专利名称：除去抗A、抗B抗体以及多反应性免疫球蛋白IgG的免疫球蛋白G(IgG)浓缩物的制作方法
技术领域：
本发明涉及除去抗A(AcaA)和抗B(AcaB)抗体的免疫球蛋白G(IgG)浓缩物，其具有明显降低的多反应性，以及涉及获得上述浓缩物的方法。
背景技术：
自从Cohn研制出乙醇沉淀法,富集免疫球蛋白(Ig)成分的人血衆用于各种感染或者先天性缺陷疾病的治疗(Cohn 等，1946, J. Am. Chem. Soc. 68，459; Oncley 等，1949, J. AmChem. Soc. 71, 541).对用于静脉注射(IgIV)的高纯化Ig复合结构的需求越来越多，例如从人血浆中获得。免疫球蛋白的络合物结构(由二硫键连接的四肽链)，以及来自于数千供血者的血浆混合物中存在着的各种抗体，成为目前不能够促进免疫球蛋白生物技术发展的因素。虽然通过基因工程生产单克隆抗体，它们的极端特异性对治疗应用相当于一个缺点，在治疗应用中多种特异性显得是必需的。另一方面，例如，在近些年来的欧洲和美国，例如源自身免疫的许多病理，目前用IgG浓缩物治疗会导致它的一个缺陷。获得免疫球蛋白尤其是IgG浓缩物的方法，除了用乙醇使蛋白选择性沉淀，也可以包含其它各种方法，例如聚乙二醇沉淀法，受控蛋白水解酶法处理……用于除去免疫球蛋白聚合物中的聚集体，这些局集体可以激活与过敏反应危险相关的补充系统。同时，在体内存在于IgGIV中的二聚体和动脉压下降相关(Bleeker W. K.等，Blood, 95，2000，p. 1856-1861).Steinbuch等已描述了一种可选择的方法是乙醇沉淀法(Rev. FraiH . Et. Clin,et Biol. 1969，XIV，1054)，其依赖于辛酸沉淀。这种酸沉淀了绝大多数的血浆蛋白，并把免疫球蛋白留在上层清液中。通过阴离子交换剂DEAE纤维素来提纯这些免疫球蛋白，提纯的条件是该阴离子交换剂不保留IgG。接着对非保留IgG的成分进行浓缩。同时使用色谱技术已经研发了各种方法增加产品的纯度。特别提及是的专利申请EP O 703 922和WO 99/64462，其为至少两个相关联的连续色谱分析步骤，一个使用阴离子交换，另一个使用阳离子交换。这些方法的特异性在于该阴离子交换剂的性能，在传统的色谱分析条件下不会阻留免疫球蛋白G，但是它们反而在预提纯步骤中固定共纯化大多数其它蛋白。也可以引用由申请人提交的类似专利申请WO 02/092632，其公开了在阴离子交换剂上，在碱性PH下使用单个色谱分析步骤制备Ig浓缩物，在色谱分离介质上将它们固定。然而，许多科学刊物指出通过上述分馏技术获得的IgG的注射会导致接受治疗的患者偶尔会出现溶血现象，有时还很严重。例如，可以引用以下文献=Buchta C等，Biologicals, 33, 2005,41-48, Wilson J. R.等，Muscle & Nerve, 29(9), 1997, 1142-1145, Copelan E.A.等，Transfusion, 26，1986，410_412and Misbah S. A.等，Drug Safety, 9，1993，254-262.对患有溶血的病人血液影响的研究，尤其是使用直接抗人球蛋白试验(直接抗人球蛋白试验-DCT)进行的研究，显示红细胞表面被直接抑制抗原A、B或者D的免疫球蛋白覆盖，因此导致溶血。这就是为什么在市场上可得到的IgG是通过选择性血浆获得的，以避免存在抗-D免疫球蛋白，或在抗体-A或抗体-B中滴定度高的其他抗体。Buchta等引用上述文献，考虑通过不同途径使源于O和B血型供体的抗A抗体、源于O和A血型供体的抗B抗体和血浆衍生物例如IgG显著减少，这是为了使溶血的风险降到最低，当使用这些血浆衍生物治疗患者的时候，该溶血风险与这些抗体的水平直接相关。特别要正视选择供体，去除抗A和抗B抗体，生产源于特定血型(A和/或B血型)血浆的衍生物，以及排除那些具有高滴定度抗A和抗B抗体的血浆的批次。考虑到成本或提取步骤的复杂性，一些方法被认为是不现实的。应当注意在上述乙醇分馏期间，部分除去了抗A 和抗B抗体。由于对IgG的需求不断地增加，也就需要逐渐增大的供者库，统计学上将包括更多的O型血的供者。因此，血浆衍生物如IgG将包含大量抗A和抗B抗体，由于这些抗体的浓度太高，通过传统分馏很难去除。这些增加的需求使得只从AB血型中选择以确保低含量的抗A和抗B抗体成为不可能。在使用欧洲药典(1997)的2. 6. 20实验时，每批纯化的IgG浓缩物或制备受抗A和抗B抗体限制,该实验是间接Coombs测试(间接Coombs测试-ICT)的体外应用。ICT测试包括加入红细胞悬液，涂以包含于IgG浓缩物的IgG型抗A和抗B抗体，IgG浓缩物是一种针对人IgG的抗体(抗球蛋白)溶液。与抗A和抗B抗体结合的这些抗体附着于红细胞，因此导致通过IgG之间桥结构形成凝集。抗A和抗B抗体的含量检测受到了血液血清试验(Coombs试验)中常规试验直接启发。依照欧洲药典，在稀释比为l:64、IgG溶液的起始浓度减少至30g/l进行的ICT测试条件下，IgIV不能显示A或B型红细胞的任何凝集。这就是被测试的IgG样品必须稀释以达到滴定度的原因，即最后稀释数值不再引起凝集反应。依据欧洲药典，IgIV溶液的阴性ICT结果为低于1:64稀释度，该结果表明抗A和抗B抗体的低含量是可接受的。然而，欧洲药典规定，即使IgG浓缩物在实验中得到阴性结果，即其稀释度低于1:64，仍不能够排除溶血反应的危险(Buchta等，如上所引)。应指出美国和日本的药典没有对需要控制抗A和抗B抗体剩余含量进行规定。如上所述，用乙醇分馏法在制备IgG浓缩物期间抗A和抗B抗体被部分除去，然而，其剩余含量可能超过了欧洲药典规定的上限。另外，依据申请人在其专利申请WO02/092632中描述研究的方法制备的浓缩物的抗A和抗B抗体剩余含量比通过乙醇分馏法制备的浓缩物的剩余含量含量更高。由于一些批次的IgG浓缩物的抗A和抗B抗体的含量超过了欧洲药典限定值，因此需要对IgG浓缩物进行额外的纯化。一种除去IgG浓缩物中抗体的方法，其包括使用免疫吸附剂作为基质，用亲和色谱法纯化类似于A和B血型抗原的低聚糖，所述的低聚糖具体的是接枝在色谱基质上的三糖。例如，由 Mazid Μ. A.等，J. Appl. Biomater.，3 (I)，1992，9-15 出版的刊物,提及使用含有二氧化硅颗粒的色析法介质，其表面接枝了合成低聚糖的半抗原，其特征为A和B型血，尤其是A型-三糖。此外，Hout M.S.等(ASAI0 J, 46 (6),2000, 702-706)描述了用特定的抗A和抗B抗原接枝的管状纤维膜除去全血中的抗A和抗B抗体。也有报告指出，色析法介质性质非常稳定，这限制了所关注浓缩物中的残留半抗原的释放。专利申请WO 01/27623描述了一种获得A和B血型中去特异性抗体血浆的方法，即一种适合于任意接受者的血浆。这些特异性抗体实质上是免疫球蛋白M(IgM)所携带的。去特异性的获得包括先通过与A血型试验性亲和性高的介质，然后通过与B血型试验性亲和性高的介质。如果同时出现抗A和抗B (O型血)，则有必要连续通过两种介质载体。市场购买IgG浓缩物的一个其它特征是它们的多反应性。应想起多克隆抗体如IgG通常与单个抗原决定基(抗原基序)以独特的方式结合。然而，这种抗体严格特异性有时候可以延伸至其它抗原基序，然而，与第二抗原表位的亲和性比与名义上的基序的亲和性要弱。多克隆IgG可以对具有如肌动蛋白、肌球蛋白、三硝基苯基修饰白蛋白的结构作出更大或更少程度的反应。在这一方面，通过多克隆人类IgG制备静脉注射用的免疫球蛋白(IglV)，其包括-直接抑制外部抗原和由免疫过程产生的免疫抗体；-识别细胞内的蛋白、表面膜抗原、自身循环蛋白和其它抗体可变区的天然抗体。后者则称为抗个体型抗体(Kazatchkine M. D.等，Immunol. Rev. , 139, 1994, 79-107).天然抗体不是由目的性免疫法导致的(Coutinho A.等，Curr. Opin.Immunol. , 7, 1995,812-818)。由于表现出对自体抗原不同的亲合性，因此具有多反应性(Berneman A.等,Eur. J. Immunol. , 22, 1992, 625-631and Lacroix-Desmazes 等,J.Tmmunol. Methods, 216, 1988, 117-137)。IgIV的化学处理(6M尿素、I. 3M硫氰酸钠和酸处理pH=2. O)可以增加这些多克隆免疫球蛋白多反应性活性(Bouvet J.P.et al，J. Autoimmun.，16 (2)，2001，163-172)。然而，用所述的免疫球蛋白治疗患者不曾证明其有益的效果。总之，在制备IgIV过程中抗体的多反应性活性归结如下-在各自血浆中存在天然抗体，-在各自血浆中存在抗个体型抗体，-制备方法产生的抗体的多反应性。因此，一些学者认为多反应性是IgG内在特性，因此天生存在于人体内。另一些学者证明了纯化单克隆或多克隆IgG能够显示其纯化前未检测出的多反应性。甚至从血浆中制备IgG的方法也会产生多反应性，其转变为氧化性“应激”和在制备过程中IgG的部分羟基化作用。这被Bouvet J. P 等证实，Journal of Autoimmunity, 16，2001，pp. 163-172,他特
别用尿素来处理多克隆IgG而使其变得更高的多反应性，在该文件中，也指出了临床应用中IgG的部分疗效归因于它们的多反应性。因此可以通过天然多反应性IgG和常规提纯法获得的多反应性IgG说明这些IgG浓缩物多反应性，这占所有多价IgG的O. 5%-1%。使用IgG制剂来治疗患者可能需要最多至l-2g/kg的高剂量给药。这些剂量为短期治疗，例如，一天7-10倍患者生理IgG量。结果，通过IgG浓缩物生产方法产生的多反应性IgG的给药水平可导致不良副作用如发烧、恶心或头疼。因此，必需进行天然抗体多反应性和抗个体型抗体的区分，如申请人在其专利申请EP I 059 088中所示，通过制备方法产生的抗体具有优点。申请人在其专利申请EP I059 088已显示在血浆中含天然多反应性IgG的成分，是从人多价IgIV分离出来，由于需要更小剂量的成分，在治疗特定炎性疾病如类风湿性多发性关节炎上有优势。因此，为了避免红细胞溶血反应和在治疗过程中给予大剂量的IgG而产生的相关副作用，看起来需要使用用于治疗的特别用于静脉注射的显著去除抗A和抗B抗体的IgG浓缩物，与市售IgG浓缩物相比，优选大幅度降低生产方法产生的多反应性，同时应具有相对于免疫疗法至少相同的功效。
发明内容
因此，本发明涉及用于治疗用途的免疫球蛋白G浓缩物，其特征在于抗A和抗B抗体的各自含量在体外间接Coombs实验结果为阴性。本发明也涉及制备免疫球蛋白G的方法，通过该方法有可能不产生多反应性抗体，这些多反应性抗体与天然和抗个体型抗体相比更不太好耐受。因此，通过该方法获得的IgIV比其它试验的IgIV有着更低的多反应性。本发明这些浓缩物的IgG优选从已富集IgG的血浆或血浆成分中获得多克隆IgG。治疗用途的IgG浓缩物具有的IgG浓度为目前经常使用的浓度，优选在50和100g/l之间。这些浓缩物将用于临床使用，特别是可由静脉途径注射。为此，它们必需对病毒安全，可以任意含有赋形剂，如符合临床使用的稳定剂。本申请人已发现可以提供所述IgG浓缩物，其含有抗A和抗B抗体含量大大低于标准IgG浓缩物中的含量，标准IgG浓缩物即通过乙醇分馏法和/或使用色谱分析相关纯化技术获得的浓缩物，如上所述，并不考虑经过附加处理以以除去抗体的浓缩物。此外它们的含量远低于欧洲药典接受的下限，其很显著地限制了一些接受治疗患者溶血的风险。当本发明的IgG浓缩物进行试验以评估抗A和抗B抗体数量时，可以观察到抗人类IgG抗体存在的情况下，A，B和/或AB型体外红细胞凝集试验结果显示为系统阴性，特别是在欧洲药典方法规定的起始浓度30g/l条件下。因此用本发明的IgG浓缩物，甚至使用同样即非稀释的IgG样品进行前面定义的间接Coombs实验得到系统阴性结果。因此表明在这些浓缩物中抗A和抗B抗体的含量通过ICT实验已经检测不到。假如在IgG浓缩物中抗A和抗B抗体的水平非常低，那么IAT实验就不能再使用，甚至在欧洲药典规定的条件下也不能使用，这是因为不再发生红细胞凝集反应了，甚至在加入抗人类IgG抗体的条件下也不再发生，这是由于抗A和抗B抗体的稠密度太小以至于不允许红细胞之间通过固定到红细胞和抗人类IgG抗体的抗A和抗B抗体的结合形成桥结构。然而有可能检验到这些抗A和/或抗B抗体以非常低浓度存在，这是通过引起固定这些抗体的红细胞的免疫性溶血，以及通过对与传统浓缩物相比较的消耗的测定来检验，该传统浓缩物未经过除去抗A和抗B抗体处理。免疫性溶血是种特殊的免疫反应，其发生在抗体附着于补体因子出现的靶。补体活动的活化引起穿孔蛋白的释放，其会穿透红细胞膜让血红蛋白逸出。那需要敏感的方法如利用放射性示踪剂(参见下文)来测量释放血红蛋白量，正比于存在的抗A和抗B抗体量。本申请人已用特别方便的方法证明本发明的IgG浓缩物含抗A抗体不超过23ng/mg,特别是在19和23ng/mg之间，含抗B抗体不超过20ng/mg,特别是在12和20ng/mg之间。有利地，本申请人发现也可提供具有极低含量的多反应性IgG的所述IgG浓缩物，特别是通过制备方法产生的IgG浓缩物，从而赋予该浓缩物接近非多反应性特性，该浓缩物与现有技术中的IgG浓缩物一样对于免疫疗法的治疗有效。生产方法所导致的多反应活性的IgG的显著减少，使得在需要高剂量浓缩物的治疗后发生副作用的危险降低。
另外，有利的方面是有可能改善副作用，该副作用是由制备方法而产生的IgG浓缩物中的多反应性IgG的存在所引起的，多反应性IgG的存在尤其是在纯化法过程中氧化“应激”和羟基化作用所产生。多反应性IgG残留含量优选包含在O. 01%和O. 1%之间，尤其在O. 07和O. 1%之间。在本发明条件下，多反应性IgG含量意指摩尔或重量百分数。由申请人在专利申请I 059088描述的方法确定该含量。因此，通过有效成分中几乎不含有抗A和抗B抗体来定义本发明的IgG浓缩物，其直接针对红细胞出现的抗原决定基。IgG浓缩物存在于合适的稳定剂中，可以为液态或冻干粉形式，也可以储存以备后用。申请人在其专利申请WO 2004/091656 A2中公开了那些有利的稳定剂，即糖醇的混合物，优选甘露醇、山梨醇或它们的异构体，甘氨酸和非离子去污剂如Tween 80、Tween 20、Triton xioo或Pluronic F68的混合物,所有三种化合物都是药学上可接受的。申请人:确定浓缩物的制剂是稳定的液态和/或冻干形式。浓缩物中最终甘露醇的浓度优选在30g/l和50g/l之间，去污剂的浓度在20和50ppm之间，以及甘氨酸的浓度在7g/l和10g/l之间。这些化合物的浓度表示在IgG浓缩物的最终浓度。所述IgG浓缩物用于治疗用途，特别如前面所示，可经静脉内途径注射。为此，本发明的IgG浓缩物在使用传统溶剂一去污剂处理方法时必需是病毒安全的，例如现有技术中公知的如使用Tween 80/ΤηΒΡ或Triton xioo/TnBP的混合物、和/或过滤步骤以任意除去病毒和/或其他的大分子，它们可能在溶剂一去污剂杀病毒剂处理时没被除去，例如，蛋白感染素一传播海绵状脑病的重要因素。本发明还涉及获得例如上述IgG浓缩物的方法，其包括以下步骤a)通过乙醇分馏法和/或层析分离制备IgG浓缩物，联合病毒灭活步骤，b)通过介质载体的混合物对所述IgG浓缩物渗滤，以进行免疫亲和层析，该介质载体的基质用类似A和B血型抗原的低聚糖组接枝，并c)过滤以除去病毒和/或超过20nm大小的颗粒。申请人:发现用非凡的方法，不仅可以有利于工业销售，而且结合各种步骤可以用特殊的步骤除去抗A和抗B抗体，以制备IgG浓缩物。有可能获得本发明的用于治疗用途的IgG浓缩物，也可以优选包含多反应性IgG的含量相对于总IgG含量低于O. 1%。另外，在所述的浓缩剂中，不希望含有的抗A和抗B抗体的含量低于欧洲药典实验所述的下限，甚至所述非稀释样品的ICT实验结果为阴性。优选的该方法的步骤a)本身是获得如前面提及的IgG浓缩物的一种方法。它涉及到由Cohn等发展的乙醇分馏法或层析分离法，在EP 0703922和WO 99/64462有叙述的例子。特别优先的是申请人在专利申请WO 94/29334和WO 02/092632 Al公开的方法，更具体的是在WO 02/092632 Al所描述的。在这种情况下，本发明方法的步骤a)包含通过沉淀来自血浆或来自血浆IgG富集成分的脂质污染物的预纯化，在碱性PH下进行单个阴离子交换树脂色谱分析，在一个步骤中使用PH值为4-7的合适的缓冲液选择性洗脱IgG。本方法的步骤a)包括病毒灭活处理,优选使用如Horowitz在专利US 4764 369中描述的溶剂-去污剂法。明智的是在步骤a之前进行，或者如果适宜的话在随后色谱法步骤前进行，以除去这一处理化学残留物。收集的IgG成分已充分浓缩，然后可以通过超滤和灭菌过滤进行其它浓缩步骤。然后在两种介质混合物上对该浓缩物进行免疫亲和层析，该介质混合物用与A和B血型相似的抗原组接枝，优选使用载有所述介质混合物的柱子。色析法的介质优选包含琼脂糖型的天然交联聚合物基质，其上间隔基或偶联臂随后用低聚糖接枝，优选的是相应于A和B血型抗原决定基的三糖。特别地，使用所述相应于血型A的抗原决定基的三糖的介质获得了非常好的结果，其结构为N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)-半乳糖(Gal)-岩藻糖(Fuc)，而且那些相应于血型B的抗原决定基的具有半乳糖-半乳糖-岩藻糖结构。所述介质为非常方便的从市场购买的凝胶或树脂，其商品名是Glycorex Transplantation AS (Sweden)的 GLYC0S0RB Λ BOK例如,如果使用该介质,符合血型A的抗原决定基的三糖具有如下结构
权利要求
1.治疗用免疫球蛋白G(IgG)浓缩物，其特征在于抗A和抗B抗体的各自含量符合体外间接Co omb s测试的阴性结果。
2.根据权利要求I的免疫球蛋白G(IgG)浓缩物，其具有抗A抗体的含量不超过23ng/mg IgG,抗B抗体的含量不超过20ng/mg IgG。
3.根据权利要求I或2任一项的免疫球蛋白G浓缩物，其多反应性IgG的剩余含量相对于总IgG含量为O. 01%和O. 1%之间，特别为O. 07%和O. 1%之间。
4.根据权利要求1-3任一项的浓缩物，包含使得所述浓缩物可以贮存的稳定剂。
5.根据权利要求1-4任一项的浓缩物，其中稳定剂是糖醇，优选甘露糖醇或山梨糖醇，甘氨酸和非离子型去污剂的混合物。
6.根据权利要求1-5任一项的浓缩物，可经由静脉途径注射。
7.获得根据权利要求1-6任一项IgG浓缩物的方法，包括以下步骤 a)通过乙醇分馏法和/或层析分离联合病毒灭活步骤制备IgG浓缩物， b)通过将所述IgG浓缩物在介质混合物上进行渗流以对其进行免疫亲和 层析，该介质混合物由具有类似A和B血型抗原的低聚糖组接枝过，并 c)过滤以除去病毒和/或超过20nm大小的颗粒。
8.根据权利要求7的方法，其中步骤a)包含通过沉淀来自血浆或来自血浆富含IgG成分的脂质污染物的预纯化过程，在碱性PH下进行单个阴离子交换树脂色谱分析，并且在一个步骤中使用PH值为4-7的缓冲液选择性洗脱IgG。
9.根据权利要求7或8的方法，其中低聚糖组是相应于A和B血型表位的三糖。
10.根据权利要求9的方法，其中相应于血型A的表位的三糖，其结构为N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)-半乳糖(Gal)-岩藻糖(Fuc)，相应于血型B的表位的三糖具有半乳糖-半乳糖-岩藻糖结构。
11.根据权利要求7-10任一项的方法，其中使用溶剂去污剂进行病毒灭活步骤。
12.根据权利要求7-11任一项的方法，其中介质载体混合物由与A血型和B血型类似抗原的组分进行接枝，其比例各自为25/75和75/25 (v/v)之间，优选50/50 (v/v)的各自介质载体。
13.根据权利要求7-12任一项的方法，其包含通过超滤和灭菌过滤的浓缩步骤。
14.根据权利要求7-13任一项的方法，其中过滤除去病毒为采用纳滤。
15.根据权利要求7-14任一项的方法，在步骤c)后包含加入稳定剂以便于所述IgG浓缩物贮存的步骤。
16.如权利要求1-6任一项定义的免疫球蛋白G的浓缩物中抗A和抗B抗体的测定法，包含步骤如下 a)制备并标定A型血和B型血的红细胞悬浮液， b)用稀释过的IgG溶液样品接触所述红细胞，并将获得的混合物培养一段预定的时间， c)在经荧光剂标记过的抗IgG抗体存在下培养所述红细胞，和 d)用流式细胞计测定在步骤c)中获得的红细胞悬浮液。
17.在如权利要求1-6任一项定义的免疫球蛋白G的浓缩物中抗A和抗B抗体的测定法，包含步骤如下a)用适宜的放射性标记物放射性标记预先计算的选自A、B、AB和O血型番木瓜酶处理的红细胞悬浮液， b)用预定体积的IgG浓缩物的样品接触放射性标记的红细胞， c)加入与步骤b)相同体积的血型AB的正常血清， d)培养在步骤c)获得的混合物一段预定时间，和 e)测定因此获得的培养溶液的放射性。
全文摘要
本发明涉及一种用于治疗的免疫球蛋白浓缩物，其中在体外间接Coombs实验中抗-A和抗B抗体的各自含量为阴性结果。该IgG浓缩物的多反应性IgG含量相对于IgG总量为在0.01%-0.1%之间，尤其是在0.07-0.1%。
文档编号G01N21/64GK102921004SQ20121041202
公开日2013年2月13日 申请日期2006年12月26日 优先权日2005年12月26日
发明者阿布德萨塔·什图鲁, 弗雷德里克·戴诺, 菲利普·保兰托纳奇 申请人:分馏和生物工艺法国实验室公司