专利名称：电感耦合等离子体质谱在氯高铁血红素药物检测中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物医药技术领域，具体涉及电感耦合等离子体质谱在氯高铁血红素药物检测中的应用。
背景技术：
铁是一种非常重要的金属元素，同时也是人体必须的微量元素。缺铁是世界范围内最常见的微量元素缺乏症，影响的人群包括成人、儿童、孕妇等达到了 20亿人。由于铁缺乏症的普遍性与严重性，许多国家都要求将补铁纳入日常饮食中。目前的研究中铁以非血红素铁制剂为主，以强化铁的形式在膳食中出现。但是血红素铁是一种生物态铁，不会产生消化道刺激症状，吸收率高，影响吸收的因素少，容易获得，是一种比较理想的补铁剂。氯高铁血红素是血红素铁的稳定存在形态。现在市面上有各种各样的补铁剂，包括血红素铁和非血红素铁。通常都认为血红素铁的吸收要优于非血红素铁。血红素铁的基本结构成份是由吡咯组成的卟吩，带上侧链后形成卟啉，再和一分子亚铁构成化合物。当它一旦与珠蛋白分离后即自动氧化成三价铁。所以血红素铁是非常不稳定的。氯高铁血红素中的铁化学价为三价，是稳定的氧化态。和极易被氧化的血红素相比，用氯高铁血红素开展有机铁的吸收变得非常有意义。Villairoel和Jahn在体外Caco-2水平研究铁吸收时，也都支持了这一观点。血红素铁是一种生物态铁，吸收率高，影响吸收的因素少，不会产生消化道刺激症状，是一种比较理想的补铁剂。全世界每年可利用的畜禽血液资源相当可观，但是大部分屠宰场的血液都被废弃了。如果从中提制出的氯高铁血红素可以开发为补铁药，将会充分利用牧区的天然优势，有效的发挥血红蛋白的经济效益和社会效益。氯高铁血红素的化学结构式如下
权利要求
1.测定动物(例如大鼠)血浆中稳定性同位素58Fe浓度的方法，该方法是使用ICP-MS法进行测定，其包括以下步骤 (1)提供电感耦合等离子体质谱仪(其例如ThermoSCIENTIFIC的型呈为X SERIES2的 ICP-MS 仪); (2)确定ICP-MS的工作条件； (3)提供稳定性同位素58Fe金属粉末、标记后的氯高铁血红素、内标元素(例如锗元素)、曲拉通等； (4)配制标准溶液和内标溶液(例如分别配制含58Fe浓度为2mg/mL的储备液，溶剂例如可以是I. 79Γ2. 3%的硝酸；例如分别配制含锗浓度为lmg/mL的内标溶液，溶剂例如可以是I. 79Γ2. 3%的硝酸，溶剂例如可以是2%的硝酸)； (5)ICP-MS稀释剂的配制(在一个实施方案中，该ICP-MS稀释剂中含有水、曲拉通、硝酸和丁醇。在一个实施方案中，该ICP-MS稀释剂中曲拉通、硝酸和丁醇三者的重量比为I :4.5-5. 5 :180-220。例如该ICP-MS稀释剂中曲拉通、硝酸和丁醇三者的重量比为1:5:200。例如按照1:5:200的比例，用去离子水配制ICP-MS稀释剂，使得去离子水中曲拉通、硝酸和丁醇的比例分别O. 01%、O. 05%和2%)； (6)标准曲线的建立取Eppendorf管9个，加入58Fe对照品溶液50μ L，于37° C恒温水浴挥干后，分别加入大鼠空白血浆50 μ L，混匀后加入所配制的ICP-MS稀释剂，使得58Fe在血浆中的浓度分别为0、5、10、20、50、100、200、800、1000ng/mL，涡旋混合30秒，借助三通装置，进行在线加入内标(锗，50ng/mL)，进样测定，以校正后的响应值ICPS为纵坐标，浓度C(ng/mL)为横坐标，进行回归，得58Fe的标准曲线； (7)血浆中58Fe的浓度测定取含有58Fe(例如服用含58Fe的物质)的动物(例如大鼠)血浆样品50 μ L至Eppendorf管，加入ICP-MS稀释剂950 μ L，混匀后置冰箱(4° C)冷藏，进样测定，用步骤(6)所得标准曲线确定血浆中58Fe的浓度。
进一步地，其中所述ICP-MS的工作条件为离子源为ICP源，采用石英玻璃同心雾化器(O. 8mL/m)，整体型石英炬管，I. 5mm 口径喷射；雾化器氩气的流量为O. 6 O. 8L/min ;检测模式为CCT模式(使用含7%(v/v)H2的He作为碰撞气)；检测器模拟级电压为1880v，检测器脉冲级电压为3812v，射频功率为1300 ，冷却气流量为ll.(Tl5. OL/min，样品提升量为lmL/min，样品提升时间为40s，重复次数为3次，分别选择铁Fe (54，58)，镍Ni (58)，铬Cr (53)，锗Ge (72)为扫描元素，扫描方式为跳峰扫描。
2.根据权利要求I的方法，其中所述ICP-MS的工作条件中，冷却气流量为12.(Γ14. OL/min。
3.制备58Fe标记的氯高铁血红素的方法，该方法包括以下步骤使用58Fe和盐酸或氯化氢气体，在无氧条件下制备无水氯化亚铁；以此无水氯化亚铁为原料与酸化的原卟啉钠反应，经过后处理制备出以58Fe标记的氯高铁血红素。
4.根据权利要求3的方法，该方法包括以下步骤 (1)称取铁粉于圆底烧瓶中，加入水(例如无氧水，例如纯净水加热至沸，充入氮气至饱和的无氧水)，确保铁粉完全浸于水中，无附于瓶壁上(在本步骤中，铁粉与水的重量比可以为I :80 120，例如约I :105)； (2)在90 120°C(例如约110° C)加热，同时通入HCl气体(例如新生成的HCl气体，例如由浓硫酸和氯化钠新生成的HCl气体)至水中，Fe粉表面有大量微小气泡产生，直至Fe粉完全消失，整个溶液澄清透明，停止通入HCl气体； (3)在旋转蒸发仪上旋干水，同时给予氮气保护，得到淡绿色的FeCl2粉末； (4)称取原卟啉钠，用约8(Γ120倍量的DMF溶解，加入适量浓盐酸酸化，充分振荡超声，使PH控制呈中性；以甲醇稀释，观察稀释液澄清，呈酒红色，无不溶颗粒；(在本步骤中，原卟啉钠的取用量可以是铁用量的8 10倍，例如8. 5^9. 5倍，例如约9倍。在本步骤中，加入适量浓盐酸酸化，使pH = 7±0. 3，例如使pH = 7)； (5)将酸化的原卟啉钠的DMF溶液转移至盛有FeCl2粉末的圆底烧瓶中(在本步骤中，原卟啉钠的取用量可以是铁用量的8 10倍，例如8. 5^9. 5倍，例如约9倍)；油浴升温至液内温度为130±2° C，隔一段时间取样，甲醇稀释以HPLC分析，监测产物生成及原料减少情况，待产物生成基本达到平衡时，停止反应(反应时间共计12h左右)； (6)取反应终液，置旋转蒸发仪上85°C加热，旋干DMF至只有5-10mL的DMF剩余，取下反应瓶，冷却，加入大量的蒸馏水洗涤，使产物充分析出； (7)向含有产物的混悬液中加入浓盐酸，使其pH< I ;超声振荡30min，静止；采用布氏漏斗和抽滤瓶抽滤，布氏漏斗上垫有两层混合滤膜，抽干后，再以蒸馏水洗涤沉淀至滤液呈中性；刮下滤饼，烘箱80° C烘干，以研钵研磨固体，得到细且均一的粉末，即为产物。
5.根据权利要求4的方法，其还进一步包括以下将所得产物进行重结晶的步骤 (8)称取I重量份(例如O.2g)步骤(7)所得产物，置于烧杯中，加入5(Γ100重量份(例如约75重量份)DMF，超声溶解后过滤，以1(Γ20重量份(例如约15重量份)DMF洗涤滤饼，合并滤液；称取1(Γ15重量份(例如约13重量份)表面活性剂氯化苄基十二烷基二甲胺溶于水中(制成浓度4 6%，例如约5. 2%的溶液)，在恒温磁力搅拌器上加热至90° C ;将滤液倒入表面活性剂溶液中，90° C下搅拌加热IOmin ；以滴液漏斗缓慢向其中滴加18%的盐酸溶液(其使用体积约为表面活性剂溶液体积的40%);停止加热和搅拌，静置3h，抽滤，刮下滤饼，烘干，即得。
6.一种58Fe标记的氯高铁血红素的结晶，其基本上具有如图8所示的X射线衍射图，和/或，其基本上具有如图6a所示的红外光谱。
7.研究铁络合物在动物体内的药动学行为的方法，其包括使用权利要求3-5方法所制备的58Fe标记的氯高铁血红素给予动物服用，按预定时间采集血液样本，再按权利要求1-2所述方法检测58Fe的含量。
8.权利要求3-5方法所制备的58Fe标记的氯高铁血红素或者权利要求1-2所述方法在研究铁络合物在动物体内的药动学行为中的用途。
9.权利要求3-5方法所制备的58Fe标记的氯高铁血红素或者权利要求1-2所述方法在研究(未标记的)氯高铁血红素吸收机制中的用途。
10.铁络合物在制备用于测试生物体吸收有机铁的试药中的用途。
11.根据权利要求10的用途，其中铁选自54Fe、55Fe、56Fe、57Fe、58Fe、59Fe,优选58Fe;和/或，其中铁络合物是氯高铁血红素。
12.氯高铁血红素在制备用于测试生物体吸收有机铁的试药中的用途。
13.根据权利要求12的用途，其中所述氯高铁血红素中的铁是同位素铁，例如选自54Fe、55Fe、56Fe、57Fe、58Fe、59Fe,优选58Fe ;和/或，其中所述氯高铁血红素中的同位素铁是外源性的。
14.同位素铁标记的氯高铁血红素。
15.根据权利要求14的氯高铁血红素，其中所述的同位索铁选自54Fe、55Fe、56Fe、57Fe、58Fe、59Fe,优选 58Fe。
16.电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法在含金属药物体内分析与药动学研究测试中的应用；进一步地，其中所述含金属药物是金属络合物；进一步地，其中所述含金属药物是氯高铁血红素；进一步地，其中所述含金属药物是氯高铁血红素，所述铁是同位素铁58Fe。
全文摘要
本发明涉及电感耦合等离子体质谱在氯高铁血红素药物检测中的应用。测定动物血浆中稳定性同位素铁浓度的方法使用ICP-MS法进行测定，步骤提供电感耦合等离子体质谱仪；确定ICP-MS的工作条件；提供稳定性同位素铁粉末、标记后的氯高铁血红素、内标元素等；配制标准溶液和内标溶液；ICP-MS稀释剂的配制；标准曲线的建立；血浆中同位素铁浓度测定取含有铁的动物血浆样品样品管，加入ICP-MS稀释剂，混匀后置冰箱冷藏，进样测定，用所得标准曲线确定血浆中铁的浓度。本发明方法具有良好的性能，例如该方法具有良好的定量下限、精密度、绝对回收率试验、样品稳定性、介质效应和质量控制要求，可以作为分析生物样品例如血浆中稳定性同位素铁的含量测定方法。
文档编号G01N27/62GK102967649SQ20121048352
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月23日 优先权日2012年5月24日
发明者陈西敬, 赵娣, 江骥, 胡蓓, 张永杰, 王越, 张训缨, 唐明清, 刘进兵, 王子厚 申请人:新疆科丽生物技术有限公司