用于指导血压下降疗法的肾上腺髓质素的制作方法
【专利说明】用于指导血压下降疗法的肾上腺髓质素
[0001] 本发明的主题为鉴定需要给予流体复苏或血管加压剂的对象的体外方法，包括以 下步骤：
[0002] ?确定所述对象的体液中proADM和/或其具有至少6个氨基酸的片段的水平
[0003] ?将所述水平与所述患者对流体复苏或血管加压剂给药的需要相关联，其中如果 所述对象的体液中proADM和/或其具有至少6个氨基酸的片段的水平大于阈值，则所述患 者被鉴定为具有这样的需要。
[0004] Kitamura等（参见1 ;数值数据是基于参考文献附录）首次将肾上腺髓质素（ADM) 肽描述为新的包含52个氨基酸的低压肽，其从人嗜铬细胞瘤分离而来。同年，编码包含185 个氨基酸的前体肽的cDNA及该前体肽的完整氨基酸序列也被公开。该前体肽尤其在N端 包含21个氨基酸的信号序列，被称为"肾上腺髓质素原前体"（pre-proADM)。Pre-proADM 包含185个氨基酸。成熟ADM示出为SEQ ID No. 4,且ADM-Gly示出为SEQ No. 5。
[0005] 成熟肾上腺髓质素（ADM)肽为包含52个氨基酸（SEQ ID No:4)的酰胺肽，它包 含pre-proADM的通过蛋白水解切割形成的氨基酸95-146。迄今为止，切割pre-proADM形 成的肽片段中的基本上仅少数片段得到较为精确的表征，特别是生理活性肽肾上腺髓质素 (ADM)和"PAMP"，其为包含在pre-proADM中信号肽的21个氨基酸后的20个氨基酸（22-41) 的肽。对于ADM和PAMP，已发现了生理活性亚片段并进行了更为详尽的研究。1993年对ADM 的发现和表征引发了广泛的研究活动和大量的出版物，其结果最近被总结于多种综述文章 中，在本说明书的上下文中，特别引用在致力于ADM的"肽"议题中发现的文章 （Peptides 22(2001))，尤其是（2)和（3)。另外的综述为（4)。在迄今为止的科学研究中，尤其发现 ADM可被认为是多功能调控肽。它被释放至通过甘氨酸延伸的失活形式的循环中（5)。还 有结合蛋白（6)，其为ADM特异性的并且可能同样地调节ADM的影响。
[0006] 在迄今为止的研究中首要的ADM以及PAMP的那些生理效应为影响血压的效应。因 此，ADM是有效的血管扩张剂，可能可以将低压效应特别与是ADM的C端部分中的肽片段相 关联。
[0007] 此外还发现从pre-proADM形成的上述另外的生理活性肽PAMP同样显示低压效 应，即使其看起来具有不同于ADM的作用机制（除了上述综述文章（3)和（4)外，还参见
[7] 、⑶或（9)和（10))。
[0008] 此外还发现在循环和其他生物流体中能够测量的ADM在许多病理状态下的浓度， 显著高于在健康对照人体中发现的浓度。因此，患有充血性心力衰竭、心肌梗死、肾病、高压 病症、糖尿病、休克急性期及败血症和败血性休克的患者的ADM水平显著增加，尽管程度不 同。在一些所述病理状态下PAMP浓度也增加，但相对于ADM血浆水平降低（(3);第1702 页）。
[0009] 此外还已知，异乎寻常的高浓度ADM可在败血症或败血性休克中观察到（参见（3) 和（11)、（12)、（13)、（14)和（15))。该发现与被认为是患有败血症和其他严重综合征如 SIRS的患者的疾病进程的典型现象的典型的血液动力学变化有关。
[0010] 尽管假定ADM和PAMP由相同的前体肽pre-proADM形成，其中对应于这些肽的氨 基酸序列作为等摩尔量的部分肽存在，生物流体中可测量的ADM或PAMP的浓度明显不同。 这没有什么异常。
[0011] 因此，完全相同的前体肽的不同降解产物的可测浓度可能不同，例如，因为它们为 不同竞争性降解途径的结果，例如其在不同病理状态情况下引起前体肽不同的片段化并因 此产生不同的降解产物。前体肽中包含的某些部分肽可形成为游离肽或者可能不形成，和/ 或不同的肽以不同的方式和不同的量形成。即使仅采用单一降解途径来处理前体肽，并因 此所有降解产物来源于完全相同的前体肽且必然主要以等摩尔量自身形成，生物流体中可 测量的不同部分肽和片段的稳态浓度可能截然不同，即例如，当其中的个别组分在各自的 生物流体中以不同的速率形成和/或具有不同的个别稳定性（使用期）时，或者如果它们 基于不同的清除机制和/或以不同的清除率从循环中去除时。
[0012] 肾上腺髓质素在败血症发展（(16)，（17))以及在众多急性和慢性疾病 ((18)，（4))中起着关键作用。
[0013] 已描述了数种测量ADM的循环水平的方法：直接ADM或间接通过确定其同源前体 肽的更稳定的片段。最近，公开了一种方法，其描述了用于测量循环中成熟ADM的测定法 (Di Somma S, Magrini L, Travaglino F, Lalle I, Fiotti N, Cervellin G, Avanzi GC, Lupia E, Maisel A, Hein F et al:Opinion paper on innovative approach of biomarkers for infectious diseases and sepsis management in the emergency department. Clinical chemistry and laboratory medicine:CCLM/FESCC 2013:1-9)。
[0014] 描述了定量来源于ADM前体的片段的其他方法，例如，测量 MR-proADM (Morgenthaler NG1Struck J1Alonso C1Bergmann A. Clin Chem. 2005 Oct； 51 (10):1823-9. )、PAMP(Washimine H, Kitamura Κ,Ichiki Υ,Yamamoto Υ,Kangawa Κ,Matsuo Η,Eto Τ. Biochem Biophys Res Commun.1994 Jul 29 ;202 (2):1081-7.)、 CT-proADM(EP211552)。可获取用于测量 MR-proADM 的商业测定法（BRAHMS MR-proADM KRYPTOR ；BRAHMS GmbH, Hennigsdorf, Germany)(Clin Biochem. 2009 May ；42(7-8):725-8. doi:10.1016/j.clinbiochem. 2009. 01. 002. Epub2009 Jan 23)〇
[0015] 用于在完全自动化的系统B.R.A.H.M.S KRYPTOR上测量血浆中的中间区域肾上 腺髓质素原的同质时间分辨的焚光测定法（Caruhel P, Mazier C, Kunde J, Morgenthaler NG，Darbouret B.)。因为这些肽以化学计量比从相同的前体产生，其血浆水平在某一程度 上相互关联。
[0016] 仅在一些研究中，测量了患有全身炎症、败血症、严重败血症或败血性休克的患者 的血浆ADM，并将这些水平与血液动力学参数相关联。
[0017] 在Hirata等的研究中，发现败血症患者的血浆ADM与心率、右动脉压而非平均 动脉压（MAP)相关（Hirata Y，Mitaka C，Sato K，Nagura T，Tsunoda Y，Amaha K, Marumo F: Increased circulating adrenomedullin, a novel vasodilatory peptide, in sepsis. The Journal of clinical endocrinology and metabolism 1996, 81(4):1449-1453)〇
[0018] Nishio等报道ADM增加的血浆浓度与患有败血症休克的患者的血管紧张度的松 弛相关（与心脏指数、心搏容量指数、心率、舒张压降低、全身血管阻力指数和肺血管阻力 指数相关），但与平均血压无显著相关性[19]。
[0019] 在健康的对象中，在运动下，发现了血浆ADM与MAP的显著负相关[20]。
[0020] 关于在发生休克的患者中循环ADM或作为pro-ADM或其片段的相关肽的水平与对 流体复苏和血管加压剂的需要的关联还一无所知。这是未被满足的医疗需求，因为血管加 压剂通常在非常晚，当患者的病况非常严重时给予。对在患者的病况非常严重之前鉴定需 要流体复苏和血管加压剂的那些患者的医疗需求还未被满足。对早于通过应用65mm Hg的 临界值的血压测量（如指导中所建议的[21])，预测对流体复苏和血管加压剂疗法的需要 的医疗需求还未被满足。如果血压下降，这将引起氧供应减少、器官功能障碍和死亡。因此， 对早期鉴定存在发生血压下降风险的患者的需求还未被满足。如果这样的患者能够尽早确 定，可以应用平均动脉压的其他例如较高临界值来开始流体复苏和血管加压剂疗法。较高 的阈值-水平为<70mm Hg，优选<75mm Hg。这意味着治疗在已大于65mmHg开始。
[0021] 本发明的主题为鉴定需要流体复苏或给予血管加压剂的对象的体外方法，包括以 下步骤：
[0022] ?确定所述对象的体液中proADM和/或其具有至少6个氨基酸的片段的水平
[0023] ?将所述水平与所述对象或患者对流体复苏或给予血管加压剂的需要相关联，其 中如果所述对象的体液中proADM和/或其具有至少6个氨基酸的片段的水平大于阈值，则 所述对象或患者被鉴定为存在这样的需要。
[0024] 在根据本发明的方法的一个实施方案中，所述对象具有大于65mm Hg额平均动脉 压。此外，所述对象可具有小于75mmg Hg的平均动脉压，在另一实施方案中，平均动脉压 <70mmg Hg〇
[0025] 在本发明的一个实施方案中，所述方法为早期鉴定流体复苏或给予血管加压剂的 方法，其中较早意味着早于通过应用65mmg Hg的临界值的血压测量或在血压降至65mmg Hg 之前。
[0026] -个特定的实施方案中，根据本发明的体液为血液样本。血液样本可选自全血、血 清和血浆。
[0027] 在本发明的具体实施方案中，所述proADM和/或其具有至少6个氨基酸的片段选 自：
[0028] SEQ ID No. I (proADM) : 164 个氨基酸（pr印roADM 的 22-185)
[0029]
[0030] SEQ ID No. 2 (肾上腺髓质素原N-20末端肽）：肽22-41
[0031] ARLDVASEF RKKffNKffALS R
[0032] SEQ ID No. 3 (中间区肾上腺髓质素原，MR-proADM):肽45-92
[0033] ELRMSS SYPTGLADVK AGPAQTLIRP QDMKGASRSP EDSSPDAARI RV
[0034] SEQ ID No. 4 (成熟肾上腺髓质素（成熟ADM);酰胺化的）：肽95-146-C0NH2
[0035] YRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGY-C0NH2
[0036] SEQ ID No. 5(肾上腺髓质素 l-52-Gly(ADM 1-52-Gly)):肽 95-147
[0037] YRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGYG
[0038] SEQ ID No. 6 (C 端肾上腺髓质素原，CT-proADM):肽 148-185
[0039] RRR RRSLPEAGPG RTLVSSKPQA HGAPAPPSGS APHFL
[0040] 在本发明的具体实施方案中，所述proADM和/或其具有至少6个氨基酸的片段选 自：成熟 ADM(SEQ ID No. 4)和 / 或成熟 ADM l-52-Gly(SEQ ID No. 5)和 MR-proADM(SEQ ID No.3)和 CT-proADM(SEQ ID No. 6)。
[0041] 在本发明的具体实施方案中，确定了成熟ADM(SEQ ID No. 4)和/或成熟ADM l-52-Gly(SEQ ID No. 5)-免疫反应性水平或者MR-proADM(SEQ ID No. 3)免疫反应性水 平或CT-proADM (SEQ ID No. 6)免疫反应性水平，并将所述水平与所述患者对流体复苏或血 管加压剂给药的需要相关联，其中如果所述对象的体液中成熟ADM(SEQ ID No. 4)和/或成 熟 ADM l-52-Gly(SEQ ID No. 5)-免疫反应性水平或者 MR-proADM(SEQ ID No. 3)免疫反 应性水平或CT-proADM (SEQ ID No. 6)免疫反应性水平大于阈值，则所述患者被鉴定为具有 这样的需要。
[0042] 在本发明的具体实施方案中，通过使用选自以下的至少一种结合剂来确定 pro-ADM和/或其片段的水平：与包含于以下序列中的区域结合的结合剂：成熟ADM(SEQ ID No. 4)和 / 或成熟 ADM 1-52-Gly (SEQ ID No. 5)，以及与包含于成熟 ADM (SEQ ID NO. 4)和 /或成熟ADM l-52-Gly(SEQ ID No. 5)的序列中的区域结合的第二结合剂。
[0043] 在本发明的具体实施方案中，通过使用选自以下的至少一种结合剂来确定 pro-ADM和/或其片段的水平：与包含于MR-proADM(SEQ ID No. 3)的序列中的区域结合的 结合剂，以及与包含于MR-proADM(SEQ ID No. 3)的序列中的区域结合的第二结合剂。
[0044] 在本发明的具体实施方案中，通过使用选自以下的至少一种结合剂来确定 pro-ADM和/或其片段的水平：与包含于CT-proADM(SEQ ID No. 6)的序列中的区域结合的 结合剂，以及与包含于CT-pro ADM(SEQ ID No.6)的序列中的区域结合的第二结合剂。
[0045] 在本发明的具体实施方案中，使用测定法来确定proADM和/或其具有至少6个氨 基酸的片段的水平，其中所述测定法的测定灵敏度能够定量健康对象的ADM，并且<70pg/ ml，优选 <40pg/ml，且更优选〈10pg/ml。
[0046] 在本发明的具体实施方案中，所述结合剂显示与proADM和/或其片段的至少 IO7M \优选IO8M 1的结合亲和力，优选的亲和力为大于10 9M \最优选大于IOwM ^本领域 技术人员了解可以考虑通过施用较高剂量的化合物来补偿较低的亲和力，并且这一措施不 会超出本发明的范围。
[0047] 为了确定抗体对肾上腺髓质素的亲和力，借助无标记的表面等离子体共振，使用 Biacore 2000 系统（GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Germany)来确定肾上腺髓质 素与固定的抗体的结合动力学。使用以高密度与CM5传感器表面共价结合的抗小鼠 Fe抗 体，根据厂商的指导（小鼠抗体捕获试剂盒；GE Healthcare)，进行抗体的可逆固定（22)。<