专利名称：一种用于检测阿特拉津的生物传感电极及其制作方法
技术领域：
本发明涉及一种纳米修饰电极和生物检测技术领域，尤其是涉及一种用于检测阿特拉津的生物传感电极及其制作方法。
背景技术：
阿特拉津自1952年由瑞士 Ciki-Geigy化学公司开发生产以来，由于其高效等特性，成为了全世界应用最为广泛的除草剂之一。据研究表明，阿特拉津是一种内分泌干扰物，在低浓度下可能存在对机体产生亚急性损伤的潜在危害。近年，在很多地区的地下水和地表水中检都测到了阿特拉津残余。于是，迫切需要建立一种快速、高灵敏的检测低浓度的阿特拉津的方法。传统的阿特拉津分析方法(如薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法和气质联用等)虽然可以达到痕量检测水平，但是其检测程序复杂、耗时，并且仪器昂贵。由于电化学传感器制作简单，可在浑浊液中检测，容易小型化，灵敏度高，被用来检测低浓度的阿特拉津等污染物。近年来，尤其酶生物传感器发展非常迅速。但是，由于酶的高度不稳定性，并且容易形成中间产物阻碍酶反应及污染电极，进一步提高灵敏度成为大多研究者关注的焦点。因此，我们设想构筑一种高灵敏的、稳定的、制作简单、价格低廉的阿特拉津电化学生物传感器。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种超高灵敏的、制备简单、成本低廉、检测速度快的用于检测阿特拉津的生物传感电极及其制作方法。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现一种用于检测阿特拉津的生物传感电极，其特征在于，该传感电极以钛板为基体电极，钛板表面生长的直立有序的二氧化钛纳米管及在管内和表面修饰的酪氨酸酶。—种用于检测阿特拉津的生物传感电极的制作方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)钛板表面二氧化钛纳米管电极的制备将纯钛板依次用100#、300#和500#砂纸打磨，然后用金相砂纸进一步抛光，使纯钛板表面平滑成镜面，接着在蒸馏水和丙酮中各超声清洗15min，再二次蒸馏水清洗干净后，将钛板浸泡在浓度为10wt%草酸中微沸蚀刻 1. 5h,然后用二次蒸馏水将钛板清洗干净并吹干，在室温下，将预处理过的钛板作为阳极， 钼片电极作为对电极，先用浓度为0. 5wt%的氢氟酸做电解液，20V下预处理lh，再以水、氟化铵和乙二醇的混合溶液作为电解液，20V下进行阳极化氧化池，取出钛板用二次蒸馏水清洗干净后在氮气气氛中干燥，然后置于管式炉中在氧气气氛中进行热处理，得到表面含二氧化钛纳米管的钛板；(2)钛板表面二氧化钛纳米管电极的预处理在2mol/L的NH4Cl溶液中，以表面含二氧化钛纳米管的钛板作为工作电极，饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极，钼丝电极作为对电极，于-1. 5V恒电位下还原预处理3s ；(3)酪氨酸酶的固定配置含10mg/ml的酪氨酸酶的pH为7. O的磷酸缓冲液，采用微量注射器取20 μ L 50U · μ Γ1的酪氨酸酶溶液和5 μ L 2. 5wt%的戊二醛覆盖在工作电极表面，整个工作电极表面都涂好溶液后，将工作电极在氮气气氛下干燥，从而制备得到固定了致密酪氨酸酶的用于检测阿特拉津的生物传感电极，放入4°C冰箱中保存待用。所述步骤(1)中的混合溶液中水、氟化铵和乙二醇的重量比为1 0. 25 98. 75。所述步骤(1)中的热处理包括以下步骤控制升温速率为1°C /min将管式炉的温度由室温升至500°C，然后在500°C恒温证，最后以1°C /min的速率将管式炉降至室温即可。与现有技术相比，本发明在钛板上直立有序的TiO2-NTs上固定了酪氨酸酶制备得到Tyr/Ti02-NTs，获得了优异的稳定性能和超高的灵敏度，与传统技术和现有生物传感器相比，其具有以下优点(1)与传统的分析方法相比，此传感器制备简单，成本低廉，检测速度快；(2)与现有生物传感器相比，本发明采用了直立于钛板上的直立有序TiO2-NTs为基体电极材料，首先这种材料生物兼容性和亲水性好，有利于生物分子的固定，再者，这种纳米管阵列高度有序，物理化学性能稳定，能够提供很大的比表面积和自由空间，其多孔管式结构更有利于酪氨酸酶分子的负载，加大了酪氨酸酶分子的负载量，有利于酶催化反应的进行，同时，原位生长的直立TiO2-NTs制备工艺更加简便、经济。
图1为本发明制备的生物传感电极在阿特拉津中的抑制曲线；图2本发明制备的用于检测阿特拉津的生物传感电极和HPLC对土壤中阿特拉津的检测结果。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。实施例一种超高灵敏的阿特拉津生物传感电极，该传感电极以钛板为基体电极，钛板表面生长的直立有序的二氧化钛纳米管及在管内和表面修饰的酪氨酸酶。具体制作过程如下将纯钛板(直径0. 5mm)依次用100#，300#和500#砂纸打磨，然后用金相砂纸进一步抛光，使基体表面平滑成镜面，接着在蒸馏水和丙酮中各超声清洗15分钟。用二次蒸馏水清洗干净后，将钛板首先在10wt%草酸中微沸蚀刻1. 5小时，然后再将钛板用二次蒸馏水清洗干净并吹干。在室温下，将预处理过的钛片作为阳极，钼片电极作为对电极，先用 wt. 0.5%的氢氟酸做电解液，20V下预处理1小时；再以水(wt. )、氟化铵(0. 25% )和乙二醇(98.75%)的混合溶液作为电解液，20V下进行阳极化氧化3小时。取出电极用二次蒸馏水清洗干净后在氮气气氛中干燥，然后置于管式炉中在氧气气氛中进行热处理。采用如下程序进行热处理首先，升温速率1°C /分钟由室温升至500°C，然后在500°C恒温5 小时，最后同样以1°C /分钟的速率降至室温，最后制备得到钛板基体表面直立生长的二氧化钛纳米管电极。在2mol/L的NH4Cl溶液中，以钛板表面二氧化钛纳米管电极作为工作电极，饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极，钼丝电极作为对电极，于-1.5V恒电位下还原预处理3秒钟。配置含10mg/ml的酪氨酸酶的pH为7. O的磷酸缓冲液PBS，然后采用微量注射器取20μ L 50U · μ L—1的酪氨酸酶溶液和5μ L 2. 5%的戊二醛覆盖在电极表面，整个电极表面都涂好溶液后，将电极在氮气气氛下干燥，从而制备得到固定了致密酪氨酸酶的用于检测阿特拉津的生物传感电极Tyr/Ti02-NTs，放入4°C冰箱中保存待用。以得到的用于Tyr/Ti02-NTs作为工作电极，钼丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，建立三电极体系。电解池中电解液为含0. ImM对甲酚的pH为7.0&PBS。电化学测定中应搅拌，并通入氧气。用CHI660电化学工作站对所述的三电极体系进行数据控制传输，采用循环伏安法对电化学行为进行考察，连续20圈内，还原法峰电流响应值为0. 22mA, 标准偏差为4. 2%。放入4°C冰箱4周后，再次考察，峰电流为原来的90%。对于阿特拉津，用含阿特拉津IOppm的标准样品用PBS逐渐稀释至2ppt，分别将传感器进入阿特拉津溶液中IOmin后，测定酶抑制率见图1。我们可以看出，该生物传感器的检测范围为0.2ppt-10ppm，在0.2-10ppt范围内呈线性关系，线性方程为= 8. 461+2. 741C(ppt)，相关系数为 0. 9996，检测限为 0. Ippt0用PVC板围住ImX Im的试验小区，试验小区在一个500m2的没有喷洒农药历史的水稻土地区。试验前，采集空白土壤样品做对照样品。将250mg阿特拉津溶于IL水中(加入少量丙酮助溶)，均勻喷洒在土壤表面，平衡Mh。然后，模拟降雨40ml，直至表层积水完全入渗后，平衡Mh，采集土壤样品。土壤样品按下述方法采集。试验小区分成4小块，每块分成 4 等分，在深度为 0-10，10-20，20-30，30-40，40-50，50-60，60_70cm 土壤层中取土壤样品。土壤在室温下自然风干，碾碎后过筛，取土样10g，于250mL锥形瓶中，加入50mL丙酮， 浸泡他后，振荡lh。沉清后，其上清液根据检测方法分为以下两种处理程序。(1)用于生物传感器时，只取上清液30ml，直接加入PBS中使用传感器检测。( 用于HPLC检测时，将上清液导入铺有二层滤纸及一薄层助滤剂的布氏漏斗减压抽滤，然后加入少量无水硫酸钠去水，重复上述抽滤，取滤液30ml，在旋转蒸发器水浴中减压蒸致近干，然后用丙酮定容致 2mL·所有样品置于4°C冰箱中以备检测。以实施例1得到的Tyr/Ti02_NTs和HPLC分别检测的结果见图2。两种方法检测的误差小于5%。并且该阿特拉津电化学生物传感器对阿特拉津的检测比HPLC检测法更为灵敏。非常重要的是，用该传感器检测时，样品的预处理过程大大简化，既缩短了检测的时间，又减少了复杂过程中造成的误差。由此表明，利用该生物传感器检测土壤中的阿特拉津具有良好的效果。
权利要求
1.一种用于检测阿特拉津的生物传感电极，其特征在于，该传感电极以钛板为基体电极，钛板表面生长的直立有序的二氧化钛纳米管及在管内和表面修饰的酪氨酸酶。
2.一种用于检测阿特拉津的生物传感电极的制作方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)钛板表面二氧化钛纳米管电极的制备将纯钛板依次用100#、300#和500#砂纸打磨，然后用金相砂纸进一步抛光，使纯钛板表面平滑成镜面，接着在蒸馏水和丙酮中各超声清洗15min，再二次蒸馏水清洗干净后，将钛板浸泡在浓度为10wt%草酸中微沸蚀刻1.证，然后用二次蒸馏水将钛板清洗干净并吹干， 在室温下，将预处理过的钛板作为阳极，钼片电极作为对电极，先用浓度为0. 5wt%的氢氟酸做电解液，20V下预处理lh，再以水、氟化铵和乙二醇的混合溶液作为电解液，20V下进行阳极化氧化池，取出钛板用二次蒸馏水清洗干净后在氮气气氛中干燥，然后置于管式炉中在氧气气氛中进行热处理，得到表面含二氧化钛纳米管的钛板；(2)钛板表面二氧化钛纳米管电极的预处理在2mol/L的NH4Cl溶液中，以表面含二氧化钛纳米管的钛板作为工作电极，饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极，钼丝电极作为对电极，于-1.5V恒电位下还原预处理3s ；(3)酪氨酸酶的固定配置含10mg/ml的酪氨酸酶的pH为7.0的磷酸缓冲液，采用微量注射器取20 μ L 50U · μ厂1的酪氨酸酶溶液和5μ L 2. 5wt%的戊二醛覆盖在工作电极表面，整个工作电极表面都涂好溶液后，将工作电极在氮气气氛下干燥，从而制备得到固定了致密酪氨酸酶的用于检测阿特拉津的生物传感电极，放入4°C冰箱中保存待用。
3.根据权利要求2所述的一种用于检测阿特拉津的生物传感电极的制作方法，其特征在于，所述步骤(1)中的混合溶液中水、氟化铵和乙二醇的重量比为1 0.25 98.75。
4.根据权利要求2所述的一种用于检测阿特拉津的生物传感电极的制作方法，其特征在于，所述步骤(1)中的热处理包括以下步骤控制升温速率为1°C /min将管式炉的温度由室温升至500°C，然后在500°C恒温釙，最后以1°C /min的速率将管式炉降至室温即可。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测阿特拉津的生物传感电极及其制作方法，该生物传感电极由钛板、钛板表面生长的直立有序的二氧化钛纳米管及在管内和表面修饰的酪氨酸酶组成，采用阳极氧化法在钛板表面生长直立有序的二氧化钛纳米管，制备得到钛板表面二氧化钛纳米管电极(TiO2-NTs)；然后在2mol/L的NH4C1溶液中，于-1.5V恒电位下预处理3秒钟；再用微量注射器取20μL 50U·μL-1的酪氨酸酶溶液和5μL 2.5％的戊二醛覆盖在电极表面，制备得到Tyr/TiO2-NTs。与现有技术相比，本发明制备方法简单，成本低，重现性好，用于检测环境中低浓度阿特拉津的检测稳定性好、检测范围为0.2ppt-10ppm，检测限为0.1ppt。
文档编号G01N27/327GK102297887SQ20101020949
公开日2011年12月28日 申请日期2010年6月24日 优先权日2010年6月24日
发明者余志敏, 刘梅川, 吴涛, 张重宁, 赵国华 申请人:同济大学