专利名称：定量湖泊沉积物中氨氧化古菌的方法
技术领域：
本发明属于环境微生物生态学技术领域，具体涉及一种定量测定湖泊沉积物中氨氧化古菌的方法。
背景技术：
当前，淡水湖泊的富营养化问题已成为我国所面临的重要环境问题之一，氮、磷等营养元素的过量输入是导致湖泊富营养化的重要原因。因此，研究氮素在湖泊生态系统中的生物地球化学循环规律可以为阐明湖泊富营养化的形成机理并寻找相应的控制措施提供依据。湖泊沉积物是淡水生态系统的重要组成部分，也是大量微生物类群的栖息地，这些微生物类群在湖泊中氮、磷等营养元素循环方面发挥着重要的作用，对于维持湖泊生态系统的健康和稳定具有重要的意义。湖泊生态系统中的氮循环包括硝化、反硝化等复杂过程。硝化作用是其中非常关键的一个环节，包括两个反应步骤，第一个步骤是将氨氧化成亚硝酸盐，第二个步骤是将亚硝酸盐氧化成硝酸盐。第一步氨氧化过程是整个反应的限速步骤，主要由氨氧化细菌 (Ammonia oxidizing bacteria，A0B)禾口氨氧化古菌(Ammonia oxidizing archaea，A0A) 这两类微生物完成。与AOB相比，AOA不论是在数量、多样性及其栖居范围等各方面都高于 Α0Β。因此，对于湖泊沉积物中AOA的定量研究有助于阐明湖泊沉积物中氮循环作用的相关机理。很长一段时间以来，对于环境样品中微生物的数量及多样性的研究主要依赖分离培养和显微镜观察等传统方法。这些传统方法周期长、误差大，无法准确地反映湖泊沉积物中氨氧化古菌的数量。因此，迫切需要有新的方法对AOA进行定量表征，只有这样才能在此基础上进一步探索缓解湖泊富营养化的新方法。
发明内容
本发明的目的在于克服传统技术的缺陷，而提供一种湖泊沉积物中氨氧化古菌的荧光定量PCR检测方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的 (I)DNA的提取
采集湖泊沉积物样品并进行冷冻干燥。称取5 g冻干之后的沉积物样品放入50 mL离心管中，加入9 mL无菌水，2 mL iTris-HCl缓冲液，2. 5 mL EDTA溶液和5 mL 10% SDS溶液。混合后，65°C水浴60 min。12000 rpm室温离心10 min。上清液收集在50 mL离心管中，加入3 mL 5M NaCl和2 mL 10% CTAB溶液和10 mL蛋白酶K，轻微混勻，65°C水浴保温20 min。上清液中加入16 mL氯仿异戊醇混合液(24 :1体积比)，轻微混勻1 min，3000 rpm室温离心5 min。将上层水相移入50 mL离心管，加入0. 1倍体积3M NaAc和0. 6倍体积异丙醇，轻微混勻，4°C冰浴60 min，4°C下12000 rpm离心20 min。弃去上清液，沉淀用5 mL 75%乙醇洗涤，12000 rpm (4°C)再离心10 min。弃去上清液，沉淀风干，溶解于50 mL TE 缓冲液(pH 8.0)。(2)氨氧化古菌质粒标准品的构建及样品分析
通过氨氧化古菌特异性引物Arch-amoAF和Arch-amoAR对提取得到的DNA进行扩增。 扩增反应体系为 50 mL，包含 10 X PCR 缓冲液 5 mL，2. 5 mM Mg2+ 4 ml, 4 mL dNTPs (各 2. 5 mM)，上下游引物各1 mL (10 mM), Taq DNA聚合酶2 U。扩增反应程序为94°C预变性5 min，94°C变性1 min，53°C退火1 min，72°C延伸1. 5 min，共45个循环，最后在72°C延伸10 min。PCR扩增产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，并用Axygen凝胶回收试剂盒进行切胶纯化，纯化后的产物与!Iomega公司的pGEM T-Easy载体在4°C连接过夜。连接产物转化至感受态细胞(DH5a)并涂平板培养过夜。在平板上挑取白色单克隆菌落用LB培养基进行扩大培养，用Axygen的小量质粒提取试剂盒提取质粒，经PCR验证后在紫外分光光度计上测定其浓度并换算为氨氧化古菌的拷贝数，-20°C保存备用。将已计算出拷贝数的氨氧化古菌质粒DNA按照10倍梯度进行稀释，使其浓度在 IO2^lO7 copies/mL之间。取1 mL稀释产物作为模板加入20 mL定量PCR扩增体系，在 Rotor-Gene定量PCR仪上进行扩增反应，得到扩增标准曲线。20 mL扩增反应体系包括 2 XPremix Ex Taq 10 mL，上下游引物各0.8 mL，DNA模板1 mL。PCR循环条件95°C预变性3 min，94°C变性30 s，53°C退火60 s，72°C延伸20 s，共45个循环。待检测样品与标准曲线同步操作，扩增体系及扩增程序与建立标准曲线一致。通过检测未知样品的Ct值对照标准曲线，可以检测出未知样品中氨氧化古菌的拷贝数。本发明的有益结果本发明应用实时荧光定量PCR技术定量检测湖泊沉积物中的氨氧化古菌，为研究湖泊沉积物中的氮循环机理提供了一种快速、简便、准确的研究方法。
图1是本发明荧光定量PCR检测氨氧化古菌重组质粒DNA的标准曲线图； 图2是本发明荧光定量PCR检测氨氧化古菌重组质粒DNA的扩增曲线。
具体实施例方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面以太湖沉积物中氨氧化古菌的定量研究为例进一步描述本发明
这种定量研究沉积物中氨氧化古菌的方法，包括以下步骤 (I)DNA的提取
采集湖泊沉积物样品并进行冷冻干燥。称取5 g冻干之后的沉积物样品放入50 mL离心管中，加入9 mL无菌水，2 mL iTris-HCl缓冲液，2. 5 mL EDTA溶液和5 mL 10% SDS溶液。混合后，65°C水浴60 min。12000 rpm室温离心10 min。上清液收集在50 mL离心管中，加入3 mL 5M NaCl和2 mL 10% CTAB溶液和10 mL蛋白酶K，轻微混勻，65°C水浴保温 20 min。上清液中加入16 mL氯仿异戊醇混合液(24 1体积比)，轻微混勻1 min，3000 rpm室温离心5 min。将上层水相移入50 mL离心管，加入0. 1倍体积3M NaAc和0. 6倍体积异丙醇，轻微混勻，4°C冰浴60 min，4°C下12000 rpm离心20 min。弃去上清液，沉淀用5 mL 75%乙醇洗涤，12000 rpm (4°C)再离心10 min。弃去上清液，沉淀风干，溶解于50 mL TE 缓冲液(pH 8.0)。(2)氨氧化古菌质粒标准品的构建及样品分析
通过氨氧化古菌特异性引物Arch-amoAF (5 ‘ -STAATGGTCTGGCTTAGACG -3 ‘)和 Arch-amoAR (5' -GCGGC CATCCATCTGTATGT-3‘)对提取得到的DNA进行扩增。扩增反应体系为 50 mL，包含 10 X PCR缓冲液 5 mL，2.5 mM Mg2+ 4 ml, 4 mL dNTPs (各 2. 5 mM)，上下游引物各1 mL(10 mM),Taq DNA聚合酶2 U。扩增反应程序为94°C预变性5 min，94°C变性1 min，53°C退火1 min，72°C延伸1.5 min，共45个循环，最后在72°C延伸10 min。PCR 扩增产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，并用Axygen凝胶回收试剂盒进行切胶纯化，纯化后的产物与!Iomega公司的pGEM T-Easy载体在4°C连接过夜。连接产物转化至感受态细胞 (DH5a)并涂平板培养过夜。在平板上挑取白色单克隆菌落用LB培养基进行扩大培养，用 Axygen的小量质粒提取试剂盒提取质粒，经PCR验证后在紫外分光光度计上测定其浓度并换算为氨氧化古菌的拷贝数为1. 7X 101° copies/uL, _20°C保存备用。将已计算出拷贝数的氨氧化古菌质粒DNA按照10倍梯度进行稀释，使其浓度在 3.4X10^3.4X IO7 copies/mL之间。取1 mL稀释产物作为模板加入20 mL定量PCR扩增体系，在Rotor-Gene定量PCR仪上进行扩增反应，得到扩增标准曲线。20 mL扩增反应体系包括2XPremix Ex Taq 10 mL，上下游引物各0.8 mL，DNA模板1 mL。PCR循环条件95°C 预变性3 min，94°C变性30 s，53°C退火60 s，72°C延伸20 s，共45个循环。待检测样品与标准曲线同步操作，扩增体系及扩增程序与建立标准曲线一致。反应结束后，应用Rotor-Gene 6000软件包对结果进行分析。根据各反应管所测 Ct值(y)与所含质粒DNA拷贝数浓度(χ)之间的对应关系，得到荧光定量PCR检测氨氧化古菌的标准曲线:y=-3. 3521og(x) +33. 514 (Jf=0. 991)，见图 1。通过检测未知样品的Ct值对照标准曲线，可以检测出未知样品中氨氧化古菌的拷贝数。
权利要求
1.定量湖泊沉积物中氨氧化古菌的方法，其特征在于步骤为a.DNA的提取采集湖泊沉积物样品并进行冷冻干燥，称取5g冻干之后的沉积物样品放入50 mL离心管中，应用CTAB化学裂解法提取沉积物总DNA，溶解于50 mL pH 8.0 TE缓冲液；氨氧化古菌质粒标准品的构建及样品分析通过氨氧化古菌特异性引物Arch-amoAF和Arch_amoAR对提取得到的DNA进行扩增，扩增反应体系为50 mL,包含 10XPCR 缓冲液 5 mL，2. 5 mM Mg2+ 4 ml, 4 mL dNTPs，各 2. 5 mM，上下游引物 10 mM 各 1 mL, Taq DNA聚合酶2 U ；扩增反应程序为94°C预变性5 min，94°C变性1 min，53°C退火1 min，72°C延伸1.5 min，共45个循环，最后在72°C延伸10 min ；PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，并用Axygen凝胶回收试剂盒进行切胶纯化，纯化后的产物与Promega公司的pGEM T-Easy载体在4°C连接过夜；连接产物转化至感受态细胞Dffia并涂平板培养过夜；在平板上挑取白色单克隆菌落用LB培养基进行扩大培养，用Axygen的小量质粒提取试剂盒提取质粒，经PCR验证后在紫外分光光度计上测定其浓度并换算为氨氧化古菌的拷贝数，-20°C保存备用；b.将已计算出拷贝数的氨氧化古菌质粒DNA按照10倍梯度进行稀释，使其浓度在 IO2^lO7 copies/mL之间，取1 mL稀释产物作为模板加入20 mL定量PCR扩增体系，在 Rotor-Gene定量PCR仪上进行扩增反应，得到扩增标准曲线；20 mL扩增反应体系包括 2 XPremix Ex Taq 10 mL，上下游引物各0.8 mL, DNA模板1 mL ;PCR循环条件95°C预变性3 min，94°C变性30 s，53°C退火60 s，72°C延伸20 s，共45个循环；待检测样品与标准曲线同步操作，扩增体系及扩增程序与建立标准曲线一致；通过检测未知样品的Ct值对照标准曲线，检测出未知样品中氨氧化古菌的拷贝数。
全文摘要
定量湖泊沉积物中氨氧化古菌的方法，包括DNA的提取、氨氧化古菌质粒标准品的构建及样品分析、得到扩增标准曲线后通过检测未知样品的Ct值对照标准曲线，检测出未知样品中氨氧化古菌的拷贝数。本发明应用实时荧光定量PCR技术定量检测湖泊沉积物中的氨氧化古菌，为研究湖泊沉积物中的氮循环机理提供了一种快速、简便、准确的研究方法。
文档编号G01N21/64GK102230009SQ20111015793
公开日2011年11月2日 申请日期2011年6月14日 优先权日2011年6月14日
发明者姜翠玲, 徐于楠, 燕文明, 王猛, 赵大勇, 马婷, 黄睿 申请人:河海大学