专利名称：一种核桃蛋白elisa检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种核桃蛋白ELISA检测试剂盒，具体是一种核桃蛋白含量检测的酶联免疫试剂盒，特别是检测食品(如，核桃粉、乳)中核桃蛋白含量的酶联免疫检测(ELISA)试剂盒。
背景技术：
近年来，随着人民生活水平的提高，食品安全问题日益凸显。“三聚氰胺事件”更使人们强化了非食品用添加剂的食品安全问题，但食用添加剂的不合法添加形势日趋恶劣，如各种各样蛋白饮品(粉、乳等)中鱼龙混杂的蛋白原料添加，各种各样的调制奶、酸奶、核桃乳、核桃粉、奶粉中添加大豆粉等，牛奶、黄牛奶、山羊奶、马奶等的相互掺假问题，极大的影响了食品消费市场的安全和消费者的消费信心。因此，加强其检验方法的研究迫在眉睫。目前蛋白质检测方法主要包括:蛋白质电泳技术、液相色谱技术、生物质谱技术、近红外光谱技术、免疫技术等。ELISAGinzyme Linked Immunosorbent Assay)是酶联免疫吸附剂测定的简称，它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种酶免技术，ELISA检测法具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强、经济等优点。国内已有利用大豆蛋白多克隆抗体ELISA方法测定火腿肠大豆蛋白含量，利用提纯牛乳酪蛋白免疫试验动物，获得针对酪蛋白的多克隆抗体，建立了牛奶中牛奶蛋白质含量的ELISA检测方法，具有良好的特异性、敏感性、重复性。但是核桃蛋白定量检测和掺假检验的试剂盒仍是空白。
发明内容本实用新型所要解决的问题是提供一种小巧轻便的核桃蛋白ELISA检测试剂盒，其操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，可进行一次连续多个样品中核桃蛋白含量的测定，减少了检测样本所需要的时间。本实用新型核桃蛋白ELISA检测试剂盒，包括盒体、盒内的一块酶标板、一张盖板膜、9瓶试剂、放试剂的下凹瓶位、一份说明书、一份质检书，其中酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，9瓶试剂分别为阳性抗原溶液、抗体工作液、阴性血清、酶标二抗工作液、底物显色液、终止液、洗涤液、封闭稀释液、包被缓冲液，放试剂的下凹瓶位共9个，分别放置9瓶试剂，盖板膜放置于酶标板上，说明书和质检书用自封袋包裹放置于盒内。本实用新型所述盒体为硬纸盒；96孔的聚苯乙烯酶标板，放于真空铝箔袋内，盖板膜是塑料硬膜。本实用新型所述9瓶试剂用不同大小、不同颜色的塑料瓶盛装，阳性抗原溶液装于绿色帽的透明PE塑料瓶，抗体工作液装于红色帽的透明PE塑料瓶内，阴性血清装于白色帽的透明PE塑料瓶内，酶标二抗工作液装于黄色帽的透明PE塑料瓶内，底物显色液用黑色帽的黑色PE塑料瓶内，终止液、洗涤液、封闭稀释液、包被缓冲液均用透明帽的白色PE塑料瓶内，下凹瓶位由塑料制成。本实用新型所述酶标板为可拆或不可拆的固相载体，可拆酶标板是由外框支撑架及放置其上的可拆的12条或8条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个或12个反应孔；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致。本实用新型所述阳性抗原溶液I瓶，10 μ I ;酶标二抗工作液I瓶，Iml ;阴性血清I瓶，50 μ I ;抗体工作液I瓶，Iml ;底物显色液I瓶，IOml ;终止液I瓶，IOml ;洗涤液I瓶，30ml ;封闭稀释液I瓶，25ml，包被缓冲液I瓶，10ml，其中封闭稀释液作为封闭液、抗体稀释
液、血清稀释液。本实用新型将9瓶试剂固定在放试剂的下凹瓶位中与酶标板、盖板膜、说明书、质检书一同封装在硬纸盒内，以便于携带和运输。每一个试剂盒中的试剂足够进行96次测定(包括标准分析孔)，既可进行一次连续多个样品的检测，也可以将板孔拆开多次检测，将剩下酶标反应微孔条的放回铝箔袋中用自封袋密封，这样可以保证试剂盒检测结果的准确性。检测时，包被在酶标板上的标准品和样品中的核桃蛋白可与后面加入的一抗结合，再加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与样本中所含核桃蛋白的含量成正相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中核桃蛋白含量，其操作简便易行。实验显示本试剂盒具有很高的灵敏度，标准曲线的检测范围在800ng/ml-25ng/ml，回收率范围均在85% 115%之间；且特异性较好，与其他植物坚果如，花生、大豆、芝麻均无交叉反应；相对于其他新霉素检测方法，本试剂盒所需仪器较少，只需要酶标仪、离心机、振荡器和微量加样器等，同类实验室一般均有配备,所需成本较低。本实用新型的有益效果是:能快速、简便、灵敏、准确地用于核桃蛋白含量的检测，可用作间接ELISA法对核桃蛋白定量检测及掺假检验，可满足相关企业单位批量检测核桃及相关产品中核桃蛋白含量和掺假检验的需要。
图1是本实用新型结构示意图；图2是本实用新型的放试剂的下凹瓶位结构示意图；图3是本实用新型盖板膜示意图；图4是本实用新型试剂瓶结构示意图；图中:1是盒体；2是放试剂的下凹瓶位；3是洗涤液瓶位；4是核桃蛋白抗体工作液瓶位；5是阳性抗原溶液瓶位；6是酶标二抗工作液瓶位；7是阴性血清瓶位；8是包被缓冲液瓶位；9是封闭稀释液瓶位；10是终止液瓶位；11是底物显色液瓶位；12是透明帽的白色PE塑料试剂瓶；13是透明帽的白色PE塑料试剂瓶或黑色帽的黑色PE塑料试剂瓶；14是红色帽或绿色帽或黄色帽或白色帽的透明PE塑料试剂瓶。
具体实施方式
下面通过附图和实施例对本实用新型作进一步详细说明，但本实用新型的保护范围不局限于所述内容。实施例1:本实用新型包括盒体1、盒内的一块酶标板、一张盖板膜、9瓶试剂、放试剂的下凹瓶位2、一份说明书、一份质检书，其中酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，9瓶试剂分别为阳性抗原溶液、抗体工作液、阴性血清、酶标二抗工作液、底物显色液、终止液、洗涤液、封闭稀释液、包被缓冲液，下凹瓶位共9个，分别放置9瓶试剂，盖板膜放置于酶标板上，说明书和质检书用自封袋包裹放置于盒内；其中盒体为硬纸盒；96孔的聚苯乙烯酶标板，放于真空铝箔袋内，盖板膜是塑料硬膜；阳性抗原溶液装于绿色帽的透明PE塑料瓶，抗体工作液装于红色帽的透明PE塑料瓶内，阴性血清装于白色帽的透明PE塑料瓶内，酶标二抗工作液装于黄色帽的透明PE塑料瓶内，底物显色液用黑色帽的黑色PE塑料瓶内，终止液、洗涤液、封闭稀释液、包被缓冲液均用透明帽的白色PE塑料瓶内，下凹瓶位由塑料制成；酶标板为可拆固相载体，可拆酶标板是由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；阳性抗原溶液I瓶，10 μ I ;阴性血清I瓶，50 μ I ;酶标二抗工作液I瓶，Iml ;抗体工作液I瓶，Iml ;底物显色液I瓶，IOml ;终止液I瓶，IOml ;洗涤液I瓶，30ml ;封闭稀释液I瓶，25ml，包被缓冲液I瓶，IOml0其中:阳性抗原溶液为浓度9mg/mL的核桃蛋白溶液；抗体工作液为抗核桃蛋白多克隆抗体；酶标二抗工作液为HRP标记的羊抗兔IgG使用液；底物显色液为0.1%0 TMB ;终止液为2M的硫酸溶液；洗涤液为0.1M pH7.4 PBST溶液；封闭稀释液为采用含5%脱脂牛奶的PBST，作为封闭液、抗体稀释液；包被缓冲液为0.05M碳酸盐缓冲液，pH为9.6，在包被抗原和样品时作为稀释液。使用时盖板膜用于酶标板置水浴或恒温箱内反应时封盖酶标板，盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；透明帽的白色PE塑料试剂瓶12用于封装30ml洗涤液并置于洗涤瓶位3处；红色帽的透明PE塑料试剂瓶14用于封装Iml核桃蛋白抗体工作液并置于核桃蛋白抗体工作液瓶位4处；绿色帽的透明PE塑料试剂瓶14用于封装IOul/瓶的阳性抗原溶液并置于阳性抗原溶液瓶位5处；黄色帽的白色PE塑料试剂瓶14封装Iml酶标二抗工作液并置于酶标二抗工作液瓶位6处；白色帽的透明PE塑料试剂瓶14封装50ul阴性血清并置于阴性血清瓶位7处；透明帽的白色PE塑料试剂瓶13用于封装IOml包被缓冲液并置于包被缓冲液瓶位8处；透明帽的白色PE塑料试剂瓶13用于封装25ml封闭稀释液并置于封闭稀释液瓶位9处；透明帽的白色PE塑料试剂瓶13用于封装IOml终止液并置于终止液瓶位10处；黑色帽的黑色PE塑料试剂瓶13用于封装IOml底物显色液并置于底物显色液瓶位11处。使用试剂盒检测时，样本的前处理如下:(I)提取缓冲液的配制:将6.1g TrisUl.7g NaCl加到IL的去离子水中，搅拌使之充分溶解，调pH至8.15-8.25，备用。(2)洗涤工作液的配制:用去离子水将20X洗涤液按1: 19体积比进行稀释(I份20X洗涤液+19份去离子水)用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4°C环境可保存一个月。(3)核桃粉样品的处理步骤如下:首先将提取缓冲液预热至60°C，再以料液比为1:10 (W/V)将样品与提取缓冲液充分混合，室温震荡15min,最后15000rpm、常温条件下离心IOmin ;得到的上清进行适当稀
释即可。(4)核桃乳(奶、露等)样品的处理步骤取样品Iml于EP管中，15000rpm,常温条件下离心IOmin,得到的上清进行适当稀
释即可。使用试剂盒的具体操作步骤如下:[0031]以某品牌核桃乳为例:I)样品:取核桃乳样品Iml于EP管中，15000rpm，常温条件下离心lOmin，得到的
上清备用；2)包被:将阳性核桃蛋白抗原溶液和样品核桃乳，用包被缓冲液分别以2倍连续稀释成为8个不同的浓度，将不同稀释度的阳性抗原核桃蛋白和样品溶液分别加到酶标板中，ΙΟΟμ ν 孔，37°C孵育 2h，4°C过夜；3)洗涤:弃包被液，在吸水纸上拍干，加洗涤液300μ 7孔，微震3min/次，洗涤3次；4)封闭:用含5%脱脂牛奶的PBST封闭液封闭，200μ 7孔，37 °C孵育2h ；5)洗涤:同步骤3);6)加一抗:加100X稀释的一抗溶液(最终效价23)，ΙΟΟμΙ/孔，以正常兔血清为阴性对照，空白只加稀释液，37°C孵育Ih ；7)洗涤:同步骤3);8)加酶标二抗:稀释2000倍的二抗，IOOPL/孔，37°C孵育Ih ；9)洗涤:同步骤3);10)加底物显色液:100μ 7孔，室温避光孵育IOmin ；11)加终止液:100μ 7 孔；
12)检测OD值:酶标仪测定0D450值；13)用不同稀释度(即不同浓度)的核桃蛋白标准溶液经上述步骤测定得到的0D450，建立标准曲线及回归方程Υ=0.0024χ+0.2715，R2=0.982814)将不同稀释度(即不同浓度)的核桃乳溶液经上述步骤测定得到的0D450中有线性关系的数据代入标准曲线回归方程计算出核桃乳中核桃蛋白的含量，从而可以分析出核桃粉中核桃蛋白的浓度，再根据核桃乳凯氏定氮总蛋白含量计算出核桃粉中其它蛋白的掺入程度。实验结果:根据建立的标准曲线及稀释适当倍数的样品OD值，算出核桃乳中核桃蛋白含量为1%，标签上注明的蛋白含量0.7%比较，可以认为该核桃乳为合格产品，即并未掺入其它大豆蛋白等非核桃蛋白。实施例2:本试剂盒结构和实施例1相同，不同在于酶标板为不可拆固相载体，8条酶标反应微孔条组成，每个酶标反应微孔条有12个反应孔。使用试剂盒以某品牌核桃粉为例:I)样品前处理:首先将提取缓冲液预热至60°C，再以料液比为1:10 (W/V)将样品核桃粉与提取缓冲液充分混合，室温震荡15min，最后15000rpm、常温条件下离心IOmin ;得到的上清，备用；2)包被:将标准核桃蛋白液和样品核桃粉悬浮乳液用稀释液分别以2倍连续稀释成为12个不同的浓度，将不同稀释度的阳性抗原核桃蛋白和样品溶液分别加到酶标板中，ΙΟΟμ ν 孔，37°C孵育 2h，4°C过夜；3)洗涤:弃包被液，在吸水纸上拍干，加洗涤液300μ 7孔，微震3min/次，洗涤3次；4)封闭:用含5%脱脂牛奶的PBST封闭液封闭，200μ 7孔，37 °C孵育2h ；[0053]5)洗涤:同步骤3)；6)加一抗:加100X稀释的一抗溶液(最终效价25)，ΙΟΟμΙ/孔，以正常兔血清为阴性对照，空白只加抗体稀释液，37°C孵育Ih ；7)洗涤:同步骤3);8)加酶标二抗:稀释2000倍的二抗，IOOPL/孔，37°C孵育Ih ；9)洗涤:同步骤3);10)加底物显色液:IOOPL/孔，室温避光孵育5min ；11)加终止液:100μ 7 孔；12)检测OD值:酶标仪测定0D450值；
13)用不同稀释度(即不同浓度)的核桃蛋白标准溶液经上述步骤测定得到的0D450，建立标准曲线及回归方程Y=0.0024χ+0.2715，R2=0.9828 ；14)用不同稀释度(即不同浓度)的核桃粉溶液经上述步骤测定得到的0D450中有线性关系的数据代入标准曲线回归方程计算出核桃粉中核桃蛋白的含量，从而可以分析出样品中核桃蛋白的浓度，再根据核桃乳凯氏定氮总蛋白含量计算出核桃粉中其它蛋白的掺入程度。实验结果:根据建立的标准曲线及稀释适当倍数的样品OD值，算出核桃该品牌核桃粉中核桃蛋白含量为3.1%，凯氏定氮法测得的蛋白含量> 6.3%比较，表明该核桃粉有一半以上的蛋白来自其它原料或标签上注明的大豆蛋白。试剂盒测定前的注意事项:1、室温低于20°C或试剂及样本没有回到室温(20-25°C )会导致所有标准的OD值偏低。2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。3、试剂混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。4.反应终止液为2M硫酸,避免接触皮肤。5.不要使用过了有效期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化，不要交换使用不同批号的盒中试剂。6.储存条件:保存试剂盒于2_8°C，不要冷冻；将不用的微孔板放进自封袋重新密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。7.试剂变质的迹象:显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。8.加显色液后一般显色IOmin即可，若颜色较浅，可延长显色时间，但不能超过30mino
权利要求1.一种核桃蛋白ELISA检测试剂盒，其特征在于:其包括盒体、盒内的一块酶标板、一张盖板膜、9瓶试剂、放试剂的下凹瓶位、一份说明书、一份质检书，其中酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，9瓶试剂分别为阳性抗原溶液、抗体工作液、阴性血清、酶标二抗工作液、底物显色液、终止液、洗涤液、封闭稀释液、包被缓冲液，放试剂的下凹瓶位共9个，分别放置9瓶试剂，盖板膜放置于酶标板上，说明书和质检书用自封袋包裹放置于盒内。
2.根据权利要求1所述核桃蛋白ELISA检测试剂盒，其特征在于:盒体是硬纸盒；96孔的聚苯乙烯酶标板，放于真空铝箔袋内，盖板膜是塑料硬膜。
3.根据权利要求1所述核桃蛋白ELISA检测试剂盒，其特征在于:阳性抗原溶液装于绿色帽的透明PE塑料瓶，抗体工作液装于红色帽的透明PE塑料瓶，阴性血清装于白色帽的透明PE塑料瓶，酶标二抗工作液装于黄色帽的透明PE塑料瓶，底物显色液用黑色帽的黑色PE塑料瓶，终止液、洗涤液、封闭稀释液、包被缓冲液均用透明帽的白色PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料制成。
4.根据权利要求1所述核桃蛋白ELISA检测试剂盒，其特征在于:酶标板为可拆或不可拆的固相载体，可拆酶标板由外框支撑架及放置其上的可拆的12条或8条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个或12个反应孔；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致。
5.根据权利要求1所述核桃蛋白ELISA检测试剂盒，其特征在于:阳性抗原溶液I瓶，10 μ I ;酶标二抗工作液I瓶，Iml ;阴性血清I瓶，50 μ I ;抗体工作液I瓶，Iml ;底物显色液I瓶，IOml ;终止液I瓶，IOml ;洗涤液I瓶，30ml ;封闭稀释液I瓶，25ml，包被缓冲液I瓶，IOml0
专利摘要本实用新型公开了一种核桃蛋白ELISA检测试剂盒，其包括盒体、盒内的一块酶标板、一张盖板膜、9瓶试剂、放试剂的下凹瓶位、一份说明书、一份质检书，9瓶试剂分别为阳性抗原溶液、抗体工作液、阴性血清、酶标二抗工作液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、封闭稀释液、包被缓冲液；该试剂盒具有操作简便易行、灵敏度高等特点，可用作间接ELISA法对核桃蛋白定量检测及掺假检验，可满足相关企业单位批量检测核桃及相关产品中核桃蛋白含量和掺假检验的需要。
文档编号G01N33/68GK202939176SQ20122063888
公开日2013年5月15日 申请日期2012年11月28日 优先权日2012年11月28日
发明者陈朝银, 方娟, 赵声兰, 葛锋, 刘迪秋 申请人:昆明理工大学