻每个“小格”中的对象的数量乘以穗丝的数量，其中穗丝的数量与为每个小格提供总穗丝数值的多个“小格”中的每个小格相关。将每个小格的总穗丝数量累积以达到全部二进制的总穗丝数，且因此得到培养皿中的全部样本。该程序进行与图像本身相关的分析并且因此进行自校准，从而使得图像尺寸的改变或者培养皿位置的改变不会产生影响。图7是用于图像分析系统70的示例性计算机屏幕显示图形用户界面。其示出穗丝切屑物计数程序。显示屏的左上象限是培养皿42中的切屑物40的捕获图像。注意到一些切屑物是与其它切屑物分离，但是大多数是接触的或者重叠的。对于该实施方式，右下象限显示16个小格或者类(左手边标注“CLASS(类)”的垂直列)。通过总面积的范围限定每个小格或者类。在该示例中，总面积是在图7左上象限图像中的邻接的对象占据的像素数量。在图7的示例中，通过软件80识别在类1的像素区域范围内的383个对象(见标注"OBJECTS(物体)”的垂直列)。这些对象中每个的平均面积是356.78067个像素(见标注"MEANAREA(平均面积)”的垂直列)。相反，在表示为类2区域的区域范围内识别出42个对象。平均面积是720.71429个像素(大概为类1平均面积的两倍)。在类3区域中识别出12个对象(平均面积为1084.6666个像素，大概为类1平均面积的3倍)。在类4和类5中分别识别出4个对象(平均面积大概分别为类1平均面积的4倍和5倍)。在类6和类7中没有识别出对象，但是在类8中识别到一个对象，其面积大概为类1平均面积的8倍。图7的右上象限示出怎样计算最终的穗丝数量。将类1中的对象假设为单个的穗丝切屑物。因此，假设383个穗丝切屑物放置在图7的右上象限中表的垂直列“F”中。识别到的对象具有大概为类1双倍的平均面积(换句话说，在一定程度上，将类2的对象假设为接触或者重叠的两个穗丝切屑物)。因此，将在类2中识别到的42个对象乘以2以便给出类2的估算的84个完整穗丝切屑物。将该关系连续地用于剩余的类。大概为类1平均面积3倍的类3的对象乘以3以得到类3的估算的36个单独切屑物。通过乘以4得到类4的识别出的对象且乘以5得到类5的对象以得到类4和类5的16和20个穗丝切屑物的估算的总数。最终，类8中的一个识别出的对象(假设大约8个单独的切屑物组成类8图像中识别出的成团或者成簇的切屑物)乘以8，从而估算出类8的8个单独切屑物。在该示例M7中，将在图像7右上象限的列“F”中估算出的单个切屑物中的每个加到一起以得到“穗丝总数”的估算。如以上所述的，该方法允许编程者预设计用于识别图像中通常称为对象的标准。这些对象包括单个切屑物40或者多个切屑物40(相邻的、邻接的、重叠的、成团或者成簇的)。不必进行单个切屑物40的初始确定或者分离。而且，编程者可以使用滤波范围以避免计数图像中的非穗丝对象，例如盘或者叶子片段的光反射等。基于每个对象的总面积(在该示例中，基于对象大体上占据的像素数)，将对象分类或者分成小格，然后允许通过将单个切屑物40的平均面积与每个识别对象的面积进行比较来估算组成对象的切屑物40的数量。如果面积在指定为第一类或者小格1的面积范围内，则假设其为单个的切屑物40。然后将通过适合类1面积识别的对象数量用于为该类计数切屑物的相同数量。如图7中所示，基于计算的面积，将落入小格或者类2总面积范围内的识别的对象假设为多于一个切屑物但少于三个切屑物。换句话说，假设在类2中的对象是两个单独的切屑物40。将在类2中识别的对象数乘以2以得到针对类2计数的单根穗丝的总数。该程序以相似的方式连续用于类3等。将针对类识别的对象数乘以类数以得到针对类中每个对象的总穗丝数。在图6中以很简化的形式说明以上内容。软件80识别图6中标注“对象”、“1”、“2”、“3”、“4”和“5”的对象。这基于对象1-5与背景的对比。还识别图6中标注为“叶片”和“未知”的对象，但是当其不适合单个切屑物40或者成团或成簇切屑物40的预编程标准(例如尺寸、形状、尺寸或者颜色)时则忽略它们。软件80自动地对适合测试(在可接受的编程范围内)的对象计数，并忽视其它的(例如“未知”或者“叶片”)。因此，当自动获得穗丝样本切段40时，通过软件30识别数量。图6包括5个识别的对象(1-5)，但是包括7个估算的单个穗丝切屑物(1_7)。根据至少3个像素的至少一个轴内的像素范围，对象1、2和4是单个的穗丝切屑物，具有在6到10个像素范围内的总像素面积。在另一方面，对象3和5分别具有16和18个像素的面积，大于且近似为对象1-3双倍。因为对象3和5中的每个都满足被认为是由穗丝切屑物组成的准则，因此由于更大的总面积而将对象3和5分类到比对象1-3更高的类中。基于编程，由于大体上是对象1、3和5像素面积的双倍，因此将被分类到类2中。当对总穗丝切屑物计数时，将对象3和5都考虑为由两个单个穗丝切屑物组成的，因此针对图6中全部对象1-5的总穗丝切屑物的总数是7而不是5。应注意，该计数趋于包括彼此均勻重叠的穗丝。即使切屑物3和5的面积可能不确切是对象1、2和4面积的双倍，但它们也在表示2个切屑物范围的面积内，该两个切屑物或者接触、重叠，或者在图像中识别为单个的对象。如图6中所示的，还注意到存在单个切屑物对象的某些面积范围。因此，将类1对象像素面积的范围用作全部类的案例。基于应用，利用更简单的宽度和/或长度以从穗丝对象分离非穗丝可以更实用和/或精确。可以利用对象周缘的粗糙度、圆度、颜色的标准来微调分辨率。可以理解，图像可以是彩色的、黑白的，假彩色的或者是用对于特殊光波长敏感的传感器采集的。可以由不依赖用于成像的可使光的传感装置(例如3维激光器、声纳或者雷达扫描仪)来管理成像。可以将软件80编程以在计算机72上显示照相机图像和/或软件80的图像分析报告(见图7的示例)。可以理解，可以将软件80编程以具有多种功能。如图7所示的，"ImageProPlus”软件允许相当复杂的功能。如之前所述的，一是使软件80将不同的识别测量的尺寸或者形状放入不同的类(直到图7中的16)中。这16个类表示增大面积的对象，因此可表示增加的穗丝簇的数目。对穗丝对象计数之前，通过滤波器将非穗丝对象去除。颜色编码允许操作者确认小格实际上表示的穗丝的正确数量(例如操作者可以容易地通过眼睛区别2根穗丝与3根穗丝的簇，并且可以确认小格方法可靠地对簇进行了合适地颜色编码)。类可以是PC72显示屏中编码的颜色(例如根据图7图片中切屑物的颜色，不同的颜色可以与图7中右下表左栏中的每条线(或类)相关)。最佳地，用户可以复查显示的图像(和/或培养皿42中的实际样本)，并确定是否应该对图像中的某些对象计数，以给出精确性和灵活性的增加的水平。用户还可以对后加工中的计数或者其它数据进行其它改变或者调整。例如，在识别或者计数对象之前，用户可以观察图像并去除图像中不明确相关的对象。在图7中，程序的右下面板表示对像的数目，所述对象为单个的(383)、双倍的(两个重叠的穗丝)0、三倍的(3个重叠穗丝)(1等，且将其转换到Excel(右上面板)，其中每个类中的对象数乘以类数，然后相加则得到每个样本计数的总穗丝值(参见383+84+36+16+20=547)。可以理解，对用户而言，成像软件是很灵活的且可编程的，以便获得根据以上描述的期望的差异。根据需要或者期望和/或经验测试可对编程和调节软件，以达到可接受水平的计数精确度。进一步可以理解，可以由用户手工地进行用于成像的某些准备。例如，用户可以视觉地检查培养皿42并且手工地去除任何碎片或者非穗丝物质。附加地或者可以选地，可以在图像采集后从该图像去除不相干的对象。用户也可以摇动、搅拌或者扰动培养皿42以便促进穗丝切屑物40的分离和分配。2.操作示例性实施方式一操作的示例性程序如下表4.1穗丝计数程序的概括1.制定时间表和贴标签当作物有膝盖高时，一排植株的边缘良好的部分标识10个连续的植株。使用量尺以确定植株在该排的特定长度内。在测试区域内给第一和最后的植株加标签，以便用于后期识别鉴定的植株。对整个图区(plot)记录50%穗丝的日期并且随后(3-5天)对图区制定时间表以采样75-100的成长度单元(“GDU”)。GDU是植株科学中众所周知的根据温度增长描述时间的参数，。预先对每个采样的植株准备小瓶标签。2.用于现场准备的设备图IA-E的切削工具10。具有螺丝帽的标注有IOml的闪烁瓶30(图幻的托盘，以及子弹带形架，以保持用于5个小区的小瓶。护板，和IL瓶装的乙醇以及手泵。3.现场程序在进入小区前，以采样顺序装载具有贴标签小瓶30的子弹带形架。从小区中的第一个贴标签的植株开始。视觉观察穗丝束。如果穗丝数小于50，通过手计数，将穗丝数目记录在小瓶标签上并且去掉非实质样本。这可以比试图利用很少穗丝收集穗丝样本更快且更精确。如果穗丝数目大于50，将小瓶30附接在切削工具10上，朝上持握小瓶30，梳理出穗丝以得到在外皮尖端上露出的穗丝1-1.5厘米的干净部分，将切削工具10放置在露出的穗丝上，同时另一只手持握穗丝束38。当用一只手轻拉穗丝时，挤压切削工具10的手柄直到切割了全部穗丝片段。不完全闭合切削工具10。(参见图1A-E)。丢弃穗丝束38的末梢、已分离的部分。在整个程序期间，小瓶开口应该保持朝上以防止因疏忽造成的样本丢失。通过挤压完全闭合切削工具10的手柄18/22，从切割机构10上清理穗丝切段40。通过小瓶30上的孔33(图1B)重复喷射乙醇，并且利用10毫升70%的乙醇将样本40冲入小瓶30。旋开小瓶，(用紧固帽32)盖紧，并且摇动以使切割穗丝40的团散开。转移到该行中的下一个植株并且重复。当子弹带形架中的全部样本小瓶30已经装满时，将小瓶30转移到闪烁瓶存储托盘(未示出)且重新装载具有下一套小瓶30的子弹带形架。在该天结束时，清洗切削工具10，检查小瓶30包含其体积至少1/3的乙醇，拧紧小瓶盖32，且在计数之前使带帽的小瓶30/32—直存储在冷藏、封闭的区域。4.需要的实验室设备安装在漆成黑色或者深蓝色的胶合板垫板或者台架52上的固定长焦聚CCD照相机54，以及具有14毫米侧边的7厘米直径玻璃培养皿42；用柔光罩(diffusercloth)覆盖的透射器侧光源60。全部安装在通风橱56中。装配了Excel82、ImagePro80、常用设计软件脚本的PC72;条码扫描仪76。精密镊子(fine-nosedtweezer)和乙醇冲洗瓶。5.计数穗丝步骤将穗丝样本40清空入培养皿42中，并且以约10毫升乙醇漂洗小瓶30。扫描样本小瓶30上的条码，并且保留小瓶30以用于清洗，除去标签且重复利用。用镊子从样本40去除任何非穗丝对象(例如外皮尖、花药、昆虫)，搅拌以使团分散，而后将培养皿40放在照相机M下的垫板52上。使样本40保持5秒钟。初始化PC72上的常用设计软件脚本以对样本40成像，将图像存储在PC72的硬盘驱动器中，自动地将重叠穗丝片段小格化，而后将小格信息存储在Excel82中。检查PC72显示屏的图像的焦距以及适当性。如果需要则重复图像采集步骤。移去培养皿42并仔细地用乙醇漂洗。对新样本重复以上步骤。在测量周期结束时，通过使用合适的Excel82宏指令，将样本编码和穗丝数目转换成主文件。可以看到，实施方式一允许从成长中的植株获得穗丝切屑物样本40并且将样本带到集中的计数场所。使每个样本40与其来源的植株相互关联。在计数场所中可以将这种相关性快速地输入计算机72，例如通过快速地阅读样本容器30的机器可读标签。操作人员可以在成像室50中准备和放置样本40，采集图像，并使软件80自动地识别和计算切屑物数量，且因此产生植株的穗丝数，并将该穗丝数自动地存储在与其来源植株有关(和/或如同系繁殖的或杂交的种类类型相关的信息，实验的小区位置等等)的电子数据表或者数据库中。已经证明了用于玉米穗丝的这种方法节省时间(一个估算是大约10倍的改进，例如从一天50-60穗或者样本改进为500-600穗或者样本)。从正在生长中的植株可以获得不限定数量的样本并且带到成像地点。操作人员可以尽可能快地连续地对样本成像。可以立即或随后计数处理。例如，可以先获得10000个样本的图像。随后，所述10000个图像的图像分析(为获得每个图像的穗丝数)可以在无需人工操作员的情况下以批量处理的模式在不同的地方进行。已经证明计数的精确度在可接受的范围内。操作员检查以及后置处理可以增加精确度水平。已经证明能够实现从每穗平均700穗丝中检测误差为10%的穗丝数的预期目标。精确度表明至少与人工手动计数一样好。可接受的精确度可以是，例如，每个样本平均700穗丝的实际数量的10%以内。通过实施例一已经获得以下的结果。总测量系统差异为0.33%或者认为可接受的)，即规格重复性和操作者再生产分别贡献0.23%和0.10%的差异。这可以通过使用3个重复图像分析的平均数而改善。图15表示(对于η=3个样本)由实施方式一获得的数量和手工计数之间的好的相关性(R2=0.99的线性回归分析)。对于平行测定的穗丝平均数2%与手工平均数3%实际误差的相对标准偏差(RSD)在25-700穗丝范围内。在可接受精确度的情况下，相对于手工计数的速度约快10倍。因此，可以获得相对高水平的样本吞吐量。可以理解，可以附加自动化设备。通过机器人、传送带或者其它可编程执行机构，使装有样本的容器(无论小瓶、培养皿或者其它)清空以准备为样本成像。这些类型的部件可以是互商用的或者为该目的定制的。有许多商用的成像装置和图像分析系统。一些甚至可以通过很小的改进或者不加改就可使用。这些装置允许高效地获得许多样本的数字图像。可以显示、存档和评估这些图像，并且可以以多种格式建立这些图像(例如bmp、Zvi、jpg)。软件识别适合预编程的测量或者特点的图像中的对象，并对所有这些对象进行计数。该系统对图像中的对象进行量化测量，并且将数值以及与数值相关的信息一起存储至样本身份中。软件允许互动的测量工具和参数(例如缩放比例、长度、轮廓、角度、圆周、时间计数)。可以将相关的数量和样本身份放入数据库以便进一步使用(例如使用来自样本的穗丝数以估算穗或者植株的总产量)。标定后，系统可以自动采集多个样本(或者样本的复制)的顺序图像，获得可检索格式的图像并且重复下一组样本。该系统可以评估、测量，计数并且存储结果。可以将该系统编程以执行数量计算以据此推算信息。该系统包括如样本定位、自动聚焦、在数个荧光通道中的图像采集、从不同的聚焦位置获得系列图像、获得连续时间内的图像、自动测量(编程)、对图像编目录以及存档(可检索的)、记录和自动执行步骤。可以基于宽的参数(例如几何的和/或密度的)范围进行测量。测量数据可以容易地输入大多数电子数据表程序，包括微软的Excel。例如，ZVI格式允许将图像数据与图像数、采集日期、显微镜设置、曝光数据、尺寸和缩放数据、使用的对比技术以及其它数据一起存储在数字存储器中。已经开发了通用的模板以将Imageftx)软件的输出转入Excel中。简化的结构向导允许用户建立期望的测量程序。可以由用户互动地确定描述样品的参数。可以指导这些参数以执行具体的指令。可以通过长度、面积、周长、圆周、角度或者其它几何或密度参数进行高分辨率图像的自动测量。该软件基于编程测量参数自动地计数和/或在图像上标注事件。可以将商用的图像评估软件与成像装置50和计算机72—起使用以在符合某些标准(与穗丝切屑物相符)的图像中产生可辨别的对象的数。通过软件可以对该标准编程。可以引导软件以便自动地产生数量。一些软件允许用户重载或者改变数量。例如，这可以在用户在计算机72显示屏上显示图像并且看到软件初步计数或者未能对图像对象计数时发生。通过对显示图像的可视检查，用户可以确定是否应该或者不应该进行计数，并且改变软件计数。这种图像评估软件的具体功能和特点在现有
技术领域：
中是已知的。其它的示例可以是软件驱动器，其可以根据编程的程序打开和关闭照相机。示例一是用于有效地获得具有样本的相对高吞吐量的玉米穗丝量化数值的一个系统和方法。可以理解该系统和方法可以类似地应用于其它植株或者非植物长形丝条或者片段。E.具体示例性实施方式二-流体流1.概述图9-12示出用于自动计数穗丝切屑物的其它方法。与在培养皿中分配样本、对其成像、并使用图像分析软件以测量和对满足预定义测试图像中的对象计数不同，该示例性实施方式二可以以与实施方式一的同样方法获得样本(例如通过之前描述的切削工具10)，但使用不同的计数方法。具体地，通过检测器将植株202的切屑物的每个样本40量化，该检测器适于检测并数字化计数每个通过检测器的穗丝切屑物。在小瓶30中收集样本40(多达数百穗丝切屑物的集合)。将小瓶30的内容倒入或者直接排空至流动通道、导管或者管207，其以分离(singulated)方式导引切屑物通过诸如光电检测器的检测器。切屑物足够分离以被计数。通过光电检测器记录每个切屑物的通过，从而获得切屑物或者穗丝片段的总数。清洁系统然后对送入的下一个样本40进行计数。可以将检测器连接到计算机，该计算机可以记录每个样本的穗丝数并且使每个计数与各自的样本或者植株相关。2.设备图9和10示出针对实施方式二的基本设置。该目标也用于获得多个丝条样本中的片段量化数量，且以合理有效的、高吞吐量的方法进行这些步骤。在该示例中，与实施方式一的主要区别是获得计数的方法。单个的片段通常在通过光检测器的流体流中被分离，该光检测器感测与流路中片段不存在相对的片段的出现。如在图9和10中的对穗丝切屑物计数的示例中所示的，玉米穗的穗丝切屑物40(1到2毫米长)悬浮于至少200毫升的流体溶液中或者使给定系统中堵塞最小化且分离最优化的体积的流体溶液中。由于保存样本，所以流体溶液的示例是组织学等级的流体乙醇，且样本穗丝切屑物趋于在流体溶液中很好地分离。可以将乙醇与有大量乙醇的容器206中的切屑物自动地混合(见图9和10)。相信只要可以使切屑物充分分离，则还可以利用包括气体(例如空气)的其它流体使切屑物40移动通过具有包括气体(例如空气)的其它流体的检测器214。通过蠕动泵或者其它适合的泵208将流体中悬浮的切屑物泵入导管210，转入检测器216位置的相对窄的管212(小于1毫米，i.d.，Tygon2075)以用于当移动通过管212中的检测点时促进切屑物的分离。在图9的示例中，为了更高的吞吐量，将样本和乙醇流体混合物分开并且将其处理入两个平行通道中，例如进入两个相等的两个窄管212A和212B，每个具有传感器或者检测器214A和214B。每个传感器2146A和2146B与对应的数字计数器216A和216B操作地联通以记录每个检测器214A和214B的检测，且将计数加到一起以得到全部样本的计数。显而易见地，可以通过一个检测器仅在一个通道中处理样本/流体混合物。在该示例中，检测器或者传感器214可以是带型激光传感器(例如美国明尼苏达州的明尼阿波利斯的美国邦纳工程国际有限公司(BannerEngineering)ofMinneapolis公司的D12DAB6FPQ5型)。这实质上是使用具有预定义带宽激光器的光电检测器型(与窄单束相反)，以通过测量反射比来检测对象的通过。这种类型的传感器是已知的并且产生计数的数字输出。光电传感器214具有两个主要元件发射器和接收器。发射器包含可以是例如LED或激光器的光源。发射器的光源是通过振荡器调制脉冲的。接收器包含诸如从发射器检测光的光电晶体管或者光电二极管等光电元件，且将接收的光密度转换成电压。放大并且解调电压。对于发射器的脉冲频率而言接收器是“调谐的”，且忽略全部其它由透镜聚焦的环境光。设置该接收器以产生输出信号，该输出信号高于或低于从其发射器接收的具体光密度。该类型的大多数传感器允许能够引起传感器输出进而改变状态的光量调节。因此，每次穗丝切屑物(或者其它待计数的片段)通过发射器的传感器光束时，在接收器处光束密度减弱到阈值以下，并产生输出信号。将该输出信号发送到商用的数字计数器216，该数字计数器216根据输出信号的每次接收而增值。可以理解，可以利用各种不同的元件以各种不同的方式执行实施方式二。例如，可选的传感器214是美国麻萨诸塞州马萨诸塞的康盖公司(CongexCorp.)的Checker牌光电传感器。也可使用其它传感器。其它用于对穗丝切屑物40计数的传感器示例包括，但不限于例如美国肯塔基州佛罗伦萨的霍尔顿车道8125号的巴鲁夫美国(BalluffUSA)公司的各种单光束光电传感器(参见图12A)，美国新泽西伍德克利夫湖的泰斯大街50号的基恩士美国(KeyenceCorp.ofAmerica)公司的FU-12型光纤光电传感器。如图9所示的，传感器214后可以有滤波器以便回收样本，并还允许流体通过到长颈瓶或者其它容器224以便回收，或者循环和再利用。图10示出用于诸如系统的原型实验室设备。如图所示的，样本切屑物40和从大容量容器206测量的流体数量可以人工地输入到系统200。通过窄的、模拟管部分212，泵208将样本/流体混合物泵入到流体柱中。检测器214使计数器216增值直到表示通过检测器214的每个切屑物事件。电池218可以给检测器供电。可以将样本/流体混合物泵入到长颈瓶或者其它回收容器224。如果需要，在此之前可以过滤切屑物40。通过元件的适当选择，可以很快地处理样本。通过减少堵塞和促进穗丝分离，连续的样本搅动用于增加精确度。气泡或者导管中的空气引起一些差异性。用于减少该差异性的方法是本领域普通技术人员常用的技术手段。可以理解，可以用使实施方式二便携(例如足够放在背包中的小且重量轻的)的元件构成该实施方式二。该系统可以包含在背包中并且通过电池供电。这允许操作者将系统带到田地且在植株处或者植株附近进行穗丝计数。图12B和图12D示出可以怎样在邻近样本/流体混合物流过的透明流体管附近支撑传感器214。例如，具有夹子的铰接(articulatable)保持器可以支撑分割线210A和210B以及两个检测器214A和214B(图12B)。可选的例子如图12D中示出的金属丝网屏。这种结构用于对元件提供稳定性以增加可操作性和精确度。当然可以使用其它包括更持久的结构的配置。固定元件的配置和稳定性对于优化系统是关键的。图11示出另一个可能的结构。可以将小瓶或者容器30A置于源于泵208的流动通道中。可以将样本40插入小瓶30A。将悬浮在从泵208泵出的流体中的样本40泵送通过光电检测器214以用于穗丝切屑物的量化，然后在第二个小瓶30B中重新采集。在该方法中，可以测量样本/流体混合物，但是随后放回到样本保持器以保存。3.操作该系统200的操作如下。可以在闪烁瓶中收集样本切屑物，加入乙醇然后将乙醇/切屑物内容倾倒入泵系统的入口(例如漏斗207-参见图10)。应该小心进行以将全部切屑物带出小瓶而后进入泵208。根据经验测试可优化泵速和固定配置。穗丝切屑物的充分分离取决于样本大小、流体体积、搅动效率、流体流速和传感器检测能力；这些也可以根据经验测试优化。可选地，使用空气或者真空以将切屑物泵入流体以使泵的搏动动作最小。处理速度可是每几分钟(或者更少)大约一个样本。这取决于通道数和优化。本领域的普通技术人员可以理解，常规的经验测试可以指导校准元件的操作。精确度对于许多应用都是可接受的。图16示出针对实施方式2的玉米穗丝计数和与由实施方式一利用Banner带型激光传感器(D12DAB6FPQ5型)对相同样本计数之间的对比。图16的表1示出可能由于校准问题和传感器稳定性导致的52%的平均误差。图16的表2示出通过使具有屏栅(图12D)或者其它保持器或者架(图12B-示出架的使用-例如使用美国加利福尼亚州卡马里奥的哈勃货运工具(HarborFreightTools)公司的“辅助放大镜”架，例如，用于软焊应用)的稳定传感器减少至大约8%的平均误差。可以调节并优化使用光电传感器对悬浮在流体中单个样本切屑物计数并且泵出或者通过光电传感器的一般方法。可以以相似的方法对其它植株和非植物长丝条或者片段实施。通过与数字计数器216连通数字计数(以计算机可理解并使用的格式)可以容易地实现计数的采集和存储。用户可以将每个样本的特性和计数保存在电子数据表或者计算机的数据库中。类似在示例一中描述的，可以将多个样本的计数信息用于需要和存储或者存档。F.具体示例性实施方式三-穗丝束横截面计数1.概述在图13和14A-C中示出计数穗丝的又一方法。利用例如3/4透明胶带340(图14A)持住玉米穗的穗丝束并将其拉紧且使其处于适当位置。在带的两端处或者靠近带的两端处，干净地并且横向地切割被束缚的穗丝束338(图14B)。这产生相对于成束暴露端穗丝束样本的大约1英寸长的或固定的部分以提供完整穗丝束338的横截面的切割。该样本保持在环境温度几分钟且每个穗丝束中的暴露穗丝端趋于变黑(图14B)。这改善了对比度。可以人工地计数每个穗丝的暴露端，或者可以获得图像且根据图像进行人工计数。可选地，合适编程的图像分析软件可以执行自动计数。2.设备单个倾斜刀片344或者其它锐利的切割仪器可以通过穗丝束338的两个位置进行横向切割(参见切割线1和2)以产生暴露的穗丝端(图13)。可以人工地计数每个穗丝。可选地，可以获得横截面的图像且对图像进行可视的、人工的或者自动的图像分析计数。成像器的示例是装配有的美国密歇根州斯特灵海茨柏洛兹街6540号的诊断仪器(DiagnosticInstruments)公司3·2·0型的模块(在7χ_10χ)的点洞察颜色照相机的美国宾夕法尼亚州中央谷团结路邮政信箱第3500的奥林帕斯图像美国公司(OlympuslmagingAmerica,Inc)的奥林帕斯SZX12型立视镜。可选的示例是装配德国哥廷根的卡尔蔡司显微成像有限公司(CarlZeissMicroImagingGmbH)的蔡司AxioCamMRc的WILD-Heerbrugg型M3Z立视镜(现在是瑞士圣加伦州(Heerbrugg)的马克斯-斯密德亨尼大街(Max-khmidheiny-Str)第201，9435号的莱卡仪器公司(瑞士))。其它类型的也是可能的。可以将一些着色或者染色类型应用于横截面以试图增加穗丝之间的对比度(对比图14C中的顶端和底端图像)。可以用可视光或者不可视光成像。3.操作图13和14的方法提供便携的现场穗丝计数。得到的经验是给方法比实施方式一和实施方式二慢(例如每天处理大约50个样本)。G.选择和替代物本领域的普通技术人员可以理解，本文所描述的可以实施本发明的实施方式可以变动。该发明不限于本文描述的具体实施方式。对于本领域普通技术人员显而易见的各种变化包括在本发明内。以下描述几个示例。1.仪器可以改变具体的系统和系统设置。可以根据期望或者需要改变具体的设备和组合。例如，根据特点和设置，可以改变实施方式一的具体照相机或者软件。同样地，可以改变实施方式二的具体泵和检测器。设计者可以根据需要和期望选择和构建设备。可以理解，每个示例都可以在各种地点、场合和环境中容易地运输和使用。每个示例甚至可以是便携式的，以在待计数的对象处提供计数。由于可以是相对小的规格(当都装配为一个操作系统以及单个元件时)、相对轻的重量，因此可以是便携式的，且可以由电池供电(或者由常规的使用的电源供电)。例如，根据实施方式一，可以将成像装置50设置在玉米地中或者附近。围栏可如同便携式通风橱且可以在环境中保护成像器。可以采集图像并存储在照相机中，然后在现场用手提PC或者在附近建筑物中的台式计算机进行分析。可选地，可以通过电子邮件或者其它通信协议或者网络将图像发送到中央控制室以用于用图像分析软件处理。可选地，在无需转换到第二容器的情况下，包括穗丝的容器可以直接用于成像。根据以上示出的实施方式二，可以用电池对泵、检测器和数字计数器供电。该设备可以在包括在田地或者户外的现场装配。至少当使用人工计数时，实施方式三是容易携带的且几乎可以在任何地点实施。在基地实验室和便携式现场系统之间可以设一些权衡(例如图像分辨率可以高于实验室设备；现场处理可以产生更快的且可以接受的结果)。在设计用于给定应用场合的系统和方法时，用户可以考虑这些问题因素。2.方法类似地，具体的方法步骤和顺序可以进行一些变化。而且，与穗丝切屑物有关的测量可以变化。例如，代替对穗丝切屑物的计数，可以进行穗丝直径的测量或者穗丝直径分布的测量。通过对实施方式一描述的图像分析软件的合适的编程，这可以从穗丝计数已经存档的图像获得，或者可以是进行的单独测量。当可以对其它植物或者非植物片段进行计数时，可以进行类似的变化。3.应用另外，可以改变计数方法的应用。例如，此处的示例性实施方式主要涉及活着的玉米的穗丝计数。当然，还可以应用于从植株分离的穗。如果需要，该计数方法可以以类似的方法用于计数其它的小对象。其它的对象可以是芹菜细胞结构的计数。还可以对在光纤束中的单个光纤进行计数。其它的已经在该描述中提及。然而，该发明不仅限于这些示例。而且，应该理解发明人已经发现可以将本发明的穗丝计数方法延用到植株研发的各种有益的应用。穗丝计数不仅可以用作对植株的潜在产量的指示，还可以用于由此延伸的大量应用。穗丝计数可用于能够实质上有助于植株研发的用途。使用穗丝计数的一些应用包括，但不限于，如下a.关于穗丝数量或者穗丝宽度的植株之间的差异(一次或多次的对比)。b.穗内的穗丝差异。c.产量预测(例如提前估算产量；田地产量估算模型产品的输入)。d.基因型的精确表现型(例如用于杂交的和同系繁殖的穗丝的速度和模式的测量)Oe.发现与丝纹特性差异有关的染色体区域。f.通过增加每植株的产量，减少出售商品的成本。g.使用穗丝切屑物以估算不同的转基因结构或者事件。本领域普通技术人员可以理解，可以将这些应用有益地用于多种用途。几个示例如下(a)在开花时间进行选择以在收获时更有效率(即规划收割机器、劳动、运输等寸乂O(b)种子产量管理(例如确定限制产量的因素-穗丝数量或者花粉数量)。(C)促进用于高吞吐量量化穗丝数量的工具以更好地理解有雌蕊的潜在产量、稳定性、风险和失效。(d)通过更好的理解确定潜在产量的因素而修改培植策略。(e)将穗丝计数应用于研究程序、培植策略和生产田地管理(管理、风险评估、预算产量估算)。在以下示例中阐述进一步的应用示例，所述以下示例涉及之前描述的应用于玉米穗丝的计数方法。H.进一步的示例性应用通过以下示例，证明穗丝或者其它长片段或者丝条的相对高吞吐量计数的能力。这些示例涉及玉米穗丝，但是趋于说明穗丝计数有时可以如何与其它测量或者参数相关。1.穗丝计数的测量在本领域中已知穗丝和胚珠数量之间存在重要关系，且该参数还表示内核数/穗和潜在产量。本穗丝计数方法适于帮助获得比手工计数更高生产率的可接受的统计精确度的穗丝数。所述计数对植株是非破坏性的。该方法允许进行有效地计数。目的是获得手工计数+/-2%内的计数精确度。通过使用之前描述的示例性实施方式一的成像分析计数，根据大量穗丝数量(80-900)的计数是与被认为可接受的+/-2%的范围是一致的(参见图15)。针对之前描述的示例性实施方式二的流体流光电检测器计数器技术，结果也在可接受的范围内(参见图16)。即使精确度结果低于以上描述的目标，计数方法仍是可用的。玉米穗丝数的统计可接受的方法或者量化方法的研发已经应用于许多用途。某些非限定性示例包括的方法提供了在不同植株之间、同一植株上的穗之间或者甚至同一穗上不同次数之间的调查穗丝数差异性的更有效的方式。这对于穗丝计数在试图更好地理解穗丝和穗丝研发以及穗和植株研发的大量应用中具有开发的潜力，这样可以相应地促进改善对植株特性的理解和研发。a)穗内或者植株之间的穗丝差异示例性实施方式的穗丝计数方法用于建立不同基因型植株、同样基因型的植株、不同环境条件下不同生长地点中生长的同样和不同基因型的植株，以及具有不同覆盖处理(例如持续具体时间的覆盖或者非覆盖穗丝)的同样或者不同的生长的基因型的植株穗丝数之间的差异(参见图17)。可以将该差异性用于很多用途。例如，一种用途是通过穗丝数可以区别或者识别不同的基因型。另一种用途是基于不同环境的穗丝产品描绘一种基因型或者不同基因型的特点。又一种用途是量化同样同系繁殖或者杂交品种的植株之间的穗丝数的差异程度。注意图17还示出在长丝时期内穗丝数如何天天变化。如将在之后讨论的，这也可以用于描绘或者预测一种基因型或者多种基因型的特性。可以将这些特性用于评估诸如由环境、基因或者农业生产所影响的出产量等事物。该方法也允许在不同时间从同一穗获得穗丝数，以研究穗丝伸展和生长的动态。2.穗丝数量的应用a)数量将穗丝数用于多种用途以帮助理解玉米植株的过程。如以上提及的，一个主要的示例是穗丝数量和作为识别工具的基因型之间的关系。也如以上讨论的，穗丝数量与穗或者植株的潜在产量相关。由穗丝数测得的任何潜在的产量减少可以表示对于种子生产者损失的商业收入潜力。穗丝数是用于评估由环境、基因型或者农业管理实践影响的出产量的有价值的工具。通过使用之前描述的示例性实施方式1-3的穗丝计数方法，可以以相对有效的方式将穗丝计数用于这些目的。可以更有效地研究诸如雌蕊产量潜力、稳定性、风险和失效等事物。例如，产量的非稳定性几乎总是和与目标基因型中压力敏感性矩阵相互作用的压力差异水平有关。在培植程序中(或作为转基因评估创始的部分)选择提高的产量稳定性为种子公司和种植者的期望目标。当玉米植株在生长季节中期的压力下时，谷物产量的差异主要是核数的差异，根据每个植株的穗和每个穗的核(KPE)的差异。由于压力(stress)较小地影响50%的开花时间，因此开花压力导致通常与ASI(开花出穗间隔)相关的开花时间的穗丝伸出的延迟。可以很好地建立对于谷物产量和KPE的ASI的关系，但是该特性是暂时的且表现与出穗丝和花粉散落的总动态相关的较少的细节。这些群落必须重叠以确保授粉，且穗丝和花粉必须在压力下保持有能力的以确保受精和好的核集合。穗丝生产的动态具体涉及在穗丝生长中的植株之间和穗内部的差异、穗丝露出的均勻度和其适用花粉的同步性。压力之下用于稳定的核集合的选择要求针对特性的大量基因型的筛选，所述特性对于压力水平范围下的核集合是关键的。以下是与穗丝数有关的各种其它应用示例的非限定性讨论。在压力差异水平(干旱、高温、密度和低氮)下改善产量稳定性可以改善一段时间和环境内的玉米杂交特性，并且有助于增加和稳定农业收入。在玉米开花期间发生的再生产处理对压力特别敏感，从而表示用于改善产量稳定性的约定目标。在受管理的压力研究环境中初始研究的结果确认了当开花期发生干旱压力时，谷物产量对穗和子房生长、穗丝显露和适于授粉的核生长的强烈依赖。在这些研究中还确定了这些过程存在的压力敏感性一般差异。以下是附加的具体的表征型工具，用于剖析花期压力的耐受性以及生成用作改进玉米产量稳定性的模型的表征。预期的益处包括穗丝生长率的高吞吐量精确度的表征方法和出穗的穗内同步性，以及确定早期穗丝生长时期核败育程度的程序。通过使用这些工具，期望用于改善稳定性的选择提供对影响核数从而影响产量的压力矩阵的改善的耐受性。b)预测(I)KPE和谷物产量如所提及的，由于每个穗丝应该与胚珠有关(这理想地应该产生核)，因此每穗的穗丝数通常大体上表示穗的最终产量，这在确定谷物产量中是主要因素(连同核大小)。通过使用高吞吐量的穗丝计数方法，穗丝数的量化可以用在预测产量的任何方法中。可以用于针对穗、针对植株或者针对基因型预测产量。通过常规的技术，使用产量预测可有助于计划中的种植者或者种子生产公司。因为可以在植株生命中相对较早地获得穗丝数，因此在收获前可以较好地使用该信息(主要在生长季节中期)。权利要求1.对一个或者多个玉米植株的穗丝束中的穗丝进行高吞吐量计数的方法，包括a.从所述穗丝束切割下包含相对短长度的穗丝的一部分；b.将所述短长度的穗丝分布在容器的表面上；c.对所述容器成像；d.使用图像识别软件评估图像，并且对表示切割的短长度穗丝的对象进行计数；以及e.存储与样本相关的计数。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述相对短长度的穗丝的长度范围是1.5到2毫米。3.根据权利要求1所述的方法，还包括a.处理所述图像以便根据所述图像确定所述穗丝样本的至少一个物理性质的估计；b.将所述穗丝的至少一个物理性质的所述估计与其他植株的所述物理性质进行比较以提供对照；以及c.基于所述对照，将所述植株相对于所述其它植株进行评估。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述物理性质是尺寸、数量、形状、面积、平均尺寸、平均形状、平均面积、尺寸分布、形状分布或者面积分布。5.根据权利要求3所述的方法，其中评估步骤包括将所述物理性质a.与相同品种的其它植株的物理性质进行对比，以记录它们之间的任何差异；或者b.与不同品种的其它植株的物理性质进行对比，以记录它们之间的任何差异。6.一种对玉米植株的穗丝束的穗丝进行相对高吞吐量计数的方法，包括a.从所述穗丝束切割出包含相对短长度的穗丝的一部分；b.使所述短长度的穗丝顺序地且大体上分离地移动通过检测器；c.将所述检测器编程以对表示短长度的穗丝的对象进行计数；以及d.存储与样本相关的穗丝计数。7.根据权利要求1或6所述的方法，其中，使所述短长度的穗丝流入空气或液体中。8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述检测器包括光电检测器、激光器或者粒子计数器。9.根据权利要求1或6所述的方法，还包括使用所述穗丝计数以便a.预测植株的品种、表现型或者基因型；b.预测所述植株的生长条件；c.为所述植株的种子选择生长条件；d.选择用于研究的所述植株的进一步应用；e.选择用于商业生产的所述植株的进一步应用；f.评估不同的转基因结构或者事件。10.一种获得玉米植株的穗丝束的穗丝样本的方法，包括a.将所述穗丝束保持为绷紧的；以及b.通过i.使分开一定距离的两个刀片大致横向地移动通过所述穗丝束，以便将所述穗丝束的相对短长度的穗丝从所述植株分离，从而切割所述穗丝束的横截面。11.根据权利要求10所述的方法，还包括将钝边置于与所述刀片切割方向的相对的、所述穗丝束的相对侧。12.—种对玉米植株的穗丝束的穗丝进行计数的方法，包括a.将所述穗丝束保持为绷紧的；b.切割所述穗丝束的横截面；c.对在所述横截面中的所述穗丝的暴露端计数。13.根据权利要求12所述的方法，还包括采集所述穗丝束的所述横截面的数字图像。14.根据权利要求12所述的方法，还包括对所述穗丝束的所述横截面进行着色以便增加穗丝之间的对比度。15.一种从多个不同玉米植株中选择种质的方法，包括a.计算多个不同类型玉米植株的每个穗显露的穗丝数量；以及b.基于所述穗丝数量选择进一步应用的植株。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述选择是程序的一部分以便a.改善培植种质；以及b.改善植株培植程序。17.根据权利要求15所述的方法，其中所述计数步骤包括自动地或者半自动地对玉米穗进行穗丝计数，并且使用所述穗丝计数用于进一步的目的，其中所述进一步目的包括以下的一个或者多个a.对与穗丝数量、长度、宽度或者亮度相关的植株之间的差异进行量化；b.对穗内的穗丝的差异进行量化；以及c.产量分析。18.根据权利要求17所述的方法，还包括在研究程序、培植策略或者生产田地管理中利用一个或者多个穗丝计数的穗丝数量。19.一种基于穗丝的量化选择植株的基因型的方法，包括a.获得所述基因型的穗丝样本的量化数量；b.将所述基因型的穗丝总量的估算与参考信息进行比较；以及c.决定是否应该选择所述基因型以用于进一步应用。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述样本的量化数量包括a.获得尺寸相似的每个穗丝的样本；b.将所述样本大体上均勻地分布在平面内；c.对所述样本成像；d.用编程的图像分析软件评估所述图像以便识别所述图像中表示单个穗丝样本的对象；e.存储被识别的对象的数量；以及f.根据所述被识别的对象的数量估算总穗丝数量。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述数量用于预测所述植株的谷物产量。全文摘要本发明涉及一种用于计数包括植株穗丝细长丝条的相对高吞吐量的方法。一种方法包括从植株穗丝束的一部分分离尺寸相似的穗丝片段并且通过使用自动方法定量地计数。该自动方法可以通过表面或在表面上分布的片段的数字图像以及图像分析以便得出单个片段的数量。可选的自动方法是使片段连续且基本单独的通过检测器。文档编号G01N1/04GK102132139SQ200980132758公开日2011年7月20日申请日期2009年8月21日优先权日2008年8月22日发明者丹尼尔·M·高曼,卢卡斯·伯瑞斯,史蒂文·R·安德森,尼尔·J·豪斯曼,杰弗里·R·思彻斯勒尔,格雷戈里·爱德密德斯,特拉维斯·A·汉塞尔曼,罗纳德·L·法灵顿申请人:先锋国际良种公司