一种检测erbb2蛋白的试剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测ERBB2蛋白的试剂盒及其制备方法，涉及化学发光免疫分析【技术领域】，为解决目前ERBB2蛋白超微量检测的技术问题，根据本发明的试剂盒包括：1)ERBB2蛋白校准品；2)链亲和素偶联的固相载体；3)生物素化的ERBB2蛋白配体；4)5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉偶联标记的ERBB2蛋白配体；以及5)所作用的化学发光底物。进一步，根据本发明制备上述试剂盒的方法。本发明主要用途为ERBB2蛋白超微量检测。
【专利说明】—种检测ERBB2蛋白的试剂盒及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及化学发光免疫分析【技术领域】，特别涉及一种检测ERBB2蛋白的试剂盒及其制备方法，结合了生物素-亲和素免疫放大技术和化学发光免疫分析技术。
【背景技术】
[0002]ERBB2 蛋白(又名 HER-2，CD340，NEU, NGL, TKRl，c-erbB-2, HER-2/neu)是原癌基因erbB-2编码表达的细胞膜受体。分子量185kDa。在科研和生产过程中，需要测定溶液中ERBB2蛋白含量变化，来监控实验条件和监控生产过程。
[0003]目前ERBB2蛋白测定方法有胶体金免疫层析(GICA);蛋白质印迹(WB);酶联免疫吸附试验(ELISA)，化学发光法免疫分析(CLIA) ;GICA、ELISA、WB的优点是相对成本低廉，缺点是灵敏度低，ERBB2蛋白含量少的情况下检测不出，CLIA检测灵敏度比上述方法高，但还是不能满足科研上对ERBB2蛋白超微量检测的需要。为了适应科研和生产上对检测灵敏度的更高要求，需要对化学发光技术进行创新。
[0004]1977年，Halmann将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应结合起来，建立了化学发光免疫分析法(CLIA)。经过几十年的发展。目前根据标记物的不同，化学发光免疫分析可分以下四个类型:(I)以辣根过氧化物酶(HRP)为标记物的酶促化学发光系统。该系统的发光底物为鲁米诺及其衍生物，在氧化剂存在下，HRP催化鲁米诺及其衍生物发光，波长425nm。苯酚类化合物可增强其发光强度；(2)以碱性磷酸酶为标记物的酶促化学发光系统。该系统的发光底物为1，2—二氧环乙烷衍生物(或称金刚烷衍生物)。例如 AMPPD, CSPD, CDP-Star, Lum1-phos480, Lumiphos-530 等。表面活性剂会增强并延长其发光强度，发光波长470nm;(3)以吖啶酯类为标记物的化学发光系统。该系统采用直接标记吖啶酯类发光剂，吖啶酯类发光剂在碱性H2O2作用下直接发光，波长430nm处吖啶酯类发光系统发光强度高；(4)以三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+为标记物的电化学发光系统。是通过施加一定的电压进行电化学反应，在电极表面产生电生物质，然后电生物质与体系中三丙胺(TPA)之间通过电子传递形成激发态，之后激发态的能量以光的形式释放出来.在波长350?420nm处发光强度高。
[0005]1982年，Ikarlyama等以氯化血红素代替辣根过氧化酶(HRP),用碳二亚胺法将其标记在人体血清白蛋白(HSA)上，结合酶免疫分析技术，对HSA的化学发光免疫测试进行了初步探讨。他们这一开创性的研究，为金属卟啉在酶免疫分析中的应用奠定了基础。
[0006]1984年，Hara等将铁卟啉配合物标记于HSA抗体上用于检测HSA，并将这一体系应用于分析化学中。
[0007]1992年，Adam等对铁卟啉和锰卟啉的催化机理进行的研究，并与辣根过氧化酶的催化发光效应进行了比较。
[0008]1993年，Motsenbocker等用光敏剂和金属卩卜啉标记抗体进行免疫检测。
[0009]1994年，慈云祥等课题组对于金属卟啉催化剂替代辣根过氧化酶催化化学发光反应也进行了一些探索。[0010]2006年，Komagoe等卟啉诱导的光学生成过氧化氢的测定，用鲁米诺发光法:在水溶液中与卟啉聚集的一个结构活性关系进行研究。
[0011]2006年，Rana等电化学产生过氧化氢和卟啉化学发光法进行了尝试。
[0012]2006年，李春艳等四苯基卟啉锌掺杂8-羟基喹啉铝与四苯基联苯二胺的电致发光性能进行了研究。
[0013]2007年，刘波等发光材料四苯基卟啉及其金属配合物的合成及性能进行了研究。
[0014]2008年，吴俊等卟啉掺杂MEH-PPV的发光性能进行了探讨。
[0015]2011年，D Wu等新型化学发光流动注射分析减少其对鲁米诺-间-四(3_甲氧基-4-羟基)苯基卟啉锰催化过氧化氢的反应进行了研究。
[0016]2012年，Kazemi等对动力学化学发光猛(III)-四(4_磺酸)P卜啉鲁米诺过氧化氢体系的人和牛血清白蛋白的影响进行了研究探索。
[0017]上述研究，主要在卟啉类标记物替代辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶及其他酶促化学发光技术，在过氧化氢等过氧化物，鲁米诺及鲁米诺衍生物为底物基础上进行的探索，取得一些效果，但没有满足科研方面对超微量检测的需求。我们通过实验发现水溶性的5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉在促进吖啶酯和吖啶磺酰胺在非碱性条件下的化学发光效果方面明显优于上述四种常用化学发光常见系统及文献报道，能够提高对超微量被测物的检测能力。
[0018]吖啶酯类发光剂标记物合成后，会有微量发光剂在没有碱性条件刺激下缓慢发光，这点也影响了其长期稳定性及对缓冲液的选择性。5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉化学结构非常稳定，且对酸碱PH值适应的范围宽，可长期稳定保存。
[0019]同时，目前没有发现5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉作为标记物，吖啶酯，吖啶磺酰胺为底物的化学发光法检测ERBB2蛋白的研究及报道。
[0020]生物素-亲和素系统(biotin-avidin system,BAS)具有多级的信号放大作用，并且不增加非特异性干扰，且具有特异性好、稳定性高、和实验成本低等特点。
[0021]本发明结合BAS技术，首次提出采用水溶性5，10，15-三(4_吡啶基)-20-R-羧基卟啉作为标记物构建化学发光免疫检测ERBB2蛋白的方法，该方法集合了 CLIA灵敏度、BAS放大作用和5，10，15-三(4-吡啶基)-20_R-羧基卟啉稳定性，克服了传统CLIA法灵敏度无法满足科研超微量研究的弊端，本发明试剂盒的高灵敏度，稳定性方面5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉作为标记物明显好于常规直接标记吖啶酯，吖啶磺酰胺标记物，发光信号更强，对于检测超微量物质提供了 一个全新的化学发光技术方法。
【发明内容】
[0022]本发明克服了当前化学发光法不能满足对ERBB2蛋白超微量检测的技术问题，即通过生物素-亲和素免疫放大技术结合化学发光技术和水溶性5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉作为标记物构建化学发光免疫分析高灵敏度检测ERBB2蛋白，提供了一种检测ERBB2蛋白的试剂盒及其制备方法。
[0023]本发明采用的技术方案是:
[0024]本发明的目的是提供一种生物素-亲和素免疫放大技术结合化学发光技术和水溶性5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉作为标记物方法，检测ERBB2蛋白的试剂盒。[0025]本发明的再一目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。
[0026]根据本发明的试剂盒包括:1)ERBB2蛋白校准品；2)链亲和素偶联的固相载；3)生物素化的ERBB2蛋白配体；4)5，10，15-三(4-吡啶基)-20_R-羧基卟啉偶联标记的ERBB2蛋白配体；以及5)上述5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉所作用的化学发光底物。
[0027]根据本发明的试剂盒，其中，所述ERBB2蛋白为是原癌基因erbB_2编码表达的细胞膜受体。
[0028]根据本发明的试剂盒，其中，所述ERBB2蛋白校准品为ERBB2蛋白配制的校准品冻干品，校准品内所用的保护基质蛋白为牛血清白蛋白，卵清蛋白。
[0029]根据本发明的试剂盒，其中，所述链亲和素偶联的固相载体为磁性颗粒，塑料颗粒。
[0030]根据本发明的试剂盒，其中，所述ERBB2蛋白配体为可以与ERBB2蛋白特异性结合反应的单克隆抗体、多克隆抗体、基因工程抗体、蛋白质、大分子有机化合物。
[0031]根据本发明的试剂盒，其中，所述5，10，15_三(4-吡啶基)-20_R-羧基卟啉结构
式如⑴所示: [0032]
【权利要求】
1.一种检测ERBB2蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括: DERBB2蛋白校准品； 2)链亲和素偶联的固相载体； 3)生物素化的ERBB2蛋白配体； 4)5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉偶联标记的ERBB2蛋白配体；以及 5)上述5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉所作用的化学发光底物。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述ERBB2蛋白为是原癌基因erbB-2编码表达的细胞膜受体。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述ERBB2蛋白校准品为ERBB2蛋白配制的校准品冻干品，校准品内所用的保护基质蛋白为牛血清白蛋白，卵清蛋白。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述链亲和素偶联的固相载体为磁性颗粒，塑料颗粒。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述ERBB2蛋白配体为可以与ERBB2蛋白特异性结合反应的单克隆抗体、多克隆抗体、基因工程抗体、蛋白质、大分子有机化合物。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉结构式如(I)所示:
7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉偶联标记的ERBB2蛋白配体所用的偶联剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，N，K - 二环己基碳二亚胺(DCC)。
8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉所作用的化学发光底物为吖啶酯、吖啶磺酰胺。
9.一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤: 1)以ERBB2蛋白纯品配制ERBB2蛋白校准品； 2)使链亲和素偶联固相载体； 3)使ERBB2蛋白配体生物素化；.4)用5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉偶联标记ERBB2蛋白配体； . 5)配制化学发光底物液； .6)分装上述ERBB2蛋白校准品、链亲和素偶联固相载体、生物素化的ERBB2蛋白配体、.5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉偶联标记的ERBB2蛋白配体和化学发光底物液；以及 .7)组装为成品。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述制备ERBB2蛋白校准品的步骤I)采用以下方法: 配制含牛血清白蛋白2%，卵清蛋白1.5%，水解明胶0.5%，2.5%蔗糖的0.01M PB缓冲溶液为校准品基质液，用基质液配制含不同浓度ERBB2蛋白的校准品，用西林瓶分装ImL/瓶，冻干处理后，-20°C保存。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述制备链亲和素化固相载体的步骤2)采用以下磁性颗粒方法: .250mg氨基末端磁性颗粒置于烧杯，加入甲醇及丙酮各5mL反复清洗，磁性分离，弃去上清，加入DMF溶解的IOmL0.2%的1，4 一苯二异硫氰酸酯(PDITC)溶液，置于恒温振荡器，反应IOh,最后将反应后的磁性颗粒用丙酮及超纯水反复清洗6遍,取新制备经PDITC活化的磁性颗粒置于30mL离心管中，加入PBS25mL，加入4mg链亲和素，置于恒温振荡器中反应.20min，磁性分离，测定反应前后溶液在280nm的OD值，以PBS清洗3次，收集，加入等量丙三醇，-20°C保存。
12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述制备链亲和素化固相载体的步骤2)采用以下塑料颗粒方法: . 250mg氨基末端塑料颗粒置于烧杯，加入甲醇及丙酮各5mL反复清洗，离心分离，弃去上清，加入DMF溶解的IOmL0.2%的1，4 一苯二异硫氰酸酯(PDITC)溶液，置于恒温振荡器，反应10h，最后将反应后的塑料颗粒用丙酮及超纯水反复清洗6遍，取新制备经PDITC活化的塑料颗粒置于30mL离心管中，加入PBS25mL，加入4mg链亲和素，置于恒温振荡器中反应.20min，离心分离，测定反应前后溶液在280nm的OD值，以PBS清洗3次，收集，加入等量丙三醇，-20°C保存。
13.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述制备ERBB2蛋白配体生物素化的步骤.3)采用以下方法: 将生物素-N-羟基磺酸基琥珀酰亚胺酯(Sulf0-NHS-Biotin)冰箱取出平衡至室温。.0.01M的PBS稀释ERBB2蛋白配体至浓度2mg/mL。称取Sulfo-NHS_Biotin2mg于西林瓶中加超纯水300 μ L，轻轻摇匀活化。立即将活化的生物素溶液54 μ L缓慢加入2mLERBB2蛋白配体溶液中，室温反应30min，反应液用0.01M的PBS透析4°C 8h (换液4次)，收集，加入等量丙三醇，_20°C保存。
14.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述制备5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉偶联标记ERBB2蛋白配体的步骤4)采用以下方法: 将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)冰柜取出平衡至室温，取10mg5，.10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉和20mgEDC分别溶于Iml超纯水中使其溶解，将两者在4°C混合搅拌反应30min，然后向此混合液中缓慢滴加入含30mg/mL ERBB2蛋白配体溶液，室温搅拌反应2h，层析纯化后，-20°C保存。
【文档编号】G01N33/68GK103575900SQ201210253695
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年7月23日 优先权日:2012年7月23日
【发明者】李勇, 胡庆锋, 常立峻, 徐海伟, 陈秀发 申请人:苏州长光华医生物试剂有限公司