专利名称：一种快速检测食品中的邻苯二甲酸二丁酯的方法
技术领域：
本发明涉及一种邻苯二甲酸二丁酯的检测方法。
技术背景
2011年4月份以来，在台湾发生的食品添加物起云剂中加入有害健康的塑化剂事件引起轩然大波。塑化剂是一种对树脂或塑料或橡胶或粘合剂等高分子材料有溶剂化作用的一类功能性化学品，是一种高分子材料助剂，常用的增塑剂是邻苯二甲酸酯。研究信息表明，邻苯二甲酸酯对环境和人体可能存在不良影响。欧盟是最早对邻苯二甲酸酯的应用做出限制的国际组织。欧盟2005/84/EC指令列出了六种邻苯二甲酸酯物质DEHP、DBP、BBP (邻苯二甲酸丁苄酯)、DINP、DIDP (邻苯二甲酸二异癸酯)、DNOP (邻苯二甲酸二正辛酯)进行限制，其中前三种DEHP、DBP、BBP不得用于儿童玩具和用品中，在塑料中的含量每种不得超过0. 1%。后三种DINP、DIDP、DN0P不得用于能入口的儿童玩具及儿童类物品中，每种含量不得超过0.1%。
目前邻苯二甲酸酯类的检测技术主要有分光光度法、气相色谱法、液相色谱法、红外光谱法、薄层色谱法等。最常采用的检测技术是气相色谱法和液相色谱法，但是监测费用昂贵，需专业人员操作，样品前处理烦琐，很难进行批量处理，难以适应食品业快速诊断的形势。发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种灵敏度高、检测限低、快速简便的从食品样品中测定邻苯二甲酸二丁酯的方法。
本发明解决技术问题的技术方案为一种快速检测食品中的邻苯二甲酸二丁酯的方法，包括以下步骤
a 抑制曲线的建立步骤
在建立邻苯二甲酸二丁酯的抑制曲线之前，先配制不同浓度的标准品。邻苯二甲酸二丁酯标准品用l_2mL的无水乙醇溶解后，用PBS稀释至一系列浓度，分别为IlOOng/ mL、366ng/mL、122ng/mL、40ng/mL、13ng/mL、4. 5ng/mL、l. 5ng/mL、0. 5ng/mL、0. 16ng/mL、 0. 055ng/mL、0. 018ng/mL、0. 006ng/mL。竞争时加入这一系列浓度的标准液，测定结果的平均值经过0rigin6. 0软件处理后绘制成抑制曲线。
(1)包被步骤
用浓度为5 μ g/mL的邻苯二甲酸二丁酯包被抗原(DBAP-OVA)包被96孔酶标板， 每孔100 μ L，放置培养箱37°C温育池后，从培养箱内取出，甩掉孔内溶液，再用洗涤液洗涤并甩干，每次洗涤3-5min，总共洗涤3次。
(2)封闭步骤
在包被好的酶标准版中加入1 %卵清蛋白(OVA)溶液，每孔150 μ L，封闭没有包被抗原的多余的部分，避免抗体的非特异吸附在酶标板上。37°C温育30min后，甩掉孔内溶液，再用洗涤液洗涤并甩干，每次洗涤3-5min，总共洗涤3次；
(3)竞争步骤
每孔加入50 μ L邻苯二甲酸二丁酯(DBP)标准溶液和50 μ L荧光标记的邻苯二甲酸二丁酯抗体使之发生竞争反应。37°C下温育2.证后，从培养箱内取出，甩掉孔内溶液，再用洗涤液洗涤并甩干，每次洗涤3-5min，总共洗涤3次；以除去游离的DBP及抗体结合物。
(4)检测步骤
用多功能酶标仪测定各孔在激发波长为485nm，发射波长为时的荧光强度。
b:样品的检测步骤
除C3)竞争步骤每孔加入50 μ L样品溶液和50 μ L的荧光标记的邻苯二甲酸二丁酯抗体，37°C下温育2.证后，从培养箱内取出，甩掉孔内溶液，再用洗涤液洗涤并甩干， 每次洗涤3-5min，总共洗涤3次；外，其余与a 抑制曲线的建立步骤相同。
为了建立方法的重复性好，以及检测的准确度，需要在样品中加入标准品，进行加标回收实验。
除C3)竞争步骤每孔加入25 μ L样品和25 μ L邻苯二甲酸二丁酯标准溶液，再加入50μ L荧光标记的邻苯二甲酸二丁酯抗体，37°C下温育2.证后，从培养箱内取出，甩掉孔内溶液，再用洗涤液洗涤并甩干，每次洗涤3-5min，总共洗涤3次；外，其余与a 抑制曲线的建立步骤相同。
所述的邻苯二甲酸二丁酯包被抗原通过以下方法制备
称取4-氨基邻苯二甲酸二丁酯0.02488，溶于501^浓盐酸(1211101/1)中，加入1. 5mL蒸馏水，在冰水浴(0-4°C )中搅拌。缓慢加入2mL 0. lmol/L的NaNO2溶液，搅拌 30min后，再加入0. OOlg尿素，除去未反应的NaN02。再缓慢加入20mL溶有80mg卵清蛋白 (OVA)的四硼酸钠的溶液中(pH = 9. 18)，冰水浴(0-4°C)搅拌3- 后，将反应液装入透析袋(MWCO =Nominal :8，000-14，000)，在蒸馏水(pH = 7. 0)中透析5天，每天换水两次，得棕红色邻苯二甲酸二丁酯包被抗原溶液。
所述的荧光标记的邻苯二甲酸二丁酯抗体，通过以下方法制备
免疫抗原的制备步骤
称取4-氨基邻苯二甲酸二丁酯0.02488，溶于5(^1^农盐酸(1211101/1)中，并加入1. 5mL蒸馏水，在冰水浴(0-4°C )中搅拌；缓慢加入2mL 0. lmol/L的NaNO2溶液，搅拌 30min后，再加入0. OOlg尿素，除去未反应的NaNO2 ；
再缓慢加入20mL溶有SOmg牛血清蛋白(BSA)的四硼酸钠的溶液中(pH = 9. 18)， 冰水浴(0-4°C )搅拌3- 后，将反应液装入透析袋(MWCO =Nominal :8，000-14, 000)，在蒸馏水(pH = 7.0)中透析5天，每天换水两次，得棕红色邻苯二甲酸二丁酯免疫抗原溶液
抗体的制备步骤
将棕红色邻苯二甲酸二丁酯免疫抗原溶液与弗氏佐剂以1 1 (ν/ν)混溶，对三只新西兰大白兔进行多次免疫，第一次动物免疫将免疫抗原与弗氏完全佐剂混溶，之后的加强免疫是将免疫抗原与弗氏不完全佐剂混溶，经五次免疫后，制得抗邻苯二甲酸二丁酯抗体。
荧光标记步骤
称取N-羟基丁二酰亚胺0. 004g, N, N' - 二环己基碳酰亚胺0. 006g,和氟硼二吡咯衍生物(BODIPY) 10. %ig，溶于ImL无水的二甲基甲酰胺溶液中，室温Q0_25°C )搅拌过夜。第二天，在上述溶液中加入500 μ L 1，4-二氧杂环乙烷，室温Q0-25°C )搅拌30min;
将250 μ L抗邻苯二甲酸二丁酯抗体与750 μ L 0. 05mol/L,pH 7. 3磷酸缓冲液(PB 溶液)混勻后，逐滴加入上述溶液中，室温O0-25°c)搅拌池后，全部转移入透析袋(MWC0 Nominal =8,000-14, 000)中，在PB溶液中透析过夜，次日从透析袋中取出合成的溶液装入离心管中，避光低温(0-4°C )保存待用；
所述的弗氏佐剂通过以下方法制备
将液体石蜡和羊毛脂按2 1体积比用超声清洗器超声3_4h，使之完全混勻，即滴一滴乳化剂到冰水混合液中半分钟之内不扩散才能算混合完全。此油包水乳化剂称之为不完全佐剂。不完全佐剂低温(0-4°C )贮存，临用前加液体卡介苗即为完全佐剂。
所述的免疫步骤为
选用三只月龄3个月左右，体重为1. 5_2kg左右的健康新西兰雄兔作为免疫对象。 首次注射用含完全弗氏佐剂的抗原进行基础免疫，之后用含不完全弗氏佐剂的抗原加强免疫。用剪刀剪去兔背部，酒精消毒，采用背部皮下多点注射的方法，免疫剂量为0.5mg lmg/kg/次，每次背部皮下免疫10点，每次注射lmL。3周后开始加强免疫，以后每2周再次加强免疫，经5次免疫后，从兔心脏采血，血清室温O0-25°C )静置0. 5-lh，在冰箱) 静止浊后吸取上层澄清的血清。
本发明与现有技术相比，具有以下的特点
本发明采用荧光信号作为检测信号，与传统的酶联免疫技术相比，不需要底物溶液的加入及温育时间，缩短了操作时间；本发明的检测限为0. 003ng/mL，与之前的荧光免疫法技术报道的0. 02ng/mL、0. 05ng/mL相比，均低一个数量级。本发明的灵敏度为0. 66ng/ mL,比之前的荧光免疫法技术报道的10. 53ng/mL相比，低两个数量级；本发明通过免疫动物，制备出了抗DBP的多克隆抗体，通过特异性的考察，得出制备的抗体具有高度特异性； 本发明无需大量的样品前处理过程，节省了检测时间，简化了分析过程，提高了工作效率， 减少了样品处理时的溶剂对测定结果的影响。
综上所述，本发明灵敏度高、快速、特异性强，方法简单、耗时短，适合环境污染物 DBP的快速分析，而且对邻苯二甲酸酯的测定有着重要意义。
图1为实施例本发明的抑制曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细的说明。
牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)Sigma公司
液体卡介苗芜湖新芜区医院
液体石蜡上海试剂有限公司
羊毛脂国药集团化学试剂有限公司
氟硼二吡咯衍生物(BODIPY)见文献(JiaoLJ, Yu CJ, Liu MM, Wu YC, Cong KB, Meng Τ, Wang YQ, and Hao EH. Synthesis and Functionalization of AsymmetricalBenzo-Fused BODIPY Dyes.J. Org. Chem. 2010，75，6035—6038)
其余化学试剂均为分析纯，配制溶液的水均为二次蒸馏水
溶液的配制
(1)包被缓冲液(0. 05mol/L pH 9. 6 碳酸盐缓冲液)称取 1. 59g Na2CO3, 2. 94g NaHCO3，加蒸馏水至IOOOmL
(2)稀释液(0. 01mol/L pH 7. 4 磷酸盐缓冲液，PBS)称取 NaCl 8. Og, NaH2PO4 · 2H20 0. 29g, Na2HPO4 · 12H20 2. 96g, KCl 0. lg，加蒸馏水至 IOOOmL
(3)洗涤液(0. 01mol/L pH 7. 4，PBST) =PBS 中加入 0. 05% 吐温-20
(4)封闭液卵清蛋白(OVA)溶液
(5)透析液(0. 05mol/L pH 7. 3，PB)称取 NaH2PO4 · 2H20 0. 897g, Na2HPO4 · 12H20 5. 999g，加蒸馏水至500mL
实施例1
邻苯二甲酸二丁酯的抑制曲线的建立
(1)包被步骤
浓度为5 μ g/mL的包被抗原DBAP-OVA包被96孔酶标板，每孔100 μ L，放置培养箱37°C温育池后，从培养箱内取出，甩掉孔内溶液，再用洗涤液PBST洗涤并甩干，每次洗涤 3-5min，总共洗涤3次。
(2)封闭步骤
加入OVA溶液，每孔150 μ L，封闭没有包被抗原的多余的部分，避免抗体的非特异吸附在酶标板上。37°C温育30min后，从培养箱内取出，甩掉孔内溶液，然后同上洗涤。
(3)竞争步骤
每孔加入50 μ L DBP标准溶液和50 μ L荧光物质标记的DBP抗体，使之发生竞争反应。37°C下温育2. 5h后，从培养箱内取出，甩掉孔内溶液，同上洗涤，除去游离的DBP及抗体结合物。
(4)检测步骤
用多功能酶标仪测定各孔在激发波长为485nm，发射波长为时的荧光强度。
将实施例取得的荧光强度信号转化为数值，应用0rigin6. 0软件对其结果作图， 如图1所示。该抑制曲线在0.006-1100ng/mL浓度范围内与荧光强度有良好的线性关系。
线性回归方程为Υ = 8984+14556/[1+(Χ/0.66)°_379]，此式中Y为荧光强度，X为 DBP的浓度。检测限为0. 003ng/mL，计算方法见文献(Cao YS, Lu YT, Long SY, Hong JB, Sheng GQ. Development of an ELISA for the detection of bromoxynil in water. Environment International,2005,31,33-42)。
该技术方法的检测限比之前的检测邻苯二甲酸二丁酯的检测限0. 02 μ g/L(Zhang MC，Wang QE，Zhuang HS. A novel competitive fluorescence immunoassay for the determination of dibutyl phthalate. Anal Bioanal Chem,2006，386，1401-1406)， 0.05 μ g/L (Zhang MC, Wang QE, Zhuang HS. Determination of dibutyl o-phthalate by antigen-coated competitive fluorescence immunoassay. Analytical Letters，2007， 40,127-137)均低一个数量级。
在免疫分析中，方法的灵敏度通常用IC5tl表示=IC5tl的值越小，表明分析的灵敏度越高，具体说明见文献(Wang YZ, Wei DP, Yang H，Yang Y，Xing WW, Li Y，Deng AP. Development of a highly sensitive and specific monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of Sudan I in food samples. Talanta，2009，771783-1789)。该技术方法的灵敏度为0. 66ng/mL,比之前的相关文献报道灵敏度为 10. 53 μ g/L (Zhang MC, Wang QE, Zhuang HS. A novel competitive fluorescence immunoassay for the determination of dibutyl phthalate. Anal Bioanal Chem，2006，386，1401-1406)低两个数量级。
综上所述，该竞争荧光免疫分析法检测邻苯二甲酸二丁酯的检测限和灵敏度都较之前的相关文献数值更低，因此适合实际样品中快速简便地进行邻苯二甲酸二丁酯痕量分析。
实施例2
检测全脂牛奶中的邻苯二甲酸二丁酯的含量及加标回收实验
全脂牛奶的预处理步骤称取2. Og全脂牛奶固体粉末(购于芜湖市超市)，溶解于IOmL热(70-90°C)的蒸馏水中，待其冷却后。将2mL无水乙醇加入上述IOmL溶液中，震荡5min,随后在低温下(0-40C ) 10，000转/分钟离心IOmin0离心后，取出试管，去除上层脂肪层，中间的溶液层转移到干净的玻璃容器中，并且用lmol/L NaOH或者lmol/L HCl.调节该溶液PH至7.0，保存在低温(0-4°C )下。
1、检测全脂牛奶中的邻苯二甲酸二丁酯的含量
除
(3)竞争步骤
每孔加入50 μ L处理过的全脂牛奶溶液和50 μ L荧光物质标记的DBP抗体溶液， 使之发生竞争反应。37°C下温育2. 5h后，从培养箱内取出，甩掉孔内溶液，同上洗涤，除去游离的DBP及抗体结合物。外，其余与实施例1相同。
2、全脂牛奶中的邻苯二甲酸二丁酯加标回收实验
除
(3)竞争每孔加入25 μ L处理过的全脂牛奶溶液、25 μ L指定浓度的DBP标准溶液(0. UU10ng/mL)和50 μ L荧光物质标记的DBP抗体，使之发生竞争反应。37°C下温育 2. 后，从培养箱内取出，甩掉孔内溶液，同上洗涤，除去游离的DBP及抗体结合物。外，其余与实施例1相同。
将实施例取得的荧光强度信号转化为数值，计算结果如表1所示。
表 权利要求
1.一种快速检测食品中的邻苯二甲酸二丁酯的方法，包括以下步骤 a:抑制曲线的建立步骤在建立邻苯二甲酸二丁酯的抑制曲线之前，先配制不同浓度的标准品邻苯二甲酸二丁酯标准品用l_2mL的无水乙醇溶解后，用稀释液稀释至一系列浓度，分别为IlOOng/ mL、366ng/mL、122ng/mL、40ng/mL、13ng/mL、4. 5ng/mL、l. 5ng/mL、0. 5ng/mL、0. 16ng/mL、 0. 055ng/mL、0. 018ng/mL、0. 006ng/mL。竞争时加入这一系列浓度的标准液，测定结果的平均值经过0rigin6. 0软件处理后绘制成抑制曲线；(1)包被步骤用浓度为5 μ g/mL的邻苯二甲酸二丁酯包被抗原包被96孔酶标板，每孔100 μ L，放置培养箱37°C温育池后，从培养箱内取出，甩掉孔内溶液，再用洗涤液洗涤并甩干，每次洗涤 3-5min，总共洗涤3次;(2)封闭步骤在包被好的酶标准版中加入卵清蛋白溶液，每孔150yL，37°C温育30min后，甩掉孔内溶液，再用洗涤液洗涤并甩干，每次洗涤3-5min，总共洗涤3次；(3)竞争步骤每孔加入50 μ L邻苯二甲酸二丁酯标准溶液和50 μ L荧光标记的邻苯二甲酸二丁酯抗体，37°C下温育2.证后，从培养箱内取出，甩掉孔内溶液，再用洗涤液洗涤并甩干，每次洗涤3-5min，总共洗涤3次；(4)检测步骤用多功能酶标仪测定各孔在激发波长为485nm，发射波长为528nm时的荧光强度； b 样品的检测步骤除(3)竞争步骤每孔加入50 μ L样品溶液和50 μ L的荧光标记的邻苯二甲酸二丁酯抗体，37°C下温育2.证后，从培养箱内取出，甩掉孔内溶液，再用洗涤液洗涤并甩干，每次洗涤3-5min，总共洗涤3次；外，其余与a 抑制曲线的建立步骤相同。
2.根据权利要求1所述的一种快速检测食品中的邻苯二甲酸二丁酯的方法，其特征在于除(3)竞争步骤每孔加入25 μ L样品和25 μ L邻苯二甲酸二丁酯标准溶液，再加入 50 μ L荧光标记的邻苯二甲酸二丁酯抗体，37°C下温育2.证后，从培养箱内取出，甩掉孔内溶液，再用洗涤液洗涤并甩干，每次洗涤3-5min，总共洗涤3次；外，其余与a 抑制曲线的建立步骤相同。
3.根据权利要求1所述的一种快速检测食品中的邻苯二甲酸二丁酯的方法，其特征在于所述的邻苯二甲酸二丁酯包被抗原通过以下方法制备称取4-氨基邻苯二甲酸二丁酯0.0248g，溶于50 μ L浓盐酸(12mol/L)中，加入1.5mL 蒸馏水，在冰水浴(0-4°C )中搅拌；加入2mL 0. lmol/L的NaNO2溶液，搅拌30min后，再加入0. OOlg尿素，除去未反应的NaN02 ；再加入20mL溶有SOmg卵清蛋白的四硼酸钠的溶液中(pH = 9. 18)，冰水浴(0_4°C ) 搅拌3- 后，将反应液装入透析袋，在蒸馏水中透析5天，每天换水两次，得棕红色邻苯二甲酸二丁酯包被抗原溶液。
4.根据权利要求1所述的一种快速检测食品中的邻苯二甲酸二丁酯的方法，其特征在于所述的荧光标记的邻苯二甲酸二丁酯抗体的制备步骤，包括免疫抗原的制备步骤、抗体的制备步骤、荧光标记步骤 所述的荧光标记步骤称取N-羟基丁二酰亚胺0. 004g, N, N' - 二环己基碳酰亚胺0. 006g,和氟硼二吡咯衍生物10. %ig，溶于ImL无水的二甲基甲酰胺溶液中，室温Q0-25°C )搅拌过夜；第二天，在上述溶液中加入500yL 1，4-二氧杂环乙烷，室温Q0-25°C )搅拌30min ；将250 μ L抗邻苯二甲酸二丁酯抗体与750 μ L 0. 05mol/L,pH 7. 3磷酸缓冲液混勻后， 逐滴加入上述溶液中，室温搅拌池后，全部转移入透析袋中，在0.05mol/L，pH 7. 3磷酸缓冲液中透析过夜，次日从透析袋中取出合成的溶液装入离心管中，避光低温(0_4°C)保存待用；
5.根据权利要求4所述的一种快速检测食品中的邻苯二甲酸二丁酯的方法，其特征在于所述的抗邻苯二甲酸二丁酯抗体通过以下方法制备 免疫抗原的制备步骤称取4-氨基邻苯二甲酸二丁酯0.0248g，溶于50 μ L浓盐酸(12mol/L)中，并加入 1. 5mL蒸馏水，在冰水浴(0-4°C )中搅拌；加入2mL 0. lmol/L的NaNO2溶液，搅拌30min后， 再加入0. OOlg尿素，除去未反应的NaNO2 ；再加入20mL溶有SOmg牛血清蛋白的四硼酸钠的溶液，冰水浴(0_4°C )搅拌3- 后， 将反应液装入透析袋，在蒸馏水(pH = 7.0)中透析5天，每天换水两次，得棕红色邻苯二甲酸二丁酯免疫抗原溶液； 抗体的制备步骤将棕红色邻苯二甲酸二丁酯免疫抗原溶液与弗氏佐剂以1 l(v/v)混溶，对三只新西兰大白兔进行多次免疫，第一次动物免疫将免疫抗原与弗氏完全佐剂混溶，之后的加强免疫是将免疫抗原与弗氏不完全佐剂混溶，经五次免疫后，制得抗邻苯二甲酸二丁酯抗体。
6.根据权利要求5所述的一种快速检测食品中的邻苯二甲酸二丁酯的方法，其特征在于所述的免疫步骤为选用三只月龄3个月左右，体重为1.54kg左右的健康新西兰雄兔作为免疫对象，首次注射用含完全弗氏佐剂的抗原进行基础免疫，之后用含不完全弗氏佐剂的抗原加强免疫 用剪刀剪去兔背部，酒精消毒，采用背部皮下多点注射的方法，免疫剂量为0. 5mg Img/ kg/次，每次背部皮下免疫10点，每次注射lmL，3周后开始加强免疫，以后每2周再次加强免疫，经5次免疫后，从兔心脏采血，血清室温O0-25°C )静置0. 5-lh，在冰箱)静止 2h后吸取上层澄清的血清。
全文摘要
本发明公开了一种快速检测食品中的邻苯二甲酸二丁酯的方法，包括以下步骤a抑制曲线的建立步骤、b样品的检测步骤，本发明与现有技术相比，具有灵敏度高、快速、特异性强，方法简单、耗时短，适合环境污染物DBP的快速分析，而且对邻苯二甲酸酯的测定有着重要意义。
文档编号G01N21/64GK102520153SQ20111042021
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月15日 优先权日2011年12月15日
发明者张明翠, 焦莉娟, 胡玉嵘 申请人:安徽师范大学