专利名称：人cgrp受体结合蛋白的制作方法
人CGRP受体结合蛋白背景本申请含有序列表，其已经由EFS网提交且其全文在此以引用的方式并入。将 2009年12月14日建立的所述ASCII副本命名为A1472PCT. txt，大小为312，447个字节。肽的降钙素超家族包括至少五种已知的成员降钙素、胰岛淀粉样肽(amylin)、 肾上腺髓质素和两种降钙素基因相关肽(“CGRP”):CGRP1(也称为ctCGRP或CGRP)和 CGRP2(也称为β CGRP)。CGRP为表达于中枢神经系统和周围神经系统的37个氨基酸血管活性神经肽，且已被证实为周围神经中的强效血管舒张剂，其中含CGRP的神经元与血管紧密缔合。CGRP介导的血管舒张还与神经原性炎症相关，其为导致血浆外渗和微脉管系统血管舒张的一系列事件中的一部分并出现于偏头痛中。胰岛淀粉样肽在CNS中也具有特异性结合位点，且被认为可调节胃排空并在碳水化合物代谢中发挥作用。肾上腺髓质素为强效血管舒张剂。肾上腺髓质素在星形胶质细胞上具有特异性受体，并且其信使RNA在经受局部缺血的CNS组织中得以上调(Zi_ermann等，Identification of adrenomedullin receptors in cultured rat astrocytes and in neuroblastoma glioma hybrid cells (NG108-15) , Brain Res.，724 :238-245(1996) ；Wang 等，Discovery of adrenomedullin in rat ischemic cortex and evidence for its role in exacerbating focal brain ischemic damage, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,92 :11480-11484(1995)) 降钙素参与骨代谢的控制，并且还在中枢神经系统(CNS)中具有活性。CGRP 的生物活性包括调节神经肌肉接头、免疫系统中的抗原呈递、血管紧张度和感觉神经传递(Poyner, D. R.，Calcitonin gene-related peptide :multiple actions，multiple receptors，Pharmacol·Ther·，56 :23-51 (1992) ；Muff 等，Calcitonin，calcitonin gene related peptide， adrenomedullin and amylin !homologous peptides， separate receptors and overlapping biological actions, Eur.J. Endocrinol. ,133 17-20(1995))。已在许多哺乳动物种群中鉴别出三种降钙素受体剌激肽(CRSP) ；CRSP可在 CGRP 家族中形成新的亚族(Katafuchi, T 和 Minamino，N，Structure and biological properties of three calcitonin receptor-stimulating peptides， novel members of the calcitonin gene-related peptide family，Peptides，25(11) :2039-2045(2004))。降钙素超家族肽通过七个跨膜域G蛋白偶联受体(GPCR)起作用。降钙素受体 (“CT”、“CTR”或“CT受体”)和CGRP受体为II型(“B家族”)GPCR，该家族包括识别调节肽(诸如胰泌素、胰高血糖素和血管活性肠多肽(VIP))的其它GPCR。表征最充分的人降钙素受体的剪接变体根据第一细胞内环中16个氨基酸的存在(先前为CTO11+或 CTR1,现称为CT(b))或不存在(主要剪接变体，先前为CTRn_或CTR2,现称为CTw)而变化。(Gorn 等，Expression of two human skeletal calcitonin isoforms cloned from a giant cell tumor of bone :the first intracellular domain modulates ligand binding and signal transduction，J. Clin.Invest.，95 :2680-2691 (1995) ；Hay 等， Amylin receptors :molecular composition and pharmacology, Biochem. Soc. Trans.， 32 :865-867(2004) ；i^oyner等，200 。已根据多项体内和体外生物测定中差异性拮抗剂亲和力和激动剂功效提出存在至少两种CGRP受体亚型(Dennis等，CGRP8-37，A calcitonin gene-related peptide antagonist revealing calcitonin gene-related peptide receptor heterogeneity in brain and periphery, J.Pharmacol. Exp. Ther. ,254 123-128(1990) ；Dennis 等，Structure-activity profile of calcitonin gene-related peptide in peripheral and brain tissues. Evidence for multiplicity,J. Pharmacol. Exp.Ther. ,251 :718-725(1989) ；Dumont 等，A potent and selective CGRP2 agonist, [Cys(Et)2,7]hCGRP :comparison in prototypical CGRPl and CGRP2 in vitro assays, Can. J. Physiol. Pharmacol.，75 :671-676 (1997))。发现CGRPl受体亚型对拮抗剂片段CGRP(8_37)敏感。(Chiki等，Calcitonin gene-related peptide receptor antagonist human CGRP-(8-37), Am. J. Physiol., 256 :E331-E335(1989) ；Dennis 等，(1990) ；Mimeault 等，Comparative affinities and antagonistic potencies of various human calcitonin gene-related peptide fragments on calcitonin gene-related peptide receptors in brain and periphery, J. Pharmacol. Exp. Ther.，258 :1084-1090 (1991))。相比之下，CGRP2 受体对线性人 CGRP (hCGRP)类似物敏感，其中位置2和7处的半胱氨酸残基经衍生化(例如，用乙酰氨基甲基[Cys(ACM)2,7]或乙基酰胺[Cys(Et)2’7])，但CGRP2受体对片段CGRP(8-37)不敏感。 (Dennis 等，(1989) ；Dennis 等，(1990) ；Dumont 等，(1997))。降钙素受体和降钙素样受体(“CL”、“CLR”或“CRLR”)的配体特异性取决于称为受体活性修饰蛋白(RAMP)的辅助蛋白家族成员的共表达。RAMP家族包括三种多肽(RAMP 1、RAMP2和RAMP3)，其充当决定降钙素家族成员的受体的配体特异性的受体调节剂。RAMP为I型跨膜蛋白，其与细胞质短C末端(一个跨膜域)和细胞外大N末端(负责特异性)共享约30%氨基酸序列同一性和共同的预测拓扑结构(topology)。 (McLatchie 等，(1998)RAMPs regulate the transport and ligand specificity of the calcitonin-receptor-like receptor，Nature，393 :333-339 ；Fraser 等，(1999) The amino terminus of receptor activity modifying proteins is a critical determinant of glycosylation state and ligand binding of calcitonin receptor-like receptor, Molecular Pharmacology,55 :1054-1059)。1998年，CGRP1受体被鉴别为是由新型单跨膜域辅助蛋白、受体活性修饰蛋白 1 (RAMPl)和CRLR构成的异二聚体。((McLatchie等，见上文)。交联实验表明，CGRP受体由 CRLR和 RAMPl 按一比一的化学计量排列组成(Hilairet 等，JBC 276，42182-42190 (2001))， 使用若干方法(诸如BRET和BiFC)的最新研究显示，功能性CGRP受体复合物可由CRLR的非对称同源寡聚体和RAMPl单体构成(Heroux等，JBC 282, 31610-31620 (2007)) 纯化的CRLR N末端域已显示可特异性结合125I-CGRP (Chauhan等，Biochemistry 44，782 Q005))，这证实CRLR与CGRP配体之间存在重要且直接的相互作用。具体而言， 认为CRLR的Leu 24和Leu 34构成CGRP的C末端Phe37的停泊位点(Banerjee等，BMC Pharmacol. 6,9(2006)) 此外，Koller 等，(FEBS Lett. 531,464-468(2002))证明 CRLR 的 N末端18个氨基酸残基有助于与CGRP或肾上腺髓质素的选择性相互作用，并且Ittner等 (Biochemistry 44，5749-5754 (2005))提出 CRLR 的 N 末端氨基酸残基 23-60 介导与 RAMPl 的缔合。
对RAMPl的结构-功能分析鉴别出与“螺旋3”相关(Simms等，Biophys. J. 91， 662-669(2006))并在与CRLR相互作用中具有潜在显著作用的残基91-103以及与CGRP 配体潜在相互作用的残基Trp74和Wie92，CGRP配体与其结合CGRP受体复合物有关。 使用人/大鼠RAMPl嵌合体的配体结合研究表明，CGRP R的某些小分子抑制剂(例如 BIBN4096BS)的结合位点位于包括RAMPl的氨基酸66-102的区域内(Mallee等，JBC 277， 14294-14298(2002))ο尽管跨膜域具有几乎80%的同一性，但CRLR与CTR具有55%的总氨基酸序列同 一 t生(McLatchie 等，(1998) ；Poyner 等，International union of pharmacology. XXXII. The mammalian calcitonin gene-related peptides,adrenomedullin,amylin and calcitonin receptors, Pharmacol. Rev. ,54 :233-246(2002))。经证实，CRLR可形成CGRP的高亲和力受体(当与RAMPl缔合时)或优选地结合肾上腺髓质素(当与RAMP2或RAMP3缔合时)。(McLatchie等，(1998) ；Sexton 等，Receptor activity modifying proteins, Cellular Signaling, 13 :73-83(2001)； Conner 等，Interaction of calcitonin-gene-related peptide with its receptors, Biochemical Society Transactions 30 (第 4 部分)451-454 0002))。CRLR 的糖基化状态与其药理学相关。RAMP 1、2和3以相似的效率将CRLR转运至质膜，然而RAMPl将 CRLR呈递为末端糖基化、成熟糖蛋白和CGRP受体，而RAMP 2和3将CRLR呈递为未成熟、 核心糖基化肾上腺髓质素受体(“AM”或“AMR”或“AM受体”)。(Fraser等，(1999))。 尽管RAMP 2和3共享仅30%的氨基酸序列同一性，但通过放射性配体结合(125I-肾上腺髓质素作为放射性配体)、功能测定(cAMP测量)或生物化学分析(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)对HEK293T细胞中CRLR/RAMP2和CRLR/RAMP3受体的表征显示其不可辨别 (Fraser等，1999))。然而，在药理学中已观察到用RAMP 2表达的CRLR与用RAMP 3表达的CRLR的差异。CGRP和CGRP8-37以及肾上腺髓质素以及源于肾上腺髓质素的肽AM 22-52对RAMP 3异二聚体均具有活性，这表明此复合物可充当CGRP和AM受体(Howitt等， British Journal of Pharmacology, 140 :477-486(2003) ；Muff φ, Hypertens. Res. ,26 S3-S8 (2003))。人CRLR随大鼠RAMPl的共表达(反之亦然)表明RAMPl物种决定了 CRLR/ RAMPl复合物相对于若干所测小分子CGRP受体拮抗剂的药理学特征(Mallee等，Rec印tor Activity-Modifying Protein 1 determines the species selectivity of non—peptide CGRP receptor antagonists, J. Biol. Chem. , 277 (16) 14294-14298 (2002)) 除非与 RAMP 缔合，未知CRLR可结合任何内源性配体；目前认为仅GPCR以此方式作用。(Conner等，A key role for transmembrane prolines in calcitonin receptor-like agonist binding and signaling !implications for family B G-protein-coupled receptors, Molec. Pharmacol. ,67(1) :20-31 (2005))。已证实，降钙素受体(CT)与RAMP (称为胰岛淀粉样肽受体(“AMY”、“AMY R”或 “AMY受体”))可形成异二聚体复合物。一般而言，CT/RAMP1受体(称为“AMY/’或“AMY1”) 对鲑鱼降钙素、胰岛淀粉样肽和CGRP具有高亲和力，并对哺乳动物降钙素具有低亲和力。 对于 CT/RAMP2 受体(“AMI” 或“AMY2”)和 CT/RAMP3 受体(“AMY/，或“AMY3”)，主要观察到了相似的模式，尽管对CGRP的亲和力较低并且在生理相关配体浓度下可能不显著。精确的受体表型取决于细胞类型和CTR剪接变体(CT(a)或0^))，尤其是对于RAMP2产生的胰岛淀粉样肽受体而言。例如，据报导，破骨细胞样细胞的纯群体表达RAMP2、CTR 和 CRLR，而非 RAMPl 或 RAMP3。(Hay 等，Q004) ；Christopoulos 等，Multiple amyIin receptors arise from receptor activity-modifying protein interaction with the calcitonin receptor gene pro due t, Mo1e cu1ar Pharmacology，56 :235-242 (1999) ；Muff 等，An amyIin receptor is revealed following co-transfection of a calcitonin receptor with receptor activity modifying proteins—1 or_3， Endocrinology，140 : 2924-2927(1999) ；Sexton 等,(2001) ；Leuthauser 等,Receptor-activity-modifying protein 1 forms heterodimers with two G-protein-coupled receptors to define ligand recognition，Biochem· J·，351 :347-351 (2000) ；Tilakaratne等，Amylin receptor phenotypes derived from human calcitonin receptor/RAMP co-expression exhibit pharmacological differences dependent on receptor isoform and host cell environment, J. Pharmacol. Exp. Ther.，294 :61-72 (2000) ；Nakamura 等，Osteoclast-Iike cells express receptor activity modifying protein 2 -application of laser capture microdissection, J. Molec. Endocrinol.，34 :257-261 (2005))。下表1汇总了上述受体组分的关系。表 权利要求
1.一种分离的抗原结合蛋白，其中所述分离的抗原结合蛋白选择性抑制人CGRP受体。
2.根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述分离的抗原结合蛋白以100 或以上的选择性比率选择性抑制所述人CGRP受体。
3.根据权利要求2所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述分离的抗原结合蛋白以500 或以上的选择性比率选择性抑制所述人CGRP受体。
4.根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述分离的抗原结合蛋白以 Kd彡IOOnM特异性结合人CGRP R0
5.根据权利要求4所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述分离的抗原结合蛋白以 Kd彡IOnM特异性结合人CGRP R，如使用FACS结合分析测定。
6.根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述分离的抗原结合蛋白在CGRP 结合竞争性测定中的Ki小于ΙΟηΜ。
7.根据权利要求6所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述分离的抗原结合蛋白在放射性标记的125I-CGRP结合竞争性测定中对来自表达人CGRP R的细胞的膜具有小于InM的Ki。
8.根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述分离的抗原结合蛋白与参考抗体竞争结合人CGRP R，所述参考抗体包含(i)重链可变区，其包含选自SEQ ID N0:161、 163、164、166和168的序列；禾口 (ii)轻链可变区，其包含选自SEQ ID NO 140、143、146、148 和150的序列。
9.根据权利要求8所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述参考抗体包含(i)重链，其由选自SEQ ID N0:32、;34、35、37和39的序列定义；和(ii)轻链，其由选自SEQ ID NO :15、 18、21、23和25的序列定义。
10.根据权利要求9所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述参考抗体包含由下列序列对之一所定义的重链和轻链SEQIDNO32 禾口 SEQ ID NO15SEQIDNO34 禾口 SEQ ID NO18SEQIDNO35 禾口 SEQ ID NO21SEQIDNO37 禾口 SEQ ID NO23SEQIDNO39 禾口 SEQ ID NO:25。
11.一种分离的抗原结合蛋白，其包含(A)一个或多个选自下列的重链互补决定区(⑶RH) :(i)具有SEQ ID NO :134的 CDRHl ； (ii)具有 SEQ ID NO :135 的 CDRH2 ； (iii)具有 SEQ ID NO :136 的 CDRH3 ；禾口 (iv) 包含一、二、三或四个氨基酸取代、缺失或插入的(i)、(ii)或(iii)的⑶RH ；(B)一个或多个选自下列的轻链互补决定区(⑶RL) :(i)选自SEQ ID N0:107、lll和 118 的 CDRLl ； (ii)选自 SEQ ID NO :108、112 禾口 119 的 CDRL2 ； (iii)选自 SEQ ID NO :109、 113和120的⑶RL3 ；和任选的(iv)包含一、二、三或四个氨基酸取代、缺失或插入的(i)、 (ii)和(iii)的 CDRL ；或(C) (A)的一个或多个重链⑶RH和(B)的一个或多个轻链⑶RL。
12.根据权利要求11所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述CDRH还选自(i)具有SEQ ID NO :131 的 CDRHl ;(ii)具有 SEQ ID NO 132 的 CDRH2 ； (iii)具有 SEQ ID NO :133 的 CDRH3 ；和(iv)包含一、二或三个氨基酸取代、缺失或插入的⑴、( )和(iii)的CDRH。
13.根据权利要求12所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述CDRH还选自(i)选自SEQ ID N0:76、88、100、121、125*128&CDRHl;(ii)itgSEQ ID NO :89、101、122、124、126 和 129 的 CDRH2 ； (iii)选自 SEQ ID NO :78、90、102、123、127 和 130 的 CDRH3 ；禾口 (iv)包含一、 二或三个氨基酸取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRH。
14.根据权利要求13所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述CDRH还选自(i)选自SEQ ID NO :73、76、79、82、85、88、92、97 和 100 的 CDRHl ;(ii)选自 SEQ ID NO :74、77、80、83、 86、89、91、93、95、98、101 和 129 的 CDRH2 ； (iii)选自 SEQ ID NO :75、78、81、84、87、90、96、 99、102和123的CDRH3 ；和(iv)包含一、二或三个氨基酸取代、缺失或插入的(i)、(ii)和 (iii)的 CDRH。
15.根据权利要求11所述的分离的抗原结合蛋白1，其中所述CDRL还选自(i)选自 SEQ ID NO :107、111 禾口 115 的 CDRLl ； (ii)选自 SEQ ID NO :108、112禾口 116 的 CDRL2 ； (iii) 选自SEQ ID N0:109、113和117的⑶RL3 ；和(iv)包含一、二、三或四个氨基酸取代、缺失或插入的⑴、( )和(iii)的CDRL。
16.根据权利要求15所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述CDRL还选自(i)选自 SEQ ID NO :42、45、51、57、62、69、103 和 110 的 CDRLl ;(ii)选自 SEQ ID NO :43、52、55、58、 63、70、104、108 和 114 的 CDRL2 ； (iii)选自 SEQ ID NO :44、47、53、56、59、64、105 和 106 的 CDRL3 ；和(iv)包含一、二或三个氨基酸取代、缺失或插入的⑴、( )和(iii)的CDRL。
17.根据权利要求16所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述CDRL还选自(i)选自SEQ ID NO :42、45、48、51、54、57、62、65、66 和 69 的 CDRLl ； (ii)选自 SEQ ID NO :43、46、49、52、 55、58、61、63、67 和 70 的 CDRL2 ； (iii)选自 SEQ ID NO :44、47、50、53、56、59、64、68、71 和 72 的CDRL3 ；和(iv)包含一、二或三个氨基酸取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRL。
18.根据权利要求11-17中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述分离的抗原结合蛋白包含至少一个⑶RH和至少一个CTRL。
19.根据权利要求18所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述分离的抗原结合蛋白包含至少两个⑶RH和至少两个CDRL。
20.根据权利要求11-19中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述分离的抗原结合蛋白包含 CDRHl、CDRH2、CDRH3、CDRLl、CDRL2 和 CDRL3。
21.一种分离的抗原结合蛋白，其包含与选自SEQ ID NO :158-170的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的重链可变区(VH)序列。
22.—种分离的抗原结合蛋白，其包含与选自SEQ ID NO :137-153的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的轻链可变区(VJ序列。
23.一种分离的抗原结合蛋白，其包含与选自SEQ ID N0:158、159和162-172的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的Vh序列和与选自SEQ ID NO 137、138、140-145、148-151 和153-157的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的\序列。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述分离的抗原结合蛋白选自单克隆抗体、Fab片段、Fab'片段、F(ab' )2片段、Fv片段、双抗体和单链抗体。
25.根据权利要求M所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述分离的抗原结合蛋白为选自完全人抗体、人源化抗体和嵌合抗体的单克隆抗体。
26.根据权利要求25所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述单克隆抗体为IgGl型、IgG2型、IgG3型或IgG4型抗体。
27.根据权利要求沈所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述单克隆抗体为IgGl或 IgG2抗体。
28.一种分离的核酸多核苷酸，其编码权利要求1-27中任一项所述的抗原结合蛋白。
29.根据权利要求观所述的分离的核酸多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与选自下列的序列具有 80%或以上同一性的序列=SEQ ID NO :175、176、178、179、180、181、182、183、 186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、200、201、202、203、204、205、206、207、 208,209 和 210。
30.根据权利要求观所述的分离的核酸多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与选自SEQ ID NO =224-258的序列具有80%或以上同一性的序列。
31.根据权利要求28所述的分离的核酸多核苷酸，其中所述多核苷酸包含能够在严格杂交条件下与选自SEQ ID NO =224-258的序列杂交的序列。
32.—种表达载体，其包含权利要求观-31中任一项所述的分离的多核苷酸。
33.一种由权利要求32的表达载体转化的细胞系。
34.一种制备权利要求1-27中任一项所述的抗原结合蛋白的方法，其包括由分泌抗原结合蛋白的宿主细胞制备抗原结合蛋白。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述抗原结合蛋白使用包含可溶性CGRP受体的免疫原产生。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述可溶性CGRP受体通过人CRLR的N末端胞外域(EOT)和人RAMPl的E⑶的共表达和纯化获得。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述人CRLR的E⑶包含SEQID NO :6，并且所述 RAMPl 的 ECD 包含 SEQ ID NO :8。
38.一种药物组合物，其包含权利要求1-27中任一项所述的抗原结合蛋白和药学上可接受的赋形剂。
39.一种治疗患者的与CGRP R相关的病症的方法，其包括向患者施用有效量的权利要求1-27中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述病症为头痛。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述病症为偏头痛。
42.根据39至41中任一项所述的方法，其中所述方法包括预防性治疗。
全文摘要
本发明提供了结合人CGRP受体(CGRP R)的抗原结合蛋白。还提供了编码抗原结合蛋白的核酸、载体和编码其的细胞。所述抗原结合蛋白可抑制CGRP R与CGRP结合，并可用于许多CGRP R相关病症，包括治疗和/或预防偏头痛。
文档编号C07K16/28GK102348722SQ200980157606
公开日2012年2月8日 申请日期2009年12月18日 优先权日2008年12月23日
发明者C·T·金, C·V·小格格, D·W·布兰科夫, S-F·S·胡, T·C·布恩, 卢瀗鍹, 徐岑, 石立成 申请人:安姆根有限公司