肾上腺髓质素测定与用于确定成熟肾上腺髓质素的方法

肾上腺髓质素测定与用于确定成熟肾上腺髓质素的方法
【专利摘要】本发明的主题为用于败血症患者的治疗随访的体外方法，其中利用包含两种结合部分的测定来确定所述败血症患者的体液样品中成熟ADM1-52和/或成熟ADM1-52-Gly的浓度，所述两种结合部分结合成熟ADM1-52和/或成熟ADM1-52-Gly，即氨基酸21-52-氨基SEQ?ID?No.1或氨基酸21-52-Gly?SEQ?ID?No.2，中两个不同的区域，其中每一个所述区域包含至少4个或5个氨基酸。本发明的主题还为测定与校准方法。
【专利说明】肾上腺髓质素测定与用于确定成熟肾上腺髓质素的方法
[0001] 本发明的主题为用于败血症患者的治疗随访的体外方法，其中利用包含两种结合 部分的测定确定所述败血症患者的体液样品中成熟ADM1-52和/或成熟ADMl-52-Gly的浓 度，所述两种结合部分结合成熟ADM1-52和/或成熟ADMl-52-Gly区域，即氨基酸21-52-氨 基SEQ ID No. 1或氨基酸21-52-Gly SEQ ID No. 2,中两个不同的区域，其中每一个所述区 域包含至少4个或5个氨基酸。
[0002] 本发明的主题还为测定与校准方法。
[0003] 在Kitamura等（参阅1 ;数值基于参考文献附表）中首次描述了肾上腺髓质素 (ADM)肽，其为包含52个氨基酸的新的降低血压的肽，该肽已自人嗜铬细胞瘤中分离出来。 同一年，也描述了编码包含185个氨基酸的前体肽的cDNA和这一前体肽的完整的氨基酸序 列。前体肽，特别是包含在N末端处的21个氨基酸的信号序列，被称为"肾上腺髓质素前 体原"(pre-proADM)。pre-proADM包含185个氨基酸并且具有SEQIDNo:3的序列。成熟 ADM显示于SEQ ID No. 4中而成熟ADM-Gly显示于SEQ ID No. 5中。
[0004] 肽肾上腺髓质素（ADM)为包含52个氨基酸（SEQ ID N〇:2)的肽，并且包含 pre-proADM的95-146氨基酸肽，肾上腺髓质素通过蛋白水解裂解自pre-proADM形成。迄 今为止，基本上只有很少的pre-proADM裂解中所形成的肽片段的片段被更准确地表征，尤 其是，生理活性肽肾上腺髓质素（ADM)和"PAMP"，包含在pre-proADM中信号肽的21氨基酸 之后的20个氨基酸（22-41)的肽。对ADM和PAMP而言，还已发现并且更为详尽地研究了 其生理活性亚片段。1993年ADM的发现与表征引发了强烈的研究活动和潮水般的出版物， 最近以各种综述概括了这些结果，在本说明书的上下文中，参考文献尤其是出自期刊"肽 (P印tides)"的文章致力于ADM(P印tides22(2001))，特别是（2)和（3)。另一综述为（4)。 在目前的科学研究界，尤其ADM可被认为是多功能的调节肽。它以通过甘氨酸所延伸的非 活性的形式被释放到血液循环中（5)。也存在特异性针对ADM的结合蛋白（6)并且可能也 调节ADM的作用。
[0005] 目前研究中最重要的ADM及PAMP的那些生理效应为影响血压的效应。因此，ADM 为有效的血管舒张剂，可能它降低血压的效应与ADMC末端部分中的特别的肽片段有关。
[0006] 还已发现上述的自pre-proADM形成的另一生理活性肽PAMP同样地显示出降低 血压的效应，尽管看起来它具有不同于ADM的作用机制（参阅上述的综述（3)和（4)，以及
[7] 、⑶或（9)和（10))。
[0007] 还已发现在许多病理状态下可以在血液循环和其他体液中测量到的ADM的浓度 显著地高于在健康对照人群中发现的浓度。因此，患有充血性心力衰竭、心肌梗塞、肾脏 疾病、高血压病症、糖尿病、休克急性期和败血症及败血性休克的患者中ADM水平显著地增 力口，尽管程度不同。在一些所述的病理状态中PAMP浓度也增加，但是血浆水平相对于ADM 下降（⑶；1702页）。
[0008] 还已知将在败血症或败血性休克中观察到异常高的ADM浓度（参阅（3)和（11)、 (12)、（13)、（14)和（15))。这发现与典型的血液动力学改变有关，所述典型的血液动力学 改变被称为患有败血症和其他严重的综合征，诸如例如SIRS患者病程的典型现象。
[0009] 尽管推测ADM和PAMP形成于同一前体肽，pre-proADM(SEQ ID No:3)，其中对应这 些肽的氨基酸序列以等摩尔量的局部肽存在，生物体液中可测的ADM与PAMP浓度明显地不 同。这是没有什么异常的。
[0010] 因此，同一前体肽的不同的裂解产物的可测浓度可能是不同的，例如，因为它们是 不同的竞争性裂解途径的结果，例如在不同的病理状态下，不同的竞争性裂解途径导致不 同的前体肽碎裂并因此导致不同的裂解产物。前体肽中所含的某些局部肽可形成为游离 肽，或可以不形成，和/或不同的肽以不同的方式和不同的量形成。即使认为只有单一的裂 解途径用于处理前体肽，并且因此所有裂解产物都源于同一个前体肽而且必须以等摩尔量 形成自身，生物体液中可测的不同局部肽和片段的稳态浓度可能非常不同，即，例如，当单 独个体以不同的速率形成和/或在各自的生物体液中具有不同的个体稳定性（寿命）时， 或如果基于不同的裂解机制和/或以不同的裂解速率将它们从血液循环中移除。
[0011] 肾上腺髓质素在败血症发展期间（(16)、（17))和许多急性的及慢性的疾病 ((18)、（4))中发挥了关键作用。
[0012] ADM在败血症和败血症后果预后（（19)、（14)、（11))中是升高的。对早期监测治 疗成功或失败而言，败血症治疗随访为基本上尚未满足的临床需求。
[0013] 目前没有适用于常规诊断的ADM测定。当前可用的用于测定成熟ADM的测试的敏 感性太低。因此，需要高血浆量用于分析。而且，目前可用的测定显示出与预分析局限性有 关的稳定性，例如，需要通过抑肽酶稳定样品（(20)、（21))。加之，一些ADM测定在测量前 需要大量的样品制备（11)。
[0014] 本发明的目标为提供适合作为直接测量成熟ADM的常规方法，适用于标准的自动 化实验室和即时护理技术。
[0015] 令人惊奇地，结果表明此类测定可用于败血症患者的治疗随访。
[0016] 本发明的主题为用于败血症患者的治疗随访的体外方法，其中利用包含两种结合 部分的测定确定所述败血症患者的体液样品中成熟ADM1-52和/或成熟ADMl-52-Gly的浓 度，所述两种结合部分结合成熟ADM1-52和/或成熟ADMl-52-Gly区域，即氨基酸21-52-氨 基SEQ ID No. 1或氨基酸21-52-Gly SEQ ID No. 2,中两个不同的区域，其中每一个所述区 域包含至少4个或5个氨基酸。
[0017] 在本发明的一实施方案中，主题为用于败血症患者治疗随访的体外方法，其中所 述结合部分中的一种结合成熟ADM和/或成熟ADMl-52-Gly下列序列中所包含的区域：
[0018] ADM21-32:CTVQKLAHQIYQ(SEQ ID No. 6)
[0019] 并且其中所述这些结合部分中的另一种结合成熟ADM和/或成熟ADMl-52-Gly下 列序列中所包含的区域：
[0020] ADM42-52:APRSKISPQGY(SEQ ID No. 7)
[0021] 在本发明的一实施方案中，所述测定的测定敏感性能够定量健康人的ADM，其为 〈10pg/ml，优选地<40pg/ml并且更优选地<70pg/ml。
[0022] 在本发明的一实施方案中，所述结合部分显示出与成熟ADM和/或成熟 ADMl-52-Gly结合亲合力至少ΙΟ7]^1，优选ΙΟ8]^ 1，优选的亲合力大于ΙΟ9]^1，最优选的大于 ΙΟ^Τ1。本领域的技术人员已知可以考虑通过应用更高剂量的化合物来弥补较低的亲合力， 并且这种测量不会导致超出本发明的范围。
[0023] 为测定肾上腺髓质素抗体的亲合力，借助于无标记的表面等离子共振技术利用 Biacore2000系统（GE Healthcare Europe GmbH,弗赖堡，德国）测定肾上腺髓质素结合 固体化抗体的动力学。根据制造说明书（小鼠抗体捕获试剂盒，GE Healthcare)，利用高密 度共价地接合至CM5感应器表面的抗小鼠 Fc抗体进行抗体的可逆固定（22)。
[0024] 在本发明的一实施方案中，所述结合部分选自抗肾上腺髓质素抗体，或结合ADM 的抗ADM抗体片段，或结合肾上腺髓质素的非Ig骨架。
[0025] 治疗随访意为治疗开始后至少一次测定样品中的ADM成熟1-52 (SEQ ID No. 4)和 /或成熟ADMl-52-Gly(SEQ ID No. 5)的浓度，优选多于一次，优选两次或一天一次。
[0026] 在本发明的一实施方案中，可称为P0C-测试（即时护理），即允许不需要全自动测 定系统的情况下，在靠近患者小于1小时内进行测试的测试技术。这种技术的一实例为免 疫色谱测试技术。
[0027] 在本发明的一实施方案中，此类测定为夹心免疫测定，利用任何种类的包括但 不限于酶标记、化学发光标记、电化学发光标记的检测技术，优选全自动测定。在本发明 的一实施方案中，此类测定为酶标记的夹心测定。自动或全自动测定的实例包括用于下 列系统中的一种的测定：Roche ?丨eesys*，Abbott Architect*, Siemens Centauer*1, Brahms Kryptor'.，Biomerieux Vidas、'.，Alere Triage'-. 〇
[0028] 各种各样的免疫测定是已知的并且可用于本发明的测定和方法，这些包括：放射 免疫测定（"RIA"）、均质酶倍增免疫测定（"EMIT"）、酶联免疫吸附测定（"ELISA"）、酶 蛋白再活化免疫测定（"ARIS"）、试纸免疫测定以及免疫色谱测定。
[0029] 在本发明的一实施方案中，标记至少所述两种结合部分中的一种以便于检测。
[0030] 优选的检测方法包括各种形式的免疫测定，诸如例如放射免疫测定（RIA)、化学发 光与荧光免疫测定、酶联免疫测定（ELISA)、基于Luminex的珠阵列、蛋白质微阵列测定以 及快速检验形式，诸如例如免疫色谱带试验。
[0031] 在一优选的实施方案中，所述标记选自化学发光标记、酶标记、荧光标记、放射碘 记。
[0032] 测定可以为同种的或异种的测定，竞争性的与非竞争性的测定。在一实施方案中， 测定为夹心测定的形式，其为非竞争性的免疫测定，其中待被检测和/或定量的分子与第 一抗体和第二抗体结合。第一抗体可与固相结合，例如珠、孔或其他容器的表面、芯片或带， 并且第二抗体为例如被染料、放射性同位素、或再活化的或催化活化部分标记的抗体。然后 通过适当的方法测量与分析物结合的标记抗体的量。已确立涉及"夹心测定"的通常组合 与程序并且为本领域技术人员所知（23)。
[0033] 在另一实施方案中，测定包括两种捕获分子，优选二者都以液体反应混合物中分 散体存在的抗体，其中第一标记组分连接到第一捕获分子，其中所述第一标记组分为基于 荧光-或化学发光淬火或扩增的标记系统的一部分，并且所述标识系统的第二标记组分连 接到第二捕获分子，从而一旦这两种捕获分子与分析物结合，就会产生可测的信号，该信号 允许检测包含样品的溶液中成形的夹心复合物。
[0034] 在另一实施方案中，所述标记系统包含与荧光染料或化学发光染料，特别是青色 素型的染料组合的稀土穴状化合物或稀土螯合物。
[0035] 在本发明的上下文中，基于荧光的测定包括染料的使用，例如该染料可选自包含 卩八皿(5-或6-羧基荧光素）、￥1(：、呢0、荧光素、异硫氰酸荧光素$11'〇、11?-700/800，花 青染料，诸如 CY3、CY5、CY3. 5、CY5. 5、Cy7、Xanthen、6-羰基-2'，4'，7'，4, 7-六氟荧光 素（HEX)、TET、6-羰基-4'，5' -二氯-2'，7' -二甲氧基荧光素（J0E)、N，N，N'，N' -四甲 基-6-羧基若丹明（TAMRA)、6_羰基-X-若丹明（R0X)、5_羧基若丹明-6G(R6G5)、6_羧基 若丹明_6G(RG6)、若丹明、若丹明绿、若丹明红、若丹明110、B0DIPY染料诸如BODIPY TMR、 俄勒冈绿、香豆素诸如伞形酮、苯甲亚胺诸如赫斯特33258 ;菲啶，诸如德克萨斯红、雅基马 黄、Alexa Fluor、PET、溴化乙锭、吖啶染料、卡唑染料、吩恶嗪染料、紫菜碱染料、聚甲炔染 料等。
[0036] 在本发明的上下文中，基于化学发光的测定包括染料的使用，基于（24)中所述的 化学发光物质的物理原理。优选的化学发光染料为吖啶酯。
[0037] 如本文所提及的，"测定"或"诊断测定"可以为诊断学领域内所应用的任何类型。 此类测定可以基于待被检测的分析物与一个或多个具有某种亲合力的捕获探针结合。就捕 获分子与靶分子或目的分子之间的相互作用而言，亲合力常数优选大于io 8m'
[0038] 在本发明的上下文中，"结合部分分子"为可用于自样品中结合靶分子或目的分 子，即分析物（即在本发明PCT及其片段的上下文中）的分子。因此结合部分分子必须在 空间上和诸如表面电荷、疏水性、亲水性、Lewis供体和/或受体的存在或缺失的表面特征 方面，形成足以特异地结合靶分子或目的分子的某种形状。因此，例如可通过离子键、范德 华键、Ji-Ji键、σ-Ji键、疏水键或氢键相互作用或两种或多种以上所提及的捕获分子与 靶分子或目的分子之间相互作用的组合介导结合。在本发明的上下文中，例如结合部分分 子选自核酸分子、碳水化合物分子、PNA分子、蛋白、抗体、肽或糖蛋白。优选地，结合部分分 子为抗体，包括其具有与靶分子或目的分子充分亲合力的片段，并且包括重组抗体或重组 抗体片段，以及以化学方法和/或生物化学方法修饰的所述抗体的衍生物或衍生自具有至 少12个氨基酸长度的其变体链的片段。
[0039] 化学发光标记可为吖啶酯标记、涉及异鲁米诺标记的类固醇标记等。
[0040] 酶标记可为乳酸脱氢酶（LDH)、肌酸激酶（CPK)、碱性磷酸酶、天冬氨酸氨基转移 酶（AST)、丙氨酸氨基转移酶（ALT)、酸性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶等。
[0041] 在本发明的一实施方案中，至少所述两种结合部分中的一种与如磁性粒子和聚苯 乙烯表面的固相结合。
[0042] 在本发明的一实施方案中，样品中所测量的成熟ADM1-52和/或成熟ADMl-52-Gly 浓度为血浆或血液中10_500pg/ml的范围。
[0043] 用所述的ADM测定检测本发明的ADM水平。以上提及的值在其他ADM测定中可能 是不同的，这取决于它们的校准方式。因此考虑到校准差异，以上提及的值应要求此类不同 的校准ADM测定。可以通过经由它们的正常范围（健康群体）关联和调整校准ADM测定。 可选地，市场上可购的对照样品可用于不同的校准调整（ICI Diagnostics,柏林，德国）。 用所述的ADM测定，已检测到正常人群的中位数为24. 7pg/mL。
[0044] 在本发明的一实施方案中，应用阈值，从而阈值以上的值表示患者对治疗无响应 或响应差，而低于所述阈值的值表示患者对治疗响应。
[0045] 在本发明的一实施方案中，应用60-80pg/ml的阈值，优选70pg/ml。
[0046] 在本发明的一实施方案中，所述样品选自人枸橼酸血浆、肝素血浆、EDTA血浆、全 血。
[0047] 在本发明的一实施方案中，直接测量提取的所述样品而不需要任何进一步的样品 制备。
[0048] 在本发明的一实施方案中，在全自动设备上进行所述方法。Roche Eleesys?， Abbott Architect?，Siemens Centauer?, Brahms Kryptor?，Biomerieux Vidas?, Alere Triage?。
[0049] 在本发明的一实施方案中，在至少两种样品中检测成熟ADM1 -52和/或成熟 ADMl-52-Gly，其中所述样品在不同的时间点取自所述败血症患者。可在治疗期间一天一次 地采取所述样品。可应用描述使用其他生物标记的此类诊断方案，例如（25)和（26)。
[0050] 在本发明的一实施方案中，所测的样品体积小于或等于50 μ 1。
[0051] 本发明的用于败血症患者治疗随访的体外方法可与其它临床和/或实验室参数 和/或临床评分，诸如例如Apache2评分、SOFA评分或其他，或评分中所含的一个或多个参 数组合。利用标准的统计工具可连续地或间断地组合变量/参数。
[0052] 本发明的主题还为用于检测样品中成熟肾上腺髓质素和/或肾上腺髓质素 -Gly 和/或肾上腺髓质素-Gly的测定，其中所述样品包含两种结合部分，所述两种结合部分 结合成熟肾上腺髓质素和/或肾上腺髓质素-Gly区域，即氨基酸21-52-氨基SEQ ID No. 1或成熟肾上腺髓质素的氨基酸21-52-Gly SEQ ID No. 2,中两个不同的区域，其中 每一个所述区域包含至少4个或5个氨基酸，并且其中所述测定不是人工包被管吖啶酯 (coated-tube-Akridiniumester)夹心测定。
[0053] 本发明的主题还为用于检测样品中成熟肾上腺髓质素和/或肾上腺髓质素 -Gly 的测定，其中所述样品包含两种结合部分，所述两种结合部分结合成熟肾上腺髓质素和/ 或肾上腺髓质素-Gly区域，即氨基酸21-52-氨基SEQ ID No. 1或成熟肾上腺髓质素的氨 基酸21-52-Gly SEQ ID No. 2,中两个不同的区域，其中每一个所述区域包含至少4个或5 个氨基酸，并且其中所述测定是人工包被管卩丫陡酯（coated-tube-Akridiniumester)夹心 测定，且其中所述结合部分中的一种为结合SEQ ID No. 4的抗体，其中所述结合部分中的另 一种为结合 SEQ ID No. 7(APRSKISPQGY-C0-NH2)的抗体。
[0054] 在本发明用于检测样品中成熟肾上腺髓质素和/或肾上腺髓质素-Gly测定的一 实施方案中，所述结合部分中的一种结合成熟ADM的下列序列中所包含的区域：
[0055] CTVQKLAHQIYQ(SEQ ID No. 6)
[0056] 并且其中所述这些结合部分中的另一种结合成熟ADM的下列序列中所包含的区 域：
[0057] APRSKISPQGY(SEQ ID No. 7)
[0058] 在本发明用于检测样品中成熟肾上腺髓质素和/或肾上腺髓质素-Gly测定的一 实施方案中，所述测定的测定敏感性能够定量健康人的ADM并且〈10pg/ml，优选<40pg/ml 并且更优选<70pg/ml。
[0059] 在本发明用于检测样品中成熟肾上腺髓质素和/或肾上腺髓质素-Gly测定的一 实施方案中，所述结合部分显示出与成熟ADM和/或成熟ADMl-52-Gly结合亲合力至少 10 7M'优选10I1，优选的亲合常数大于ΚΛΓ1，最优选的大于ΙΟΙ1。本领域的技术人员 已知可以考虑通过应用更高剂量的化合物来弥补较低的亲合力，并且这种测量不会导致超 出本发明的范围。结合亲合力可如以上所述地检测。
[0060] 在本发明用于检测样品中成熟肾上腺髓质素和/或肾上腺髓质素-Gly测定的一 实施方案中，所述结合部分选自抗肾上腺髓质素抗体，或结合ADM的抗ADM抗体片段，或结 合肾上腺髓质素的非Ig骨架
[0061] 在本发明用于检测样品中成熟肾上腺髓质素和/或肾上腺髓质素-Gly测定的 一实施方案中，此类测定为夹心测定，优选全自动测定。它可为全自动的或人工的ELISA。 它可为所谓的PCT测试（即时护理）。自动的或全自动的测试的实例包括可用于下列 系统中的一种的测定：R〇che Elecsys?:，Abbott Architect!?, Siemens Centauer?， Brahms Kryptor?，Biomerieux Vidas?, AlereTriageiRo 以上提供了测试形式的实例。
[0062] 在本发明用于检测样品中成熟肾上腺髓质素和/或肾上腺髓质素-Gly测定的一 实施方案中，至少标记所述两种结合部分中的一种以便于检测。以上提供了标记的实例。
[0063] 在本发明用于检测样品中成熟肾上腺髓质素和/或肾上腺髓质素-Gly测定的一 实施方案中，所述两种结合部分中的至少一种与固相结合。以上提供了固相的实例。
[0064] 在本发明用于检测样品中成熟肾上腺髓质素和/或肾上腺髓质素-Gly测定的一 实施方案中，所述标记选自化学发光标记、酶标记、荧光标记、放射碘标记。
[0065] 本发明的另一主题为包含本发明的测试的试剂盒，其中所述测定的组分可包含在 一个或多个容器中。
[0066] 本发明的另一主题为校准本发明的测定的方法，其中，使用优选抗体的结合部分， 其与成熟肾上腺髓质素和/或肾上腺髓质素-Gly氨基酸1-16 (SEQ ID No. 8)内至少5个 氨基酸的区域结合。所述结合部分可为与成熟肾上腺髓质素和/或肾上腺髓质素-Gly氨 基酸1-16 (SEQ ID No. 8)内至少5个氨基酸的区域结合的抗体或抗体片段或非Ig骨架。
[0067] 在本发明校准测定的方法的一实施方案中，所述N末端抗体或片段或骨架识别成 熟肾上腺髓质素和/或肾上腺髓质素-Gly的N末端并且与其结合。这种方法在另一优选 的实施方案中，如果ADM的N末端为游离的，所述抗ADM抗体或抗-肾上腺髓质素抗体片段 或非Ig骨架只与成熟ADM的序列内的区域结合。在所述实施方案中，如果所述序列包含在 pro-ADM内，抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或非Ig骨架不与成熟ADM的序列内的 区域结合。
[0068] 本发明适用于校准测定的抗体为满足ADM吸附特性的此类结合部分。此类结合部 分还必须与检测测定中所用的结合部分相兼容，例如，ELISA情况下所述结合部分不应干扰 标记的结合部分与固相结合部分的结合。
[0069] 本方法和测定适于常规应用。在大多数的情况下常规应用要求所需的样品体积不 应超过50 μ 1。常规应用还要求分析前处理保持在最小限度或为零（常规样品的使用，如 EDTA血浆、枸橼酸血浆）。分析前要求必须适合临床常规：最小的分析稳定性（>90%再现） 应在室温下至少2小时。
[0070] 本发明的抗体为特异性结合抗原的蛋白，其包括一个或多个基本上由 免疫球蛋白基因所编码的多肽。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、a (Ig Α)、 Y (IgGp IgG2, IgG3, IgG4)、δ (IgD)、ε (IgE)和μ (IgM)恒定区基因，及无数免疫球蛋白可 变区基因。全长的免疫球蛋白轻链通常为大约25Kd或214个氨基酸的长度。全长的免疫 球蛋白重链通常为大约50Kd或446个氨基酸的长度。轻链由NH2末端处可变区基因（大约 110个氨基酸的长度）和COOH末端处κ或λ恒定区基因所编码。相似地，重链由可变区 基因（大约116个氨基酸的长度）和其它恒定区基因中的一种编码。
[0071] 抗体的基础结构单元通常为由两对相同的免疫球蛋白链组成的四聚体，每对具有 一条轻链和一条重链。在每对中，轻链与重链可变区与抗原结合，恒定区介导效应功能。免 疫球蛋白还以各种其他的形式存在，例如包括Fv、Fab和（Fab'） 2，及双功能杂合抗体与单 链（(27)，（28)，（29)，（30)，（31))。免疫球蛋白轻链或重链可变区包括被三个高变区中断的 骨架区，也称为互补决定区（CDR)见（32)。如以上所示，CDR主要负责结合抗原表位。免疫 复合体为特异地结合抗原的抗体，诸如单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体、或功 能抗体片段。
[0072] 嵌合抗体为通常通过基因工程自属于不同种类的免疫球蛋白可变区和恒定区基 因构建它的轻链和重链基因的抗体。例如，小鼠单克隆抗体来源的基因的可变节段可以连 接到人恒定节段，诸如κ与 Y3。在一实例中，因此治疗性嵌合抗体为杂交蛋白，其 由来自小鼠抗体的可变的或抗原结合结构域和来自人抗体的不变或效应结构域组成，尽管 可以使用其他哺乳动物种类，或可以通过分子技术产生可变区。本领域中熟知制造嵌合抗 体的方法，例如参阅（33)。"人源化"免疫球蛋白为免疫球蛋白，其包括人骨架区和一个或多 个来源于非人类（诸如小鼠、大鼠或合成的）的CDRs免疫球蛋白。提供CDR的非人源免疫 球蛋白称为"供体"并且提供骨架的人免疫球蛋白称为"受体"。在一实施方案中，所有CDR 都来自于人源化免疫球蛋白中的供体免疫球蛋白。恒定区不必须存在，但是如果它们存在， 它们必须基本上与人免疫球蛋白恒定区是同一的，即，至少大约85-90%，诸如大约95%或 更多同一的。因此，所有人源化免疫球蛋白的部分，除了可能地CDR之外，都基本上与对应 的天然人免疫球蛋白序列的部分是同一的。"人源化抗体"为包含人源化轻链和人源化重 链免疫球蛋白的抗体。作为提供CDR的供体抗体，人源化抗体与相同的抗原结合。人源化 免疫球蛋白或抗体的受体骨架可具有有限数量的被取自供体骨架的氨基酸取代的取代基。 人源化或其他单克隆抗体可以具有额外的保守的氨基酸取代基，所述保守的氨基酸取代基 基本上对抗原结合或其他免疫球蛋白功能没有影响。示例性保守取代基为诸如gly，ala ; val，ile，leu ;asp，glu ;asn，gin ;ser，thr ;lys，arg ;和 phe，tyr 那些。借助于基因工程可 以构建人源化免疫球蛋白（例如参见（34))。人抗体为其中轻链和重链基因都为人来源的 抗体。可以利用本领域中已知的方法产生人抗体。可以通过使分泌目的抗体的人类B细胞 无限增殖来产生人抗体。例如可以通过EBV感染或通过将人类B细胞与骨髓瘤或杂交瘤细 胞融合以产生三源杂交瘤细胞，实现无限增殖化。人抗体也可以通过噬菌体展示方法（例 如参阅（35)，（36)，（37)，其通过引用并入本文）产生，或选自人组合的单克隆抗体文库（参 阅Morphosys网站）。也可以通过利用携带人免疫球蛋白基因的转基因动物制备人抗体（例 如参阅（38)和（39)，其通过引用并入本文）。
[0073] 因此，ADM抗体可具有本领域中已知的形式。实例为人抗体、单克隆抗体、人源化抗 体、嵌合抗体、CDR移植抗体。在一优选的实施方案中，本发明的抗体为重组产生的抗体，例 如如IgG，典型的全长免疫球蛋白，或包含至少重链和/或轻链的F可变域的抗体片段，例如 如化学接合的抗体（片段抗原结合），包括但不限于包括Fab微抗体的Fab-片段、单链Fab 抗体、带有附加表位的单价的Fab抗体、例如Fab-V5Sx2 ;与CH3结构域二聚化的二价的Fab 抗体（微抗体）；二价的Fab或多价的Fab，例如经由异源性结构域辅助下多聚化而形成，例 如经由dHLX结构域的二聚化，例如Fab-dHLX-FSx2 ;F(ab '）2_片段、scFv片段、多聚化的 多价体或/和多特异性的scFv片段、二价的和/或双特异的双抗体、BITE? (双特异的T 细胞衔接器）、三功能性的抗体、多价抗体、例如来自与G不同的类别；单一域抗体，例如衍 生于骆驼科或鱼类免疫球蛋白的纳米抗体以及许多其他的。
[0074] 除了抗ADM抗体之外，其他生物聚合物骨架为本领域中熟知的以复合靶分子并且 已用于高靶标特异性生物聚合物的产生。实例为适配子、镜像异构体、anticalin和芋螺毒 素。
[0075] 在一优选的实施方案中，ADM抗体形式选自Fv片段、scFv片段、Fab片段、scFab 片段、（Fab)2片段化scFv-Fc融合蛋白。在另一优选的实施方案中，抗体形式选自scFab片 段、Fab片段、scFv片段及其生物利用度优化的接合物，诸如PEG化的片段。最优选的形式 之一为scFab形式。
[0076] 非Ig骨架可为蛋白骨架并且可用作抗体模拟物，因为它们能够结合配体或抗原。 非Ig骨架可选自基于四连接素的非Ig骨架（例如（40)中所述）、纤连蛋白骨架（例如 (41)中所述）；基于脂质运载蛋白的骨架（（例如（42)中所述）；泛素蛋白骨架（例如（43) 中所述）、转移骨架（例如（44)中所述）、蛋白A骨架（例如（45)中所述）、基于锚蛋白重 复序列的骨架（例如（46)中所述），优选微蛋白微蛋白形成胱氨酸结）骨架（例如（47)中 所述）、基于FynSH3结构域的骨架（例如（48)中所述）、基于EGFR-A-结构域的骨架（例 如（49)中所述）以及基于Kunitz结构域的骨架（例如（59)中所述）。
[0077] 在另一优选的实施方案中，抗ADM抗体或结合ADM的抗体片段为单特异性抗体。单 特异性抗体为对相同抗原都具有亲合力的抗体。单克隆抗体为单特异性的，但是除了自普 通生殖细胞产生它们之外还可以通过其他的方式产生单特异性抗体。
[0078] 在本发明一优选的实施方案中，可如下所述的产生本发明的抗体：用100 μ g ADM-肽-BSA-接合物（乳化于100 μ 1完全弗氏佐剂）在第0天与14天和用50 μ g在第 21天与28天（100 μ 1不完全弗氏佐剂中）免疫Balb/c小鼠。在进行融合试验前3天，动 物接受溶于1〇〇 μ 1盐水中的50 μ g接合物，给予一次腹膜内注射和一次静脉内注射。
[0079] 在37°C下，用lml50%聚乙二醇使来自免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞系SP2/0 的细胞融合30秒。洗涤后，将细胞接种于96孔细胞培养平板中。通过生长于HAT培养基 [添加了 20%胎牛血清和HAT补充物的RPMI1640培养基]中挑选杂交克隆。两周后用HT 培养基代替HAT培养基持续3次细胞传代然后返回到正常的细胞培养基。
[0080] 融合后3周针对抗原特异的IgG抗体初次筛选细胞培养上清液。将测试阳性的微 量细胞培养转移到24孔平板中用以增殖。再测试后，利用有限稀释技术克隆及再克隆挑选 的培养物并且检测同种型（还参阅（51)和（52))。
[0081] 可借助于噬菌体展示根据下列程序产生抗体：人类天然抗体基因文库HAL7/8用 于分离抗肾上腺髓质素肽的重组单链F-可变域（scFv)。利用包括使用经由两种不同的间 隔区将含有生物素标签的肽连接到肾上腺髓质素肽序列的筛选策略来筛选抗体基因文库。 利用非特异性结合抗原和链霉亲和素结合抗原的筛选轮的混合用于使非特异的结合部分 的背景最小化。来自于第三轮筛选的洗脱噬菌体已用于传代表达单克隆scFv的大肠杆菌 (E.coli)菌株。来自于这些克隆株的培养物的上清液已直接地用于抗原ELISA检测。（53) 和（54)。
[0082] 根据下列程序进行鼠抗体的人源化：对小鼠来源的抗体的人源化而言，针对框架 区（FR)与互补决定区（CDR)和抗原的结构相互作用分析抗体序列。基于结构模拟，挑选适 当的人源的FR并且将小鼠 CDR序列移植到人FR。CDR或FR的氨基酸序列中的变异可能会 被引入到恢复结构的相互作用，这可通过将种类转换为FR序列而消除。可通过利用噬菌体 展示文库的随机方法或经由通过分子模拟所引导的直接方法（55)达到这种结构相互作用 的回复。
[0083] 抗体的研发
[0084] 我们研发了结合hADM的N末端、中间区域和C末端部分的小鼠单克隆抗体并且检 测它们的亲合常数（表1)。
[0085] 用于免疫作用的狀
[0086] JPT肽技术股份有限公司（柏林，德国）提供了肽。利用Sulfo-SMCC交联方法将 肽接合到BSA。根据制造说明书进行交联程序（Thermo Fisher/Pierce)。
[0087] 实施例1
[0088] 抗体的产生与它们亲合常数的检测
[0089] 根据下列的方法产生小鼠抗体：用100 μ g肽-BSA-接合物在第0天和14天（乳 化于100 μ 1完全弗氏佐剂）及用50 μ g(100 μ 1不完全弗氏佐剂中）在第21天和28天免 疫Balb/c小鼠。进行融合试验之前三天，动物接受溶于100 μ 1盐水中的50 μ g接合物，给 予一次腹膜内注射和一次静脉内注射。
[0090] 在37°C下，用lml50%聚乙二醇使来自免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞系SP2/0 的细胞融合30秒。洗涤后，将细胞接种于96孔细胞培养平板中。通过生长于HAT培养基 [添加了 20%胎牛血清和HAT补充物的RPMI1640培养基]中挑选杂交克隆。两周后用HT 培养基代替HAT培养基持续3次细胞传代然后返回到正常的细胞培养基。
[0091] 融合后3周针对抗原特异的IgG抗体初次筛选细胞培养上清液。将测试阳性的微 量细胞培养转移到24孔平板中用以增殖。再测试后，利用有限稀释技术克隆及再克隆挑选 的培养物并且检测同种型。（(51)和（52))。
[0092] 表 1 :
[0093]
【权利要求】
1. 用于疑似患有败血症的患者的治疗随访的体外方法，其中利用包含两种结合部分的 测定来确定所述败血症患者的体液样品中成熟ADM1-52和/或成熟ADMl-52-Gly的浓度， 所述两种结合部分结合成熟肾上腺髓质素和/或成熟肾上腺髓质素-Gly区域，即氨基酸 21-52-氨基（SEQ ID No. 1)或氨基酸21-52-Gly(SEQ ID No. 2)，中两个不同的区域，其中 每一个所述区域包含至少4个或5个氨基酸。
2. 如权利要求1所述的用于败血症患者的治疗随访的体外方法，其中所述结合部分中 的一种与成熟ADM和/或成熟ADMl-52-Gly的下列序列（SEQ ID No.4)中所含的区域结 合，并且其中所述这些结合部分中的另一种与成熟ADM和/或成熟ADMl-52-Gly的下列序 列（SEQ ID No. 5)中所含的区域结合。
3. 如权利要求1或2所述的用于败血症患者的治疗随访的体外方法，其中所述测定的 测定敏感性能够定量健康个体的ADM，为〈10pg/ml，优选地<40pg/ml并且更优选地<70pg/ ml〇
4. 如权利要求1-3中任一项所述的用于败血症患者的治疗随访的体外方法，其中所述 结合部分展示了至少107?^的与成熟ADM和/或成熟ADMl-52-Gly的结合亲合力。
5. 如权利要求1-4中任一项所述的用于败血症患者的治疗随访的体外方法，其中所述 结合部分选自抗肾上腺髓质素抗体，或结合ADM的抗ADM抗体片段，或结合肾上腺髓质素的 非Ig骨架。
6. 如权利要求1-5中任一项所述的用于败血症患者的治疗随访的体外方法，其中所述 测定为夹心测定，优选全自动测定。
7. 如权利要求1-6中任一项所述的用于败血症患者的治疗随访的体外方法，其中标记 所述两种结合部分中的至少一种以便于检测。
8. 如权利要求1-7中任一项所述的用于败血症患者的治疗随访的体外方法，其中所述 两种结合部分中的至少一种与固相结合。
9. 如权利要求7所述的用于败血症患者的治疗随访的体外方法，其中所述标记选自化 学发光标记、酶标记、荧光标记、放射性碘标记。
10. 如权利要求1-9中任一项所述的用于败血症患者的治疗随访的体外方法，其中样 品中所测的所述成熟ADM1-52和/或成熟ADMl-52-Gly的浓度在10-500pg/ml的范围。
11. 如权利要求1-10中任一项所述的用于败血症患者的治疗随访的体外方法，其中应 用阈值，从而所述阈值以上的值表示患者对所述治疗无响应或响应差而低于所述阈值的值 表示患者对所述治疗响应。
12. 如权利要求1-11中任一项所述的用于败血症患者的治疗随访的体外方法，其中应 用 60-80pg/ml 的阈值，优选 70pg/ml。
13. 如权利要求1-12中任一项所述的用于败血症患者的治疗随访的体外方法，其中所 述样品选自人枸橼酸血浆、肝素血浆、EDTA血浆、全血。
14. 如权利要求13所述的用于败血症患者的治疗随访的体外方法，其中直接测量采取 的所述样品而没有任何进一步的样品制备。
15. 如权利要求1-14中任一项所述的用于败血症患者的治疗随访的体外方法，其中所 述方法在全自动设备上进行。
16. 如权利要求1-15中任一项所述的用于败血症患者的治疗随访的体外方法，其中在 至少两种样品中检测所述成熟ADM1-52和/或成熟ADMl-52-Gly，其中所述样品在不同时间 点取自所述败血症患者。
17. 如权利要求1-16中任一项所述的用于败血症患者的治疗随访的体外方法，其中所 测的所述样品的体积为小于或等于50 μ 1。
18. 用于检测样品中成熟肾上腺髓质素和/或肾上腺髓质素-Gly和/或肾上腺髓质 素-Gly的测定，其包含两种结合部分，所述两种结合部分结合成熟肾上腺髓质素和/或肾 上腺髓质素-Gly区域，即氨基酸21-52-氨基SEQ ID No. 1或成熟肾上腺髓质素的氨基酸 21-52-Gly SEQ ID No. 2,中两个不同的区域，其中每一个所述区域包含至少4个或5个氨 基酸，并且其中所述测定不是人工包被管B丫陡酯（coated-tube-Akridiniumester)夹心测 定。
19. 用于检测样品中成熟肾上腺髓质素和/或肾上腺髓质素-Gly和/或肾上腺髓质 素-Gly的测定，其包含两种结合部分，所述两种结合部分结合成熟肾上腺髓质素和/或肾 上腺髓质素-Gly区域，即氨基酸21-52-氨基SEQ ID No. 1或成熟肾上腺髓质素的氨基酸 21-52-Gly SEQ ID No. 2,中两个不同的区域，其中每一个所述区域包含至少4个或5个氨基 酸，并且其中所述测定是人工包被管卩丫陡酯（coated-tube-Akridiniumester)夹心测定， 且其中所述结合部分中的一种为结合SEQ ID N0.6CTVQKLAHQIYQ的抗体，其中所述结合部 分中的另一种为结合SEQ ID No. 7APRSKISPQGY-C0-NH2的抗体。
20. 如权利要求18所述的用于检测样品中成熟肾上腺髓质素和/或肾上腺髓质 素-Gly的测定，其中所述结合部分中的一种与成熟ADMl-52-Gly的下列序列（SEQ ID No. 4)中所含的区域结合，并且其中所述这些结合部分中的另一种与成熟ADM和/或成熟 ADMl-52-Gly的下列序列（SEQ ID No. 5)中所含的区域结合。
21. 如权利要求18-20中任一项所述的用于检测样品中成熟肾上腺髓质素和/或肾上 腺髓质素-Gly的测定，其中所述测定的测定敏感性能够定量健康个体的ADM，为〈10pg/ml， 优选地<40pg/ml并且更优选地<70pg/ml。
22. 如权利要求18-21中任一项所述的用于检测样品中成熟肾上腺髓质素和/或肾上 腺髓质素-Gly的测定，其中所述结合部分展示了至少107Μ<的与肾上腺髓质素的结合亲合 力。
23. 如权利要求18-22中任一项所述的用于检测样品中成熟肾上腺髓质素和/或肾上 腺髓质素-Gly的测定，其中所述结合部分选自抗肾上腺髓质素抗体，或结合ADM的抗ADM 抗体片段，或结合肾上腺髓质素的非Ig骨架。
24. 如权利要求18-23中任一项所述的用于检测样品中成熟肾上腺髓质素和/或肾上 腺髓质素-Gly的测定，其中所述此类测定为夹心测定，优选全自动测定。
25. 如权利要求18-24中任一项所述的用于检测样品中成熟肾上腺髓质素和/或肾上 腺髓质素-Gly的测定，其中标记所述两种结合部分中的至少一种以便于检测。
26. 如权利要求18-25中任一项所述的用于检测样品中成熟肾上腺髓质素和/或肾上 腺髓质素-Gly的测定，其中所述两种结合部分中的至少一种与固相结合。
27. 如权利要求25所述的用于检测样品中成熟肾上腺髓质素和/或肾上腺髓质 素-Gly的测定，其中所述标记选自化学发光标记、酶标记、荧光标记、放射性碘标记。
28. 包含权利要求18-27中任一项所述的测定的试剂盒，其中所述测定的组分可包含 在一个或多个容器内。
29. 校准权利要求18-28中任一项所述的测定的方法，其中使用与成熟肾上腺髓质素 和/或肾上腺髓质素-Gly氨基酸1-16 (SEQ ID No. 8)内至少5个氨基酸的区域结合的结 合部分。
30. 如权利要求29所述的校准测定的方法，其中所述结合部分识别成熟肾上腺髓质素 和/或肾上腺髓质素-Gly的N末端并与其结合。
【文档编号】G01N33/68GK104067130SQ201280066354
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2012年11月16日 优先权日:2011年11月16日
【发明者】安德里亚斯·伯格曼 申请人:斯弗因高泰克有限公司