促甲状腺激素受体制品、其结合区、其与抗体和激素的相互作用、及其应用的制作方法
【专利摘要】包括至少一个点突变的突变TSHR制品，其中，在所述制品中，至少相应于全长人TSHR第255氨基酸位点的Arg突变为另一个氨基酸残基，从而所述制品能够区分性地与患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH相互作用。
【专利说明】促甲状腺激素受体制品、其结合区、其与抗体和激素的相互作用、及其应用
[0001]本申请为申请号为200580027629.4，申请日为2005年8月3日，发明名称为“促甲状腺激素受体制品、其结合区、其与抗体和激素的相互作用、及其应用”的分案申请。
[0002]本发明涉及促甲状腺激素受体(TSHR)的制品，尤其是突变的TSHR制品、抗体和激素与其的相互作用、及其应用、提供所述制品的方法、由此识别TSHR抗体的表位区域和结合位点、及其复合体。
[0003]促甲状腺激素或甲状腺刺激激素(TSH)是一种垂体激素，对调节甲状腺功能起关键作用。它的释放是受到在视丘下部形成的TRH的刺激并控制重要的甲状腺激素，甲状腺素(T4)和三碘化甲腺氨酸(T3)的形成和释放。基于反馈机制，血清甲状腺激素含量控制TSH的释放。通过由垂体释放的TSH结合到甲状腺细胞膜上的TSHR，刺激甲状腺细胞产生T3 和 T4。
[0004]我们最近还在PCT专利申请W02004/050708A2中描述了针对TSHR的人单克隆抗体，其为很有效的TSHR的甲状腺刺激物。在该申请中未公开所述单克隆抗体(hMAb TSHRl)在TSHR上的结合位点，但可以认为该结合位点或袋状结构域是构象的，并涉及折叠到一起的受体不连续区域。对于针对TSHR的人单克隆抗体或重组抗体，如hMAb TSHR1，TSHR上的结合位点或表位区域的识别，或者基本的结合氨基酸残基或其序列，会是理解TSHR结构以及其与人抗体相互作用的关键因素，并且能够改良自身抗体群的分析方法和其后的与对TSHR的自身免疫反应相关的甲状腺疾病的治疗。
[0005]本领域已经有大量资料说明，各种类型的抗TSHR的自身抗体可以在与抗TSHR自身免疫相关的疾病的过程中形成。根据这些自身抗体的类型而定，或者对T3和T4的形成和释放的抑制可以由于TSH分子对TSHR的保护而发生，或者从另一个角度来说，由于抗TSHR自身抗体模仿TSH的作用刺激甲状腺激素的合成和释放，这些甲状腺激素可以不受控制的形式被释放。
[0006]自身免疫性甲状腺疾病(AITD)是最常见的自身免疫疾病，影响着世界上不同的人群。有一部分AITD患者，主要是那些患Graves病的患者，具有基本上与如前所述的抗TSHR—样的自身抗体。该自身抗体结合到TSHR，通常模仿TSH的作用，刺激甲状腺产生高水平的甲状腺激素。这些自身抗体被描述成具有刺激活性。刺激性自身抗体也与TSHRs在眼组织相互作用，引起Graves病至少在眼部的某些症状。在有些患者中，自身抗体结合到TSHR但并不刺激甲状腺激素的形成，因而被描述为具有阻断作用(J Sanders, Y Oda, S-A
[0008]测定TSHR自身抗体对诊断和治疗AITD很重要，尤其是Graves病。现有三种类型测定TSHR自身抗体的方法:
[0009](a)竞争性结合方法，测定TSHR自身抗体抑制TSH结合到TSHR制品的能力；[0010](b)生物鉴定法，测定TSHR自身抗体在培养物中刺激细胞表达TSHR的能力；和[0011 ] (c)利用TSHR自身抗体免疫沉淀TSHR制品。
[0012]利用这些方法测定TSHR自身抗体在以下参考物中已有描述，J Sanders, YOda,S-A Roberts,M Maruyama,J Furmaniak,B Rees Smith Understanding thethyrotropin receptor function-structure relationship;Bailliere's ClinicalEndocrinology and Metabolism.Ed;T F Daviesl99711 (3):451-479.Pub.BailliereTindall, London;and J Sanders, Y Oda, S Roberts, A Kiddie, T Richards, J Bolton,VMcGrath, S Walters, D Jask[omicron]lski, J Furmaniak, B Rees Smith〃The interactionof TSHR autoantibodies with〈125>I_labelled TSHR", Journal of ClinicalEndocrinology and Metabolisml99984(10):3797-3802。
[0013]然而，在使用以上所述目前测定TSHR自身抗体的方法时有很多局限性。类型(a)的竞争性方法以不同的方式使用起来一般来说是灵敏的，作为日常工作相对容易操作。但是，至今所熟知的测定TSHR自身抗体的竞争性的放射性受体分析在实用性(由于TSHR制品的结合能力一般对受体或通过它而结合的生物分子的变化非常敏感)上有根本的缺陷并且也不允许针对自身抗体群进行鉴别诊断(例如，像以上所述的刺激或阻断自身抗体的区别)。
[0014]类型(b)的生物鉴定法，费用高、耗时，还需要技术很熟练的技术员。
[0015]至于类型(C)的直接免疫沉淀法，具有在实际应用中很敏感这一问题，而且目前还不可能对自身抗体群实现鉴别诊断。
[0016]从以上所述可以理解，本领域需要提供改进的TSHR自身抗体测定的方法，并且具有例如能够区分与TSHR自身免疫相关的刺激性和阻断性自身抗体的优势。关于这一点，W001/27634公开了一种测定方法，用于对TSHR自身抗体进行鉴别诊断确定，从而刺激性TSHR自身抗体、阻断性TSHR自身抗体和非病原性TSHR自身抗体(既不是刺激也不是阻断)在一个样品中可以理论上由选择地确定。TSHR嵌合体被使用，其中用来结合刺激性和/或阻断性TSHR自身抗体的TSHR序列被受体G蛋白偶联类的不同受体的序列替换。并且还公开了在反应混和物中可溶性野生型重组体TSHR，如果需要的话。可以看出，嵌合体A代表TSHR嵌合体，其中TSHR第8-165位的氨基酸被促黄体素/绒膜促性腺激素受体的第10-166的氨基酸替换；嵌合体B代表TSHR嵌合体，其中TSHR第261-370的氨基酸被促黄体素/绒膜促性腺激素受体的第261-329的氨基酸替换；嵌合体C代表TSHR嵌合体，其中TSHR第8-165和261-370的氨基酸被促黄体素/绒膜促性腺激素受体的第10-166和261-370的氨基酸分别替换。
[0017]W001/63296相似地公开了一种进行鉴别诊断确定不同TSHR自身抗体的方法，从而刺激性TSHR自身抗体、阻断性TSHR自身抗体和非病原性TSHR`自身抗体在一个样品中又可以理论上由选择地确定。另一种至少结合被筛选的自身抗体的结合试剂(如野生型重组体TSHR)，在过量的被选择的TSHR嵌合体存在下与一个样品反应，其中，对阻断性或刺激性自身抗体是必须的TSHR结合序列被未结合到被筛选的不同类型的自身抗体的序列替换。在TO01/63296公开的TSHR嵌合体与以上W001/27634所述的嵌合体是相对应的。
[0018]以上TO01/27634 和 TO01/63296 中所公开的技术在 Journal of Endocrinology&Metabolism, 89 (I): 352-356 中，被 Minich 等进一步描述。[0019]Minich和同事们在这些研究中所描述的原理为:具有甲状腺刺激活性(即TSH激动剂)的TSHR自身抗体与TSHR (在25和165位氨基酸之间)的N末端的表位相互作用，而具有TSH拮抗剂活性的TSHR自身抗体与更靠近C末端(第261-370位的氨基酸)的表位相互作用。用嵌合体A进行的研究尤其表明它与125I标记的TSH结合得很好，并且用该嵌合体转染的细胞对TSH反应良好。
[0020]标记的TSH与嵌合体A和野生型TSHR的结合被含有TSHR自身抗体的血清所抑制。但是用野生型受体，血清的抑制作用会更强，这就是具有TSH激动剂和/或TSH拮抗剂活性的自身抗体的情况。基于TSH结合到嵌合体的抑制作用的分析方法，说明了具有TSH激动活性的TSHR自身抗体和TSH拮抗剂活性的TSHR自身抗体之间改进了的鉴别性(与野生型TSHR比较)，但是有大量重叠。该重叠限制了临床应用。同时，在更早些时候的研究中，基于标记了的TSH结合到天然(即野生型)TSHR的抑制作用分析TSHR自身抗体的方法，已经被改进到通过减少分析方法的敏感性(即使用稀释了的测试样品)，选择具有TSH拮抗剂活性的TSHR自身抗体。这是有效的，因为TSH拮抗剂自身抗体一般以高于TSH激动剂自身抗体的浓度存在于血清当中。
[0021]为提供改进的测定和分析在应答TSHR时产生的TSHR自身抗体的方法，和克服现有技术中出现的问题，本发明在此提供一种不同于Minich及其同事们现有技术的方案。具体地说，我们已经突变了 TSHR中一个氨基酸，并且观察了突变对TSHR结合和利用各种新配体的刺激作用的效果的影响。这些新配体包括人单克隆甲状腺刺激自身抗体(hMAbTSHRl )、鼠单克隆抗体(9D33)，后者是很有效力的hMAb TSHRl (和TSH)拮抗剂，以及作为强TSH激动剂的鼠单克隆抗体。
[0022]与现有技术相比，我们的研究已经令人惊讶地产生了一种可以提供更加清楚得区别各种TSHR配体的系统。更具体得说，我们已经识别了一个特异的TSHR点突变，该TSHR主要是消除具有TSH激动剂活性的TSHR抗体(自身抗体和单克隆抗体)的作用，而具有TSH拮抗剂活性的TSH受体抗体(自身抗体和单克隆抗体)的效果不会受到同样突变的影响或增 加。
[0023]本发明因而提供一种新的和改进了的能区分刺激性和阻断性TSHR抗体群的方法，在此提供一种突变的TSHR制品，该制品包括至少一个点突变，其特征在于，在所述突变的TSHR制品中，至少在相应于一个全长人TSHR第255氨基酸位点的氨基酸Arg突变为另一个氨基酸残基。从而所述突变的TSHR制品能够区分性地与患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH相互作用，因为(i)与对照TSHR制品相互作用相比较，与突变的TSHR制品相互作用的患者血清刺激性TSHR自身抗体的刺激效果根本上降低或基本上消除，所述对照TSHR制品的氨基酸序列对应于突变的TSHR制品的序列，但是不存在全长人TSHR第255位氨基酸相应位置的Arg的突变，(ii)与所述对照TSHR制品相互作用相比较，与突变的TSHR制品相互作用的TSH的刺激效果没有受到显著影响，和(iii )与所述对照TSHR制品相互作用相比较，与突变的TSHR制品相互作用的患者血清阻断性TSHR自身抗体的阻断效果基本上不受影响或增加，从而所述突变的TSHR对差别筛选和识别待筛选的体液样品中的患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH是有效的。
[0024]在本发明的一项优选实施例中，至少对应于全长人TSHR第255氨基酸位点的氨基酸Arg点突变为带负电的氨基酸残基，优选是Asp。因而优选地，在此提供了一种突变的TSHR制品，该制品包括至少一个点突变，特征在于，在所述突变的TSHR制品中，至少相对于全长人TSHR第255氨基酸位点的氨基酸Arg突变成Asp，从而所述突变的TSHR制品可以区分性地与患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH相互作用，因为(i )与对照TSHR制品相互作用相比，与突变的TSHR制品相互作用的患者血清刺激性TSHR自身抗体的刺激效果根本性地降低或基本上被消除，该对照TSHR制品相应于所述突变的TSHR制品的氨基酸序列，但不存在与全长人TSHR第255氨基酸位点相对应的所述的Arg的突变，(ii )与所述对照TSHR制品相互作用的刺激效果相比较，当与突变的TSHR制品相互作用时，TSH的刺激效果不会受到明显的影响，和(iii)与所述对照TSHR制品相互作用相比较，与突变的TSHR制品相互作用的患者血清阻断性TSHR自身抗体的阻断效果基本上不受影响或增加，从而所述突变的TSHR对差别筛选和识别待筛选的体液样品中的患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH是有效的。
[0025]适当地，本发明所提供的突变的TSHR制品可以包括一个具有如上所述突变的全长野生型人TSHR。或者，突变TSHR制品可以包括具有如上所述突变的全长野生型人TSHR的片段，并且该片段能够与如上所述的患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH区分性地相互作用。进一步的氨基酸突变可以存在于如上所述的突变TSHR制品中，所述的进一步突变可以是点突变，该点突变进一步提高突变的TSHR制品与患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH区分性地相互作用，或者该点突变表现为沉默替换、插入或缺失，但都不会改变或根本改变本发明提供的突变TSHR制品的生物活性或功能。
[0026]当进一步突变是保守性的氨基酸替换时，这种替换是指具有相似特性的氨基酸替换了突变的TSHR制品中的氨基酸。如同一般见到的保守性替换为置换，在下列各组内的氨基酸中一个替换另一个，所述组包括脂肪族氨基酸；羟基氨基酸；酸性氨基酸；酰氨类氨基酸；碱性氨基酸；和芳香族氨基酸。
[0027]在此所使用的术 语“片段”是指与本发明的突变TSHR制品相关的氨基酸序列，其与部分而不是全部的野生型人TSHR的氨基酸序列相对应，并且包括至少与全长人TSHR第255氨基酸位点相对应的氨基酸Arg突变成另一个氨基酸残基(如所述)，其片段可以区分性地与患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH相互作用，从而使差别筛选和识别待筛选的体液样品中的患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH成为可能。如在本发明突变TSHR制品范围所提供的“片段”可以是“独立式”，即不是其它氨基酸或多肽的一部分或不融合到其它氨基酸或多肽，或者它们可以是一个比较大的多肽的一个组成部分，在其中形成一部分或是一个区域。这样的片段因而可以合并到“骨架”式多肽，其中，其它的氨基酸以在构象、排列或序列上“支撑”突变TSHR片段制品的氨基酸，且该片断的构象、排列或序列与野生型TSHR制品氨基酸活性位点的构象、排列或序列相似或基本相似的。
[0028]关于野生型人TSHR氨基酸序列的全序列信息可以参考本领域出版物和/或受体序列的氨基酸数据库而易于获得，如此，本发明所有适当的突变制品及其突变片段的整个序列，可以基于已知的野生型序列并结合本发明说明书所公开的内容而很容易得到。
[0029]如本发明所提供的突变TSHR制品在差别筛选和识别患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH具有诊断功能，因此在提供可靠的对与TSHR自身免疫反应相关的自身免疫疾病的诊断方法，和解决很多与至今为止本领域已知的如以上所述的诊断方法和试剂盒相关的问题上向前进了一大步，尤其是与W001/63296和W001/27634的公开相比具备很多优势。
[0030]所以，根据本发明，突变的TSHR制品具有在如下方面的应用，即，如在此之前提到的，该用途是差别筛选和识别受试者(尤其是人)体液样品中的患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH，且该受试者疑似遭受、易患或患有与对TSHR免疫反应相关的自身免疫疾病，或正从所述疾病中恢复。
[0031]本发明还提供了突变TSHR制品在如下方面应用，即，如在此之前提到的，对受试者(尤其是人)进行与针对TSHR免疫反应相关的自身免疫疾病的诊断,该受试者疑似遭受、易患或患有与针对TSHR的免疫反应相关的自身免疫疾病，或正从所述疾病中恢复。
[0032]本发明因而还提供了一种试剂盒，该试剂盒包括如在此之前提到的突变TSHR制品，以及检测突变TSHR制品区分性地与待筛选体液样品中患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH相互作用的检测工具(means)。
[0033]本发明还进一步提供了一种方法，该方法能够差别筛选受试者体液样品中的患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH，该受试者被怀疑遭受、易患或患有与对TSHR免疫反应相关的自身免疫疾病，或正从所述疾病中恢复。所述方法使用突变TSHR制品区分性地与受试者体液样品中的患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH相互作用，并对其进行检测。
[0034]本发明还进一步提供了一种诊断受试者(尤其是人)可能发作或存在与针对TSHR的免疫反应相关的自身免疫疾病的方法，该受试者被怀疑遭受、易患或患有与针对TSHR的免疫反应相关的自身免疫疾病，或正从所述疾病中恢复。所述方法使用如在此之前所述的突变TSHR制品区分性地与受试者体液样品中的患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH相互 作用，并对其进行检测，从而提供受试者(尤其是人)可能发作或存在与针对TSHR的免疫反应相关的自身免疫疾病的诊断。
[0035]本发明还进一步提供延迟或阻止受试者(尤其是人)中与针对TSHR的免疫反应相关的自身免疫疾病的发作的方法，该受试者被怀疑遭受或易患与对TSHR免疫反应相关的自身免疫疾病，或正从所述疾病中恢复。所述方法使用基本上如在此之前所述的突变TSHR制品首先区分性地与刺激性和/或阻断性TSHR自身抗体相互作用，并对其进行检测，所述自身抗体可作为与对患者体液样品中TSHR免疫反应相关的自身免疫疾病发作或存在的标志，进而为该受试者提供与TSHR免疫反应相关的自身免疫疾病发作或存在的诊断。然后对患者进行治疗，以延迟和/或阻止与TSHR免疫反应相关的自身免疫疾病发作。
[0036]本发明还进一步提供一种治疗受试者与针对TSHR的免疫反应相关的自身免疫疾病的方法，所述方法使用基本上如在此之前所述的突变TSHR制品，首先区分性地与刺激性和/或阻断性TSHR自身抗体相互作用，并对其进行检测，该自身抗体是在对受试者体液样品中的TSHR免疫应答时产生的，进而为患者提供自身免疫疾病的诊断，并对受试者施用对治疗这种自身免疫疾病有效的至少一种有效治疗剂量的治疗剂。
[0037]给药的治疗剂量根据要治疗的特定的自身免疫疾病状况而定，如患者的年龄，并最终由医生的判断而定。[0038]本发明还进一步同时提供基本如在此之前描述的试剂盒与基本如在此之前所描述的与TSHR的免疫反应相关的自身免疫疾病有效的至少一种有效治疗剂量的治疗剂的组合
[0039]本发明待筛选的体液样品一般包括血液样品或血液的其它液体组分，尤其是如血清样品或血浆样品，但是样品还可以是另一种生物液体，如唾液或尿或可溶性组织抽提物，或获自穿刺活检。
[0040]本发明的突变TSHR制品基本上如在此之前所述，其还适于当作一种治疗剂，治疗与TSHR免疫反应相关的自身免疫疾病，或对治疗免疫疾病的一种适当的治疗剂进行识别。例如，突变TSHR制品可以以治疗性地与受试者(尤其是人)的循环的刺激性和/或阻断性TSHR自身抗体相互作用，或基本上将所述自身抗体去除,该受试者被怀疑遭受、易患或患有与对TSHR免疫反应相关的自身免疫疾病，或正从上述疾病中恢复。
[0041]所以，本发明还提供一种药物组合物，包括基本如在此之前所述的本发明的突变TSHR制品，以及药物可接受的载体、稀释剂或赋型剂，其中，突变TSHR制品能够区分性地与TSHR应答反应中产生的刺激性和/或阻断性自身抗体相互作用。
[0042]本发明还提供一种基本上如在此之前所述的突变TSHR制品用于制备治疗Graves病的药物。尤其是，一种如本发明提供的突变TSHR制品适于制备治疗Graves病的至少某些眼部症状的药物。
[0043]本发明的组合物或药物应该包含治疗性或预防性剂量的本发明的突变TSHR制品，该制品处于药学上可接受的载体中。所述药物载体可以为任何适于递送突变TSHR制品给患者的相容的、非毒性物质。消过毒的水、醇、脂肪、腊和惰性固体都可以当作载体。药物可接受的佐剂、缓冲剂、扩散剂等等，也都可以结合到药物组合物中。该组合物可以是包含单一的突变TSHR制品或者也可以包含两个或更多的本发明的突变TSHR制品。
[0044]本发明的药物组合物对肠外给药很有用。优选地，该组合物为肠外给药，即通过皮下、肌肉或静脉给药。所以，本发明提供用于肠外给药于患者的组合物，其中该组合物包括可接受的载体(如以上所述)中的突变TSHR制品的溶液或分散液。药物组合物中的突变TSHR制品的浓度可以变化很大，从小于大约0.1%的含量，通常至少大约1%的含量到大到20%的含量或更高。一般用于肌肉注射的药物组合物可以制成含有例如，Iml的消毒缓冲水和I到100 μ g的本发明纯化了的突变SHR制品。一般用于静脉注射的组合物可以制成含有100到500ml的消毒Ringer液和100到500mg的本发明纯化了的突变SHR制品。现有的制备肠外给药组合物的方法都是本领域众所周知的，并且在各种资料中有更详尽的描述，包括例如 Remington, s Pharmaceutical Science, 15th Edition, Mack PublishingCompany, Easton, Pa.(1980)。
[0045]本发明还进一步提供一种多核苷酸，包括:
[0046](i)编码基本上如在此之前所述的突变TSHR制品的核苷酸序列；
[0047](ii)包括(i)中序列的等位基因变异的核苷酸序列；
[0048](iii)包括(i)中序列的片段的核苷酸序列；或
[0049](iv)在严格的条件下与(i)中序列杂交的核苷酸序列。
[0050]本发明进一步提供了引物核苷酸序列Arg255Asp F;Arg255Asp R;如表I中所示，和/或由于遗传密码简并性在密码子序列上与它们不同的核苷酸序列。应当理解，虽然核苷酸仅用于表I中所列的引物，但是其余编码本发明突变TSHR制品的核苷酸可以很容易参照本领域的出版物和/或受体序列数据库而获得，因为已给出的野生型人TSHR全长序列是本领域众所周知的。
[0051]更具体地说，可以参考实施例中描述的特定的技术，即发生于本发明提供的多核苷酸序列里并用来影响本发明突变的人TSHR制品中的点突变的突变，是通过使用在表I中的以下引物序列对Arg255Asp F:Arg255Asp R而实现的，即，使255位点(Arg)突变成255位点(Asp)。更优选的是，表I中的引物用于PCR扩增以获得所需的突变核苷酸序列，以及相应的本发明的突变人TSHR制品是通过表达本发明的多核苷酸而适当地获得或获得的。基本如在此所描述的本发明的突变TSHR制品能够在产生重组蛋白质的各种系统中表达。例如在哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中的表达是优选的，而且CHO细胞的特殊用途与pcDNA5.1/FRT载体一同在实例中被描述。或者，本发明的突变TSHR制品可以利用本领域熟知的技术，用传统的肽合成方法来合成产生。
[0052]本发明还提供一种制备基本如在此之前描述的突变TSHR制品的方法，该方法包括:
[0053](i)提供一种如基本在此所述的宿主细胞；
[0054](ii)培养宿主细胞；和
[0055]( i i i )回收本发明的突变TSHR制品。
[0056]回收本发明的突变TSHR制品一般使用传统的分离和纯化技术，如本领域技术人员熟知的色谱分离或免疫分离。
[0057]本发明的多核苷酸可以为DNA的形式，包括，例如cDNA、合成DNA和基因组DNA，所述DNA通过克隆适当地获得或通过化学合成技术或其结合而产生的。本发明一个优选实施例优选地包括cDNA或合成DNA。
[0058]本发明还涉及在此所描述的多核苷酸变异体，而所述多核苷酸变异体编码本发明提供的突变TSHR制品。多核苷酸的变异体可以是一种自然发生的变体，如自然发生的等位基因的变异体，或者是一种非自然发生的变体。这种非自然发生的多核苷酸变体可以通过突变技术而产生。
[0059]在这一点上的变异体是不同于之前所述的通过核苷酸替代、缺失或插入而形成的多核苷酸。替代、缺失或插入会涉及一个或多个核苷酸。编码区的改变会产生保守或不保守的氨基酸的替代、缺失或插入。
[0060]适宜地，本发明的变异体多核苷酸在整体长度中与编码在此所描述的突变TSHR制品的多核苷酸至少具有70%的同一'丨生，以及与这些多核苷酸互补或杂交的多核苷酸。或者，最优选的是那些多核苷酸，它们包括一个占全长至少80%的区域与编码所述的突变TSHR制品的多核苷酸具有同一性，以及与这些多核苷酸互补或杂交的多核苷酸。从这个角度来看，在整体长度中至少具有90%同一性的多核苷酸尤其是优选，并且在这些尤其优选的多核苷酸中，那些至少具有95%同一性的多核苷酸是特别优选的。更进一步说，在具有至少95%同一'丨生的多核苷酸中,那些具有至少具有97%同一'丨生的多核苷酸是高度优选的,而在这些多核苷酸中，那些具有至少具有98%同一性和至少具有99%同一性的多核苷酸尤其是高度的优选，至少具有99%同一性的多核苷酸更优选。
[0061]基本如在此之前所述，本发明还涉及杂交到以上所述的多核苷酸的序列。在这一点上，本发明尤其涉及在严格条件下杂交到以上所述的多核苷酸的多核苷酸。在此，术语“严格的条件”是指杂交只是在两条序列之间具有至少95%和优选为97%互补一致性的情况下才发生。
[0062]本发明还涉及载体，该载体包括本发明的一个核苷酸或多个核苷酸、用本发明的载体进行基因改造的宿主细胞，和用重组技术生成的本发明的突变TSHR制品的产物。
[0063]所以，本发明还提供一种生物功能性载体，可以携带如在此之前所描述的多核苷酸并能将该多核苷酸引入到一个宿主有机体的基因组中。
[0064]宿主细胞可以被遗传改造以并入多核苷酸并表达本发明的突变TSHR制品，本发明因而提供一种用一种多核苷酸或多种多核苷酸或一种载体系统(每一种都基本如在此所描述)来转化或转染的宿主细胞。用任何一种众所周知的常规技术可以将适当的DNA序列插入到载体。
[0065]本发明进一步提供一种方法，用以识别可以差别筛选和识别体液样品中患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH的突变TSHR制品。该方法包括识别潜在的TSHR相互作用区域和其内的氨基酸残基，所述氨基酸残基的识别是根据它们与TSHR的结合伴侣(如hMAb TSHRl，9D33或TSH)的相互作用能力(包括针对野生型TSHR的不同的能力)而被进一步识别，并作为用于TSHR与一个或多个患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH的相互作用所需的候选氨基酸；进行所述候选氨基酸残基的点突变和检测所获得的突变TSHR制品与结合伴侣的相互作用，从而识别导致所获得的TSHR制品与患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH中的至少一个的相互作用受到抑制的点突变。
[0066]本发明还用于识别氨基酸残基，该氨基酸残基为TSHR表位区域的关键，因此提供一种方法，包括识别TSHR的潜在的相互作用区域和其内的氨基酸残基，所述氨基酸残基的识别是根据它们与TSHR结合伴侣(如hMAb TSHRl，9D33或TSH)的相互作用能力(包括针对野生型TSHR的不同的能力)而被进一步识别，并作为用于TSHR与一个或多个患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻 断性TSHR自身抗体和TSH相互作用所需的候选氨基酸；进行所述候选氨基酸残基的点突变和检测所获得的突变TSHR制品与结合伴侣的相互作用，从而识别用于TSHR与患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH分别的相互作用的关键氨基酸残基。
[0067]本发明可被进一步用来识别氨基酸残基，该氨基酸残基是所述TSHR的构象所需的，从而使其与患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH中的一个或多个相互作用，因此提供一种方法，包括识别潜在的TSHR相互作用区域和其内的氨基酸残基，所述氨基酸残基的识别是根据它们与TSHR结合伴侣(如hMAb TSHRl，9D33或TSH)的相互作用能力(包括针对野生型TSHR的不同的能力)而被进一步识别，并作为用于TSHR的构象所需的候选氨基酸，从而使其与所述患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH中的一个或多个相互作用；进行所述候选氨基酸残基的点突变和检测所获得的突变TSHR制品与结合伴侣的相互作用，从而识别用于所述TSHR的构象的关键氨基酸残基，所述构象使TSHR与一个或多个患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH分别的相互作用。
[0068]在以上所述的每一个方法中，被检测的突变TSHR制品的相互作用优选是突变TSHR的刺激作用或这种刺激的阻断作用，所述检测是通过检测结合伴侣与突变TSHR制品相互作用而产生的cAMP而进行的。
[0069]如所述，位于相应于全长人TSHR第255位点的氨基酸Arg已经被本发明识别为人TSHR的关键氨基酸，该氨基酸用于抗体结合并且所述人TSHR的突变能够针对刺激性和阻断性抗体群进行鉴别诊断。
[0070]本发明还提供了存在于TSHR制品、位于相应于全长人TSHR第255个氨基酸位点的氨基酸Arg，作为TSHR抗体的结合位点。本发明还进一步提供了存在于TSHR制品、位于相应于全长人TSHR第255个氨基酸位点的氨基酸Arg，作为TSHR受体自身抗体或其一个或多个片段的结合位点。本发明还提供存在于TSHR制品、位于相应于全长人TSHR第255个氨基酸位点的氨基酸Arg，作为TSHR的结合伴侣的结合位点，所述结合伴侣包括或是来自人单克隆或复合体抗体，或其一个或多个片段。本发明提供一个存在于突变TSHR制品、位于相应于全长人TSHR第255个氨基酸位点的突变氨基酸残基,用于差别筛选待筛选体液样品中的一个或多个患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSHJt选用于识别体液样品中是否存在刺激性TSHR自身抗体。本发明提供一个存在于突变TSHR制品、位于相应于全长人TSHR第255个氨基酸位点的突变氨基酸残基，用于诊断与TSHR相关的自身免疫疾病的用途。更确切地说，本发明提供了存在于突变TSHR制品、位于相应于全长人TSHR第255个氨基酸位点的氨基酸Arg,用于差别筛选待筛选体液样品中的一个或多个患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH，优选识别体液样品中是否存在刺激性TSHR自身抗体的用途。本发明还进一步提供存在于突变TSHR制品、位于相应于全长人TSHR第255个氨基酸位点的氨基酸Arg用于诊断与TSHR相关的自身免疫疾病的用途。
[0071]本发明提供了一种结合复合物，包括(a)如位于相应于全长人TSHR第255个氨基酸位点的氨基酸Arg所示的结合位点；和(b)其结合伴侣,该结合伴侣优选包括或来自人单克隆或复合体抗体，或其一个或多个片段。
[0072]结合伴侣适当地包括，或来自与TSHR相互作用的人单克隆抗体，或其一个或多个片段。或者，该结合伴侣包括，或来自与TSHR相互作用的人重组抗体，或其一个或多个片段。优选地，结合伴侣包括一种与TSHR相互作用的人单克隆或重组抗体，或其一个或多个片段。优选地，结合伴侣进一步的特征在于抑制TSH与TSHR结合的能力，和/或其刺激TSHR的能力，所述的两种能力是与来自患有Graves病的患者血清中的TSHR自身抗体的抑制性和刺激性相比而言的。
[0073]本发明提供的尤其优选的一种复合物的结合伴侣是人TSHR单克隆抗体hMAbTSHRl,如PCT专利申请W02004/050708A2中所描述。如以上的现有技术所述，hMAb TSHRl的结合位点还没有公开，由于TSHR复合物的特性以及对其的抗体反应的不同特性，所公开的现有技术还不足以确定或预测所述的表位区域或结合位点。
[0074]以下的例证性解释用于帮助理解某些特定的本发明所使用的术语。这些解释仅用于方便理而不是对本发明的限制。
[0075]TSHR的结合伴侣描述了一种具有对TSHR的结合特异性的分子。在此所描述的结合伴侣可以天然获得或整个地或部分地经合成而产生。这种结合伴侣有一个结构域或区域，其特异性地结合到因而也是互补到一个或多个TSHR的表位区域，该结合伴侣可包括抗TSHR的刺激性和/或阻断性抗体，该抗体可以是自身抗体、单克隆或重组抗体，或其它配体，如TSH。
[0076]结合位点是指一个位点，如TSHR的一个原子、功能性基团或氨基酸残基，它们能够结合到TSHR的抗体或其它配体或结合伴侣。根据空腔内特定的分子，位点会由于电荷、空间等因素而表现出吸引或排斥的相互结合作用。
[0077]通过结合伴侣的TSHR的阻断说明了结合伴侣结合到TSHR的能力从而抑制例如环AMP (cAMP)的生成，而该cAMP是如在此所述的TSHR刺激作用的结果。
[0078]阻断性TSHR抗体结合到TSHR并产生如在此所述的TSHR的阻断。
[0079]区分性地相互作用或区分性的相互作用，是针对本发明的突变TSHR制品而言，是指(i)与对照TSHR制品相互作用相比，与突变的TSHR制品相互作用的患者血清刺激性TSHR自身抗体的刺激效果基本上降低或基本被消除，该对照TSHR制品具有与所述突变TSHR制品相对应的氨基酸序列，但不存在与全长人TSHR第255氨基酸位点相对应的所述Arg的突变，(ii)与所述对照TSHR制品相互作用的刺激效果相比较，当与突变的TSHR制品相互作用时，TSH的刺激效果不会受到明显的影响，和(iii)与所述对照TSHR制品相互作用相比较，与突变的TSHR制品相互作用的患者血清阻断性TSHR自身抗体的阻断效果明显不受影响或增加。以上(是否被抑制、不变或增强)所述的相互作用是在或者为TSHR的刺激作用或者为TSHR的阻断作用的情况下。至于突变TSHR制品与患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH的结合相互作用或亲合性，如在实例中进一步所描述的，在某些情况下，与所观察的针对本发明的突变TSHR制品的刺激和/或阻断结果似乎不吻合，但可能例如是由突变受体的表达水平的降低而造成的。
[0080]“F”在引物定义和其命名上指正向引物。
[0081]宿主细胞是指被转化或转染的细胞，或能够通过外源多核苷酸序列进行转化或转染的细胞。
[0082]同一性，为本领域所熟知，指两个或更多的多肽序列，或两个或更多的多核苷酸序列之间的关系，所述关系通过对序列进行比较而定。
[0083]突变TSHR制品是指一种TSHR制品，包括一个或多个点突变，其特征在于所获得的TSHR制品能够差别筛选和识别待筛选的体液样品中的患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH。但是，特定的本发明的突变TSHR制品包括至少一个点突变，其特征在于至少有一个与全长人TSHR第255个位点的氨基酸对应的位点的氨基酸Arg突变成突变TSHR制品中不同的氨基酸残基。
[0084]点突变是指一个氨基酸或核苷酸被另一个氨基酸或核苷酸替换。其在本发明的范围内包括通过使用PCR引物以及之后的突变核苷酸序列的表达而产生的点突变。在此所使用的该术语点突变还包括通过已知的合成技术而获得的突变，例如，使用传统的肽合成来影响所需的多肽序列的合成而获得的突变，其中，合成的序列包括所需氨基酸与另一个氨基酸的置换。
[0085]“R”在引物定义和其命名上指反向引物。
[0086]通过所述的结合伴侣的TSHR的刺激作用说明了结合伴侣结合到TSHR的能力和其效果，例如，cAMP的形成是由于与TSHR的这种结合的结果。该刺激作用类似于TSH或TSHR自身抗体结合到TSHR的反应，并且以这种方式，在此所述的结合伴侣模仿了 TSH或TSHR自身抗体结合到TSHR的效果。
[0087]刺激性TSHR抗体结合到TSHR并刺激在此所述的TSHR。
[0088]TSH是指促甲状腺激素或甲状腺刺激激素。
[0089]TSHR是指促甲状腺激素或甲状腺刺激激素受体，本领域也将它称为TSH受体。
[0090]TSHR自身抗体是指在患与TSHR相关的自身免疫疾病期间产生的抗TSHR的抗体。根据所产生的抗体的类型，或者由于TSHR对TSH分子的屏蔽而出现对T3或T4形成和释放的抑制，或者因为产生的抗体模仿TSH的作用刺激甲状腺激素的合成和释放，T3和T4会以失控的方式被释放。
[0091]TSHR制品是指一个多肽序列，如本文所述，其与全长野生型TSHR相对应，或者包括一个或更多个变异体、类似物、衍生物或其片段。
[0092]现在用下面的数据和实例来说明本发明，但它们都不是对本发明的限制。
[0093]实例
[0094]选择TSHR胞外结构域的各种氨基酸并将其突变成为丙氨酸。这些氨基酸包括:
[0095]Asp43,因为它是带电残基(电荷间的相互作用众所周知在TSHR与TSHR自身抗体和TSH的相互作用中很重要)(Rees Smith B, McLachlan SM, FurmaniakJ1988Autoantibodies to the thyrotropin receptor.Endocr Rev9:106-121)。另外，Asp43位于TSHR富亮氨酸结构域(LRD;aa36_281)的第一(即最N端)重复序列。相似地，也选择Glu61，因为它带电并位于TSHRLRD的第二重复序列。
[0096]GIul57(位于T SHR LRD的第6个重复序列)基于带电以及可能参与同TSHRLysl83 一起形成一个盐桥而被选择(Duprez L, Parma J, Costagliola S，HermansJj Van-Sande J，Dumont JEj Vassart G1997Constitutive activation of the TSHR byspontaneous mutations affecting the N—terminal extracellular domain.FEBSLetters409:469-474)。另外两个带电氨基酸，GIul78和Asp203基于它们分别位于第7和第8个LRD的重复序列而被选择。
[0097]带电荷氨基酸Asp232和Arg255基于它们分别位于TSHR LRD第9和第10重复序列而被选择。同时，位于LRD第10个重复序列的芳香族氨基酸Trp258突变成丙氨酸。更进一步地，位于LRD C端的氨基酸Asp276和Ser281由于可能参与TSHR活性而被突变(Corvilain B,Van Sande J, Dumont J E and Vassart G2001Somatic and germ linemutations of the TSH receptor and thyroid disease.Clin Endocrinol55:143—158;andRusso D，Arturi F，Chieari E，Filetti S1997Molecular insights into TSHRabnormality and thyroid disease.J Endocrinol Invest20:36-47).[0098]方法
[0099]利用PCR将特定氨基酸突变引入人TSHR序列
[0100]TSHR 全长核苷酸序列(Swiss prot 号:P16473_http://www.ncb1.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=protein&val = 136448;NCBl Entrez Nucleotideaccess ion number NMOO0369-http://www.ncb1.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=4507700)根据标准克隆方法，用BamHI和Xhol限制性位点被克隆至 pcDNA5.1/FRT 载体。
[0101]为每一个突变(表I)设计出特异性的“正向”和“反向”PCR引物，以改变编码适当氨基酸突变的核苷酸编码序列。建立起两个独立的PCR反应(PCR1和PCR2).[0102]加入PCRl 反应的试剂:32.5 μ L H2O, 2.5 μ L20x 三磷酸脱氧核苷(dNTPs) (5mmol/L)，5 μ LlOx Pfu DNA 多聚酶缓冲液(IOx Pfu 缓冲液;Promega), 2.5 μ LlOpmol/μ L Τ7 引物(表 1),2.5 μ LlOpmol/μ L 用于突变的〃反向〃引物，4 μ L pcDNA5.1/FRT TSHR 模板DNA(IOOng)和IyL Pfu DNA多聚酶(3个单位，Promega)。加入PCR2反应的试剂:34.5μ LH2O)，2.5 μ L20xdNTPs (5mmol/L conc)，5 μ LlOx Pfu 缓冲液,2.5 μ L 用于突变的〃正向〃引物(表I) IOpmol/μ L, 2.5 μ L牛生长激素多聚腺苷酸化信号反向引物(BGHR引物)(表I) IOpmol/ μ L, 2 μ L 模板 DNA (IOOng)和 I μ LPfu DNA 多聚酶(3 个单位)。
[0103]所使用的模板DNA的量由生成的PCR产物的长度决定。在以上所述实例中，PCRl产物长度是800个碱基对，PCR2产物长度是1600个碱基对。PCRl和PCR2产物的大小由TSHR序列中氨基酸的突变位点决定。
[0104]该PCR 反应使用 GeneAmp PCR System9700 (Applied Biosystems)在 94°C下 5 分钟，然后在94°C下I分钟，40°C下I分钟，以及72°C下2分钟(以50%温度变化速率从94°C到40°C以及40°C到72°C )的条件下进行30个循环，之后72°C下7分钟，最后将反应体系冷却到4°C。
[0105]PCR I和PCR2产物在TAE缓冲液的1%琼脂糖凝胶上跑电泳(40mmol/LTris-HClpH8.0, lmmol/L EDTA，0.114%冰醋酸)并且用解剖刀从凝胶上切除条带。按照说明书，用Geneclean II试剂盒(Anachem Ltd, Luton, LU2 OEB, UK)纯化条带。用本领域的标准方法确定DNA的浓度。该DNA用来建立PCR3反应，以构建含有突变的完整TSHR序列。PCR3反应含有:2.5 μ LlOxPfu 缓冲液，I μ L 的 20x dNTPs, 200ng 的 PCRl 产物和 200ng 的 PCR2 产物，I μ L Pfu DNA聚合酶和水，且终体积为25 μ L。将所述反应置于GeneAmpPCR系统在94°C下，1.5分钟，65°C下1.5分钟以及72°C下1.5分钟的条件下进行7个循环。然后将温度升高到94°C，2 分钟，并且将PCR4反应体系(2.5 μ LlOx Pfu缓冲液，1.3μ L20x dNTPs, 2.5 μ LΤ7引物IOpmol / μ L, 2.5 μ L BGHR引物IOpmoI/L, I μ L Pfu DNA聚合酶和水，且终体积为25 μ L)加到PCR3中。该混合物在94°C下I分钟，52 °C下I分钟和72°C下2分钟(以50%的温度变化速率从94° C到52°C并从52°C到72°C )的条件下进行30个循环，之后72°C下10分钟，最后将反应体系冷却到4 C。
[0106]PCR产物用50 μ L的1:1苯酚/氯仿混合物纯化，用乙酸钠和乙醇沉淀并风干，如本领域所述。将DNA重悬浮于Ix缓冲液B作限制性消化(RocheDiagnostics, Lewes, BN71LG, UK)并用限制性酶 BamHI/XhoI 在 37°C下切割 4 小时。PCR 条带在1%琼脂糖凝胶进行电泳，将条带切除并用Geneclean II试剂盒进行纯化。之后PCR产物被连接到BamHI/XhoI切割的pBluescript (Stratagene)上并且利用DNA测序检测突变(来自Amersham Biosciences的Sequenase version2DNA测序试剂盒)，如本领域所述。然后利用BamHI/XhoI限制性酶将突变的TSHR DNA从pBluescript移除并克隆到pcDNA5.1/FRT载体(Invitrogen),然后如上述对序列再进行确认。
[0107]利用FlD-1n系统将TSHR构律体转染至CHO细朐
[0108]长满细胞的一烧瓶的FIp-1n-CHO细胞(Invitrogen)以IxlO5-L 5x10s细胞/孔的密度接种至24孔盘的孔中，，且培养基的成分为=DMEM(Invitrogen)，10%新生小牛血清(Invitrogen), Ix L-谷氨酸胺(Invitrogen)和 Ix 非必需氨基酸(NEAA) (Invitrogen),不含抗生素。细胞在37°C，5%C02和>95%湿度下过夜培养。
[0109]pcDNA5.1/FRT TSHR DNA(如上述)和 P0G44DNA(Invitrogen)在灭菌水中被分别稀释成0.01 μ g/mL和0.1 μ g/mL的溶液。P0G44DNA和TSHR DNA被混合成为3种不同的浓度:(1)9μ L 的 P0G44, 10μ L TSHR DNA and31 μ LOptimem I(Invitrogen) ; (2)8 μ LP0G44, 20 μ L TSHR DNA 和 22 μ L Optimem I; (3)9.5μ L P0G44, 5 μ L TSHR DNA 和 35.5 μ LOptimem I,并在室温下温育5分钟。将50 μ L的以1:25的比例在Optimem I中稀释的Lipofectamine (Invitrogen)加入每一个管中(以上所述的1-3个管)并于室温下温育20分钟。每一种温育混合物之后被加到I孔(24孔盘中)，该孔中具有95%融合FIp-1n-CHO细胞，在以上所述条件下过夜培养。将培养基移除，换上DMEM，10%FCS, Ix L-谷氨酰胺，IxNEAA和Ix青霉素(100u/mL)/链霉素(100 μ g/mL) (Invitrogen)并继续过夜培养。用Ixtrypsin/EDTA溶液(Invitrogen)将细胞从孔盘上分离并将其分至4个新的孔,在额外加入600yg/mL的潮霉素(Invitrogen)的以上所述培养基中生长。
[0110]用P0G44质粒DNA和 pcDNA5.1/FRT TSHR转染的细胞能将TSHR插入到 FIp-1n-CHO细胞基因组并赋予细胞抗潮霉素性，因而能在潮霉素选择培养基上生长。Invitrogen的Flp-1n系统设计成通过P0G44，构建体中的TSHR被插入到FIp-1n-CHO细胞的FRT位点。FIp-1n-CHO细胞含有一个FIp-1n位点每一个细胞，所以，在每一个实验中，TSHR DNAs能插入到基因组中的相同的地方，而且每一个细胞只存在一个拷贝。该系统具有这样的优点，即没有必要为那些具有理想表达水平的细胞(之后克隆细胞以发现一个稳定的细胞系)进行细胞群落的筛选。随后，表达在潮霉素选择培养基生长的突变TSHR的细胞可以快速扩增用于不同的实验。
[0111]刺激cAMP牛成的分析
[0112]按照W02004/050708A2 所述，分析了 hMAb TSHRl 和 TSH 刺激在 FIp-1n-CHO 细胞中生成cAMP的能力，所述FIp-1n-CHO细胞表达野生型和突变TSHR。简要地说，CHO细胞接种于96孔盘(12，500-20, 000细胞每孔)并在含有10%新生小牛血清的DMEM(Invitrogen)中温育48小时。然后移除DMEM，加入猪TSH稀释液(RSR Ltd; 0.01-3ng/mL)和hMAb TSHRlFab (0.1 -1 Ong/mT.)的 cAMP 分析缓冲液(不含 NaCl 的 Hank’s Buffered Salts 溶液，含有lg/L 葡萄糖，20mmol/L HEPES, 222mmol/L 鹿糖，15g/L 牛血清白蛋白(BSA)和 0.5mmol/L3异丁基-1-甲基黄嘌呤，pH7.4)的的稀释液，在37°C、含有5%C02大气中培养I小时。在移走测试液之后，利用Amersham Biosciences的Biotrak酶免疫测定系统,溶解细胞用于分析cAMP。包含具有TSH激动剂活性的TSH受体抗体的血清实验，用同样的方法来进行，但不同的是，该血清样品在实验开始之前在cAMP分析缓冲液中被稀释到1:10。
[0113]TSH拮抗剂活性的测定
[0114]在某些实验中，患者血清和抗TSHR的鼠单克隆抗体抑制猪TSH刺激活性的能力被测定。该测定是通过比较(a)单独TSH的刺激效果和(b)在患者血清和鼠单克隆抗体存在下TSH的刺激效果而进行的。简要地说，在稀释在cAMP分析缓冲液中的50 μ L患者血清或50 μ L的鼠单克隆抗体添加到载有细胞的孔中，之后加入50 μ L的缓冲液或50 μ L的TSH (加入前浓度为0.6ng/mL,终浓度为0.3ng/mL)，然后如以上所述进行刺激分析时一样温育。移除测试液，使用Biotrak酶免疫分析系统,融解细胞并用作cAMP分析。
[0115]清洁剂增溶的野牛型和突变TSHR制品的制备[0116]表达野生型(wt)或突变的TSHRFIp-1n-CHO细胞在175cm2烧瓶中生长到汇合时，用Dulbecco的PBS(不含I丐和镁离子)(Invitrogen)冲洗并刮到IOmL冰冷缓冲液A (50mmo I /T, NaCl, 10mmol /T, Tris-HCl pH7.5),上述缓冲液含有来自 Roche Diagnostics的蛋白酶抑制品(每50mL溶液编号1836145的产品I片)和lmmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF))。将细胞在4°C、IOOOxg下离心5分钟，沉淀物在ImL缓冲液A中重悬浮，并在冰上的玻璃匀浆器上被匀浆。细胞膜在4°C、12，OOOxg离心30分钟，沉淀物在6mL的缓冲液A、0.5g/L叠氮钠和2.75g/L碘乙酰胺中被重新悬浮，并如以上所述进行沉淀。膜沉淀物随即在ImL含有l%Triton X-100和0.5g/L叠氮纳的冰冷缓冲液A中重悬浮，并匀浆。增溶的TSHR制品在4°C、90，OOOxg离心2小时，上清液在_70°C等份储存。
[0117]标记TSH和标记单克隆抗体与野生型或突变TSHR的结合
[0118]在这些实验中，如以前所述(W02004/050708A2)制备用125I标记或未标记的猪TSH (70单位每mg，来自RSR Ltd的)和单克隆抗体(Fab或IgG)。
[0119]首先制备TSHR制品的稀释液。在这些实验中，塑料管(Maxisorp Star;NUNC)被200 μ L的涂覆缓冲液(0.lmmol/L Na2CO3, pH为9.2)中的浓度为10 μ g/mL的抗TSHR C端的鼠单克隆抗体涂覆，4°C下过夜。在冲洗以及后涂覆(10mg/mL在水中的BSA)之后，所述管用分析缓冲液(1 Ommol /T, Tris-HCl pH7.8, SOmmoI /T, NaCl 和 lmg/mL BSA)冲洗，该分析缓冲液含有0.l%TritonX-100。在下一个步骤中，200 μ L的增溶野生型或突变TSHR制品被加入管中，并在4°C下温育过夜。管中内容物被吸走，用分析缓冲液和50 μ L的起始缓冲液(RSR Ltd)冲洗该管，然后加入50 μ L的分析缓冲液和50 μ L的1251-TSH或125I标记的单克隆抗体(10，000 — 15, OOOcpm)并在室温下摇床培养2个小时。将溶液吸走，冲洗管并用伽玛计数器计数。
[0120]提供15-40%的标记TSH或单克隆抗体结合的TSHR制品稀释液用来制备作分析用的TSHR涂覆管。在某些实验中，用50yL的分析缓冲液替代浓度增加的未标记的TSH(0.4-500munits/mL)或 单克隆抗体(0.001-1.0 μ g/mL)的溶液。计算出结合的和游离的TSH或单克隆抗体的浓度，该结合针对结合/游离所做的图(Scatchard分析)用来计算对TSHR的亲和性。
[0121]含有突变TSHR的CHO细胞刺激作用的分析
[0122]评估TSH或hMAb TSHRl在含有各种突变TSHR转染的CHO细胞中刺激产生cAMP的能力。结果如表2a-2j，15a-15x，和27a_27h所示，并在表3、16和28中进行总结。大多数突变引起对TSH和hMAb TSHRl应答反应的降低。但是，突变对激素和抗体的免疫应答的效果有明显的区别，在如下情况下，Arg80突变为Ala，Arg80突变为Asp，Tyr82突变为Ala, GIul07 突变为 Ala, Argl09 突变为 Ala, Argl09 突变为 Asp, Lysl29 突变为 Ala, Lysl29突变为Asp, Phel30突变为Ala, Lysl83突变为Ala, Lysl83突变为Asp, Tyrl85突变为Ala, Asp232突变为Ala, Arg255突变为Ala, Trp258突变为Ala ;和双突变:Arg255突变为Ala和Trp258突变为Ala; Trp258突变为Ala和Lysl83突变为Ala; Trp258突变为Ala和Tyrl85突变为Ala。这些氨基酸的任意一个突变引起对hMAb TSHRl的应答反应明显降低，而对TSH的应答反应基本保留。
[0123]针对Asp232，Arg255和Trp258突变的效果作了更详细的观察。在Asp232的例子中，附近的谷氨酰胺(Glu235)突变为Ala。但是，该突变对TSH或hMAb TSHRl (表4a)刺激作用的影响很小(相对于野生型而言)。相似地，与Trp258相邻的苏氨酸257的突变对激素或抗体的刺激作用(表4b)的影响很小。但是，作为双突变，Arg255突变为Ala和Trp258突变为Ala;Trp258突变为Ala和Lysl83突变为Ala;以及Trp258突变为Ala和Tyrl85突变为Ala对TSH的刺激作用影响很小或没有影响，但是hMAb TSHRl的刺激作用基本消失(分别如表4c、27g和27h所示)。更进一步地，Arg255(正电荷氨基酸)突变为负电荷天冬氨酸(而不是中性Ala)也对hMAb TSHRl的应答反应基本消失，但对TSH的刺激作用影响很小或没有影响(表4d)。这些结果在表5和28中做了总结。
[0124]Arg255突变为Asp对来自14个Graves患者的含有TSHR自身抗体的血清能力的影响作了研究，结果如表6所示。如表所示，表达该突变体的CHO细胞对14份血清的应答反应(相对于野生型)有很大的降低。与之对应的是，Arg80突变为Ala，Arg80突变为Asp, GIul07 突变为 Ala, Argl09 突变为 Ala, Argl09 突变为 Asp, Lysl29 突变为 Ala, Lysl83突变为Ala，Lysl83突变为Asp，影响一些血清，但对所有的测试用刺激性血清(表19a_19h并在表20有总结)的应答反应没有降低。只有Arg255突变为Asp以及双突变Trp258突变为Ala和Arg255突变为Ala，能够降低对所有测试用刺激性血清的应答反应(表6、19i，并在表20作总结)。
[0125]表7记录了不同剂量的hMAb TSHRl IgG和供体血浆(获自相同的用于分离淋巴细胞、制备hMAb TSHRl杂交瘤细胞的血液样品)对表达野生型TSHR和具有Arg255突变为Asp的TSHR的CHO细胞中产生cAMP的刺激作用。IgG和血浆对突变TSHR的影响相对于野生型明显减少，而且剂量反应的效果也是相似的。对各种具有甲状腺刺激活性(如W003/018632A2所述制备mTSMAb)的鼠单克隆抗体的效果，根据它们刺激CHO细胞的产生cAMP的能力，也进行了测试，所述CHO细胞用野生型TSHR和具有Arg255突变为Asp (表8)，Arg80突变为Asp, GIul07 突变为 Ala, Argl09 突变为 Ala, Argl09 突变为 Asp, Lysl29 突变为 Ala, Lysl83突变为Ala，Lysl83突变为Asp (表21a-g)的TSHR进行转染的。如表8和表21a_g以及表22中的总结，mTSMAbs的刺激效果被突变基本消除。也研究了具有TSH拮抗剂活性的4个患者的血清影响CHO细胞中TSH刺激产生cAMP的能力，所述CHO细胞表达野生型TSHR和具有Arg255突变为Asp的TSHR。所有4份血清在表达野生型和突变TSHR的CHO细胞中具有很强的TSH拮抗剂的作用(表 9)。另外，剂量反应的研究表明，在较低剂量时(高稀释)，患者血清TSH拮抗剂效果在表达突变受体的细胞中更强(表10)。同时，Glul07突变为Ala对患者的血清(表23a和24)表现出一个相似的增强了的拮抗剂效果，而另外两个突变，Argl09突变为Ala和Lysl83突变为Ala没有作用(表23b&c和24)(表24中的总结)。还研究了抗具有很强TSH拮抗剂(和hMAb TSHRl拮抗剂)活性(9D33，如在W02004/05078A2中所描述)的TSHR的鼠单克隆抗体的作用(表11，13a-j, 17a_v和表14和18中的总结)。如表11所示，9D33能够阻断表达野生型TSHR或具有Arg255突变为Asp的TSHR的CHO细胞的TSH刺激作用。另外，在低剂量时，9D33在表达突变受体细胞中的拮抗剂作用更强(表11)。与野生型TSHR相比(表17η和17v)，Aspl60突变为Ala和Arg274突变为Ala表现了 9D33增强了的拮抗剂作用，而Lys58突变为Ala，Arg80突变为Ala，Arg80突变为Asp，Tyr82突变为Ala, Glul07 突变为 Arg, Argl09 突变为 Ala, Argl09 突变为 Asp, Lysl29 突变为 Ala, Lysl29突变为Asp, Phel34突变为Ala和Lys250突变为Ala，表现出9D33的降低了的阻断TSH在表达这些突变的TSHR的CHO细胞中的刺激能力(表17和表18中的总结)。但是，所研究的32种不同突变中的19种，对9D33阻断TSH对cAMP刺激的作用没有影响(表13，14，17和 18)。
[0126]结合到突变TSHR的分析
[0127]TSHR氨基酸突变为丙氨酸、精氨酸或天冬氨酸对结合TSH、hMAbTSHRl和9D33MAb的影响如表12，25，29和表26中的总结所示。
[0128]Asp43 突变为 Ala, Glu61 突变为 Ala, Asp203 突变为 Ala, Gln235 突变为Ala, Glu251 突变为 Ala, Asp276 突变为 Ala 和 Ser281 突变为 Ala,对 TSH, hMAb TSHRl 或9D33的结合有很小或没有影响。但是，Glul07突变为Arg，Argl09突变为Asp，Lysl29突变为Asp, Lysl83突变为Asp和Asp232突变为Ala或Arg，导致检测不到TSH, hMAb TSHRl和9D33MAL.的结合。Tyr206突变为Ala对TSH和9D33来说具有检测不到的结合，没有对hMAbTSHRl的结合进行测试。Glul57突变为Ala, Aspl60突变为Ala, Lys209突变为Ala, Thr257突变为Ala和Trp258突变为Ala，阻止可测试到的TSH的结合但是对hMAb TSHRl和9D33MAb的结合影响很小或没有影响。Lys58突变为Ala，Ile60突变为Ala和Tyr82突变为Ala，表现出测试不到9D33MAb的结合，而与hMAb TSHRl和TSH的结合与野生型的相似。Arg80突变为Ala和Arg80突变为Asp，导致测试不到9D33MAb和hMAb TSHRl的结合，而TSH仍旧结合得很好。Glul07突变为Ala和Phel34突变为Ala，导致hMAb TSHRl and9D33MAb较低的结合亲和性，而TSH仍然结合得很好。Argl09突变为Ala表现出TSH的结合稍有降低，而hMAbTSHRl的结合保持不变并且9D33MAb的结合不可测试到。当GIul78突变为Ala时，观察到对TSH和hMAb TSHRl较低的结合，而9D33MAb的结合不受到影响。在Lysl29突变为Ala的情况下，TSH仍旧结合得很好，而对hMAb TSHRl的亲和性明显减小，并且9D33MAb的结合测试不到。Phel30突变为Ala, Tyrl85突变为Ala和Arg255突变为Ala，导致hMAb TSHRl结合的明显降低，以及9D33MAb结合的降低，而TSH仍然结合得很好。在Arg255突变为Asp的情况下，TSH的结合测试不到并且hMAbTSHRl的结合亲和性明显地减少，而9D33MAb结合不受影响。当Lys250突变为Ala, Arg274突变为Ala和Tyr279突变为Ala时，TSH的结合测试不到，并且hMAb TSHRl和9D33的结合亲和性减少。Lysl83突变为Ala增加了 TSH (未测试hMAb TSHRl和9D33MAb的 结合)的结合亲和性(表25)，如同双突变，Tyrl85突变为Ala和Lysl83突变为Ala (未测试hMAb TSHRl的结合，9D33MAL.的结合降低)(表29)的结果一样。
[0129]双突变，Arg255突变为Ala和Trp258突变为Ala，表现出不可测试的TSH结合，以及对hMAb TSHRl的亲和性的稍有减少，而9D33MAb仍然结合很好(表25)。Asp232突变为Arg和Arg255突变为Asp; Asp232突变为Ala和Trp258突变为Ala; Asp232突变为Ala, Arg255突变为Ala和Trp258突变为Ala; Trp258突变为Ala和Lysl83突变为Ala;Arg255突变为Ala和Lysl83突变为Ala;Trp258突变为Ala, Lysl83突变为Ala和Tyrl85 突变为 Ala;Arg255 突变为 Ala, Trp258 突变为 Ala, Tyrl85 突变为 Ala 和 Lysl83突变为Ala，都表现出对TSH, hMAb TSHRl和9D33MAb不可测试的结合(表29)。双突变，Asp232突变为Ala和Arg255突变为Ala也显示不结合TSH或9D33MAb，并且没有测试到对hMAb TSHRl的亲和性(表29)。在双突变的情况下，即GIuI57突变为Ala和Asp203突变为Ala, TSH的结合测试不到，与hMAb TSHRl的结合相似于野生型，并且9D33MAb的结合减少(表29)。Glul78突变为Ala和Asp203突变为Ala; Trp258突变为Ala和Tyrl85突变为Ala; Arg255突变为Ala和Tyrl85突变为Ala; Arg255突变为Ala, Trp258突变为Ala和Tyrl85突变为Ala，显示不可测试的TSH结合，明显减少的hMAb TSHRl结合以及稍有减少的9D33MAb的结合(表29)。在Arg255突变为Ala, Lysl83突变为Ala和Tyrl85突变为Ala的情况下，TSH的结合与hMAb TSHRl的结合测试不到，而9D33MAb的结合减少(表29)。
[0130]总结/解释
[0131]I)通过各种配体，根据刺激cAMP产生的作用，观察了对TSHR所选择的单个氨基酸进行突变的效果。
[0132]出乎意料的是某些氨基酸突变，对hMAb TSHRl的结合和/或刺激作用的影响比对TSH的结合和/或刺激作用大得多。对激素和抗体的影响的这种区别在以下情况下表现得最明显，当氨基酸发生以下突变时，即Arg80突变为Ala，Arg80突变为Asp，Tyr82突变为Ala, GIul07 突变为 Ala, Argl09 突变为 Ala, Argl09 突变为 Asp, Lysl29 突变为 Ala, Lysl29突变为Asp, Phel30突变为Ala, Lysl83突变为Ala, Lysl83突变为Asp, Tyrl85突变为Ala, Asp232突变为Ala, Arg255突变为Ala和Trp258突变为Ala。另外，Arg255突变为Ala和Trp258突变为Ala的双突变，比Arg255突变为Ala或Trp258突变为Ala的单独突变的效果更强。
[0133]更进一步地，Arg255突变成为相反电荷的Asp基本上消除了 hMAb TSHRl的刺激效果，而TSH的刺激作用基本不受影响。同时，来自14名患有Graves疾病患者的TSH受体自身抗体的刺激效果由于Arg255突变为Asp的突变而基本消失，如同6个鼠单克隆甲状腺刺激性抗体一样。
[0134]与Arg255突变为Asp不同的是TSHR的其它氨基酸的突变，包括Arg80突变为Ala, Arg80 突变为 Asp, Glul07 突变为 Ala, Argl09 突变为 Ala, Argl09 突变为 Asp, Lysl29突变为Ala, Lysl83突变为Ala, Lysl83突变为Asp和双突变Arg255突变为Ala和Trp258突变为Ala，这些突变减少或消除了 hMAb TSHRl但不是所有测试的患者血清的TSHR自身抗体的刺激效果。 ·
[0135]2)结果，也令人惊奇的是，TSHR氨基酸Arg255的突变是唯一一个发现的可以清楚地区分TSH刺激作用和患者血清TSHR自身抗体(包括hMAb TSHR1)的刺激作用的突变。
[0136]3)具有TSH拮抗剂活性的患者血清对阻断表达突变TSHR(Arg255Asp突变)的CHO细胞的TSH刺激作用是有效的。同时，具有很强TSH拮抗剂活性的鼠单克隆抗体(9D33)是表达野生型或突变(Arg255Asp)受体的CHO细胞中有效的TSH拮抗剂。
[0137]还发现Argl09突变为Ala的突变阻止9D33抑制TSH刺激作用的能力，但该突变对血清TSHR自身抗体(TSH拮抗剂自身抗体)阻断TSH刺激作用没有影响。
[0138]4)结果，TSHR Arg255突变为Asp的突变基本上消除了 TSH激动剂型TSHR自身抗体(包括hMAb TSHR1)与受体相互作用的能力。与之相反的是，TSH激动剂型TSHR自身抗体(和TSH)能够与突变受体很好地起反应。TSHRArg255突变为Asp的突变因而可以用来区别具有TSH激动剂活性的TSHR自身抗体和具有拮抗剂活性的TSHR自身抗体。
[0139]5)针对标记TSH和标记hMAb TSHRl结合到野生型和突变TSHR制品的分析表明，Arg255突变为Ala的突变降低了受体对hMAb TSHRl的亲和性，但是对结合TSH只有很小的影响。这与突变对产生cAMP的刺激作用的影响是一致的。[0140]在Asp232突变为Ala的情况下，没有测试到激素或抗体的结合，可能是由于突变受体的表达水平降低了。当Trp258突变为Ala时，TSH的结合同样也测试不到，而hMAbTSHRl的结合只减少了 3倍。
[0141]表I
[0142]
【权利要求】
1.突变的TSHR制品，所述制品包括至少一个点突变，其特征在于，在所述突变的TSHR制品中，至少是相应于全长人TSHR第255氨基酸位点的氨基酸Arg突变为带负电荷的氨基酸残基，从而所述突变的TSHR制品区分性地与患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH相互作用，因为(i )和与对照TSHR制品相互作用的患者血清刺激性TSHR自身抗体相比较，与突变的TSHR制品相互作用的患者血清刺激性TSHR自身抗体的刺激效果被降低或消除，所述对照TSHR制品的氨基酸序列相应于突变的TSHR制品的序列，但其不存在相应于全长人TSHR第255氨基酸位点的Arg的所述突变；(ii)与和对照TSHR制品相互作用的TSH相比较，与突变的TSHR制品相互作用时TSH的刺激效果没有受到影响jP(iii)与和所述对照TSHR制品相互作用的患者血清阻断性TSHR自身抗体相比较，与突变的TSHR制品相互作用的患者血清阻断性TSHR自身抗体的阻断效果没有受到影响或增加，从而所述突变的TSHR制品可有效差别筛选和识别待筛选的体液样品中的患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH。
2.根据权利要求1所述的突变的TSHR制品，其中，至少在相应于全长人TSHR第255氨基酸位点的氨基酸Arg点突变为Asp。
3.根据权利要求1所述的突变的TSHR制品，所述制品包括至少一个点突变，其特征在于，在所述突变的TSHR制品中，至少是相应于全长人TSHR第255氨基酸位点的氨基酸Arg突变为Asp，从而所述突变的TSHR制品区分性地与患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH相互作用，因为(i )和与对照TSHR制品相互作用的患者血清刺激性TSHR自身抗体相比较，与突变的TSHR制品相互作用的患者血清刺激性TSHR自身抗体的刺激效果被降低或消除，所述对照TSHR制品的氨基酸序列相应于突变的TSHR制品的序列，但其不存在相 应于全长人TSHR第255氨基酸位点的Arg的所述突变；(ii)和与对照TSHR制品相互作用的TSH相比较，与突变的TSHR制品相互作用时TSH的刺激效果没有受到影响jP(iii)和与所述对照TSHR制品相互作用的患者血清阻断性TSHR自身抗体相比较，与突变的TSHR制品相互作用的患者血清阻断性TSHR自身抗体的阻断效果没有受到影响或增加，从而所述突变的TSHR制品可有效差别筛选和识别待筛选的体液样品中的患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH。
4.根据权利要求1-3的任意一项所述的突变的TSHR制品，其为突变的全长人TSHR。
5.根据权利要求1-3的任意一项所述的突变的TSHR制品，其为人TSHR的突变的片段。
6.根据权利要求1-5的任意一项所述的突变的TSHR制品，包括进一步的氨基酸突变，该突变为替换、插入或缺失，但都不会改变突变的TSHR制品的TSH受体活性。
7.权利要求1-6任意一项所述的突变的TSHR制品在差别筛选和识别受试者体液样品中刺激性TSHR自身抗体、阻断性TSHR自身抗体和TSH，和/或在诊断受试者自身免疫性甲状腺疾病中的应用，所述受试者疑似遭受、易患、患有自身免疫性甲状腺疾病或正处于所述疾病的恢复中。
8.试剂盒，其包括权利要求1-6任意一项所述的突变的TSHR制品，以及能检测突变的TSHR制品与受试者体液样品中刺激性TSHR自身抗体、阻断性TSHR自身抗体和TSH的区别性相互作用的检测方法，所述受试者疑似遭受、易患、患有自身免疫性甲状腺疾病或正处于所述疾病的恢复中。
9.权利要求8所述的试剂盒与治疗有效量的至少一种治疗剂的组合，其中，所述治疗剂在自身免疫性甲状腺疾病的治疗中是有效的。
10.差别筛选受试者体液样品中的刺激性TSHR自身抗体、阻断性TSHR自身抗体和TSH的方法，所述患者疑似遭受、易患、患有自身免疫性甲状腺疾病或正处于所述疾病的恢复中，所述方法使用权利要求1-6任意一项的突变的TSHR制品，从而区分性地与受试者所述体液样品中的刺激性TSHR自身抗体、阻断性TSHR自身抗体和TSH相互作用，并对其进行检测。
11.药物组合物，包括权利要求1-6任意一项所述的突变的TSHR制品，以及药学可接受的载体、稀释剂或赋型剂。
12.权利要求1-6任意一项所述的突变的TSHR制品用于治疗中。
13.权利要求1-6任意一项所述的突变的TSHR制品用于制备治疗Graves病的药物。
14.权利要求1-6任意一项所述的突变的TSHR制品用于制备治疗Graves病的眼部症状的药物。
15.多核苷酸,包括: (i)编码权利要求1-6任意一项所述的突变的TSHR制品的核苷酸序列。
16.表I中的引物核苷酸序列Arg255AspF ；Arg255Asp R ;或它们由于遗传密码的简并性在密码子序列上不同的核苷酸序列，其中突变引物Arg255Asp F的序列为aggaactgatagcagacaacacctggactctta,突变引物 Arg255Asp R 的序列为 taagagtccaggtgttgtctgctatcagttccto
17.生物功能性载体系统，其携带权利要求15所述的多核苷酸并能将所述多核苷酸引入至宿主生物体的基因组中。
18.宿主细胞，其用权利要求15所述的一种多核苷酸或多种多核苷酸，或用权利要求17所述的载体系统转化或转染。
19.权利要求1-6任意一项所述的突变的TSHR制品的制备方法，包括: (i)提供如权利要求18所述的宿主细胞； (ii)培养宿主细胞；和 (iii )回收本发明的突变的TSHR制品。
20.识别突变的TSHR制品的方法，所述突变的TSHR制品可以差别筛选和识别体液样品中刺激性TSHR自身抗体、阻断性TSHR自身抗体和TSH，所述方法包括识别潜在的TSHR的相互作用区域和其内的氨基酸残基，所述氨基酸残基根据它们与TSHR的结合伴侣的相互作用能力而被进一步识别，并作为用于TSHR与一个或多个刺激性TSHR自身抗体、阻断性TSHR自身抗体和TSH的相互作用所需的候选氨基酸；进行所述候选氨基酸的点突变并检测所获得的突变的TSHR制品与结合伴侣的相互作用，从而识别导致所获得的突变的TSHR制品与刺激性TSHR自身抗体、阻断性TSHR自身抗体和TSH中的至少一个的相互作用受到抑制的点突变，所述点突变发生在位于相应于全长人TSHR第255个氨基酸位点的Arg，其中Arg255被选择性地点突变为带负电荷的氨基酸残基，从而使所述突变的TSHR制品区分性地与刺激性TSHR自身抗体、阻断性TSHR自身抗体和TSH相互作用。
21.识别TSHR与一个或多个刺激性TSHR自身抗体、阻断性TSHR自身抗体和TSH相互作用所需的氨基酸残基的方法，所述方法包括识别潜在的TSHR相互作用区域和其内的氨基酸残基，所述氨基酸残基根据它们与TSHR的结合伴侣的相互作用能力而被进一步识别，并作为用于TSHR与一个或多个刺激性TSHR自身抗体、阻断性TSHR自身抗体和TSH的相互作用所需的候选氨基酸；进行所述候选氨基酸的点突变并检测所获得的突变的TSHR制品与结合伴侣的相互作用，从而识别用于TSHR与刺激性TSHR自身抗体、阻断性TSHR自身抗体和TSH分别相互作用所需的关键氨基酸，所述点突变发生在位于相应于全长人TSHR第255氨基酸位点的Arg，其中Arg255被选择性地点突变为带负电荷的氨基酸残基，从而使所述突变的TSHR制品区分性地与刺激性TSHR自身抗体、阻断性TSHR自身抗体和TSH相互作用。
22.识别氨基酸残基的方法，该氨基酸残基是TSHR的构象所需的，从而使其与一个或多个刺激性TSHR自身抗体、阻断性TSHR自身抗体和TSH相互作用，所述方法包括识别潜在的TSHR相互作用区域和其内的氨基酸残基，所述氨基酸残基根据它们与TSHR结合伴侣的相互作用能力而被进一步识别，并作为TSHR的构象所需的候选氨基酸，从而使其与所述一个或多个刺激性TSHR自身抗体、阻断性TSHR自身抗体和TSH相互作用；进行所述候选氨基酸残基的点突变并检测所获得的突变TSHR制品与结合伴侣的相互作用，从而识别所述TSHR的构象所需的的关键氨基酸，以使TSHR与一个或多个刺激性TSHR自身抗体、阻断性TSHR自身抗体和TSH分别相互作用，所述点突变发生在位于相应于全长人TSHR第255氨基酸位点的Arg，其中Arg255被选择性地点突变为带负电荷的氨基酸残基，从而使所述突变的TSHR制品区分性地与刺激性TSHR自身抗体、阻断性TSHR自身抗体和TSH相互作用。
23.根据权利要求20-22所述的方法，其中，至少在位于相应于全长人TSHR第255氨基酸位点的Arg选择性地点突变为带负电荷的氨基酸残基。
24.根据权利要23所述的方法，其中，所述带负电荷的氨基酸残基是Asp。
25.根据权利要求20-24任意一项所述的方法，其中，被检测的突变TSHR制品的相互作用是突变TSHR的刺激作用，或对这种刺激作用的阻断。
26.根据权利要求25所述的方法，其包括检测由于结合伴侣与突变TSHR制品相互作用的结果而生成的cAMP。
27.氨基酸残基在突变的TSHR制品中的用途，所述氨基酸残基不同于相应于全长人TSHR第255个氨基酸位点的Arg，其中，Arg255被选择性地点突变为带负电荷的氨基酸残基，从而使所述突变的TSHR制品区分性地与刺激性TSHR自身抗体、阻断性TSHR自身抗体和TSH相互作用，用于差别筛选待筛选体液样品中一个或多个患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH。
28.氨基酸残基在突变的TSHR制品中的用途，所述氨基酸残基不同于相应于全长人TSHR第255个氨基酸位点的Arg，其中，Arg255被选择性地点突变为带负电荷的氨基酸残基，从而使所述突变的TSHR制品区分性地与刺激性TSHR自身抗体、阻断性TSHR自身抗体和TSH相互作用，用于识别体液样品中是否存在刺激性TSHR自身抗体。
29.氨基酸残基在突变的TSHR制品中的用途，所述氨基酸残基不同于相应于全长人TSHR第255个氨基酸位点的Arg，其中，Arg255被选择性地点突变为带负电荷的氨基酸残基，从而使所述突变的TSHR制品区分性地与刺激性TSHR自身抗体、阻断性TSHR自身抗体和TSH相互作用，其通过筛选体液样品用于诊断与TSHR相关的自身免疫疾病。
30.权利要求27、28或29所述的用途，其中全长人TSHR的第255位的氨基酸为Asp。
【文档编号】G01N33/564GK103450357SQ201310185836
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2005年8月3日 优先权日:2004年8月13日
【发明者】伯纳德·里斯·史密斯, 雅德维加·富尔马尼亚克, 简·桑德斯 申请人:Rsr有限公司