本发明涉及一种高纯度藻红蛋白比荧光强度的计算方法。具体是属于荧光蛋白发光特性技术领域。
背景技术：
海洋藻类资源及天然活性产物的高值化开发和利用是当今海洋生物科学研究的重要主题。在海洋生态系统中，光合色素对于所有光合作用的自营养型生物是至关重要的。各种海洋植物、藻类能通过自身存在的光合系统，有效地利用环境中的CO2，即海藻的光合色素能把CO2转化为有机物并释放氧气，它们是海洋中其它生物赖以生存、持续发展的基础。海洋红藻和蓝藻，除了含有植物常见的叶绿素a外，还含有一类特殊的水溶性辅助采光色素，称为藻胆蛋白(Phycobiliprotein)，主要包括藻红蛋白(Phycoerythrin，PE)，藻蓝蛋白(Phycocyanin，PC)，藻红蓝蛋白(PhycoerythrocyaninPEC)和别藻蓝蛋白(Allo-phycocyanin，APC)。藻胆蛋白不仅是藻细胞体内重要的光合作用色素蛋白，而且具有具有多方面的功能作用和广泛的应用价值。红藻和蓝藻所特有的藻胆蛋白，最早是由Esenbeck于1836年首次发现的。长期以来，国内外的许多科研人员已对各种海洋藻类藻胆蛋白的分子结构特点、光谱吸收特征、光合生理以及它们在光合过程中的作用等方面进行过大量的理论性研究，而且在探索藻胆蛋白的应用性研究方面也做了许多的探索。藻红蛋白是藻胆蛋白中最重要的荧光蛋白，具有无毒性、摩尔消光系数大、荧光量子产率高、斯托克位移大、红橙色特征荧光、背景光干扰小、不易淬灭、性质稳定可较长期保存等特点，是一种荧光特异性强的标记物。相关的研究表明，藻红蛋白在临床医学诊断、免疫化学及生物工程等研究领域具有广泛的应用价值。它们可作为荧光分子物与特异的抗体发生耦合作用，当这种结合态抗体附到细胞或组织的特异受体位点时，很容易通过它们发出的特异性荧光而进行跟踪观察，可作为效果良好的荧光示踪物，而且这种结合态物对生物体本身无任何毒性副作用和损害，这是放射性物以及其他一些化学染料示踪法所根本无法相比的，其它潜在的应用还包括DNA探针的荧光标志，分子物和细胞的荧光免疫测试。藻红蛋白也可和其它生物性大分子物或非生物性大分子物耦合，例如酶，其它蛋白质物，多肽，激子，核酸，药物，维生子等，因此在分子或细胞水平上，对研究分子的转移、代谢，疾病的诊断和治疗方面，具有重要的开发、应用价值。最近的研究表明，藻红蛋白可作为有效的光敏剂，用于治疗肿瘤、癌症等。已有许多报道指出，藻红蛋白能有效清除体内的各种有害自由基，提高机体免疫力，具有抗辐射、抗衰老、抗肿瘤作用，其样品市场大，是目前极有发展潜力的健康保健品。另外，藻红蛋白也可作为添加剂，可广泛应用于各类食品和化妆品行业，具有增强食品美丽色彩或养颜护肤的功效。根据全球生物化学样品最大的供应商Sigma公司的标价，高纯度的藻红蛋白目前的市场售价已达200-800美元/毫克不等，而某些生物分子与藻红蛋白结合物的现成品的售价更高。作为高纯度的藻红蛋白，它的一个最重要的用途是作为荧光示踪剂，荧光性越强，越有利于荧光示踪的灵敏性和观察的效果。因此高纯度藻红蛋白的荧光性能强弱的度量十分重要。目前所有藻红蛋白的文献资料涉及藻红蛋白荧光性能强弱的表述，均是基于采用荧光光度计测定藻红蛋白的相对荧光发射强度值，从而仅能根据这个相对荧光发射强度值，笼统提及藻红蛋白具有高度荧光性，但如何评估不同藻红蛋白样品的荧光性能强弱没有任何依据标准，即使权威性的Sigma公司也没有就藻红蛋白或其他的藻胆蛋白样品提出相应的能表征其真正荧光发射强度的数值，这就无法对不同的藻红蛋白样品的荧光性能作出正确的判断。因此就无法比较样品质量的优劣、样品的纯度。中国发明专利申请号：201110045099.3主分类号：G01N21/64，公开号：102235976A，公开日20111109，公开了“荧光强度校正方法、荧光强度计算方法及计算装置”，该发明专利提到的荧光强度校正方法、荧光强度计算方法是涉及如何采用相关的仪器设置使仪器的荧光强度测定值(即我们专利申请中提到的A.U值)更合理，而不是涉及我们专利申请中提到的比荧光强度值(μf)概念和计算，两者本质上是完全不同的。由于采用荧光光度计测定藻红蛋白的荧光发射强度值时，有许多不同的因素会影响到荧光发射强度数值的大小，例如藻红蛋白所处的介质、被测藻红蛋白样品的纯度、用于荧光发射强度测定时藻红蛋白样品的实际量都与荧光发射强度数值的大小有关，因此构建一个准确、合理可行的藻红蛋白荧光强度的数值计算方法，其计算结果可用于准确比较不同藻红蛋白样品的荧光性能是很有必要的，有利于评估不同藻红蛋白样品在荧光性能上的优劣性，有利于控制高纯度藻红蛋白在荧光性能上的质量标准。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题就是针对上面所述的背景技术，采用准确、适宜的计算方法，获得藻红蛋白样品的比荧光强度值(μf)，根据计算的比荧光强度值大小可以方便地比较不同的藻红蛋白样品的荧光性能。本发明采用的技术方案及技术特征：从海洋红藻中分离纯化出的高纯度藻红蛋白作为测试样品；用紫外-可见光光度计测定获得的藻红蛋白纯化液在280nm、565nm和625nm波长的吸光值；采用荧光分光光度计，在498nm的激发波长光下，测定藻红蛋白纯化液在576nm波长时发射的荧光强度值A.U；采用公式μf＝A.U/[(A565/0.1)×Vf]计算藻红蛋白的比荧光强度值μf。根据获得的比荧光强度数值可方便、准确地比较不同藻红蛋白样品的荧光性能。为了使不同的藻红蛋白样品计算的比荧光强度值结果，在衡量荧光性能指标方面具有可比性，首先应统一规范一下涉及藻红蛋白样品荧光强度测定的操作程序。本发明专利说明书中所述的定义或操作程序，均如下所述：因为纯度不高的藻红蛋白含有的杂质多，干扰程度大，不适宜作为荧光示踪物，因此所述的高纯度藻红蛋白是指采用紫外-可见光光度计测定的藻红蛋白纯化液在280nm、565nm和625nm波长的吸光值为A280，A565，A625，所获得的藻红蛋白纯化液的纯度比值A565/A280应大于4.5；纯度比值A625/A565应小于0.03，藻红蛋白所处的介质为超纯水，测定藻红蛋白纯化液的吸光值和荧光强度值时采用1cm长度的石英比色皿，体积量为4毫升，并且测定荧光强度值时是取适宜微升量的藻红蛋白纯化液，用超纯水稀释至4毫升体积，荧光扫描波长范围为400-700nm，扫描步长0.5nm。比荧光强度值(μf)可按照下式计算：μf＝A.U/[(A565/0.1)×Vf]公式中μf是比荧光强度值。A.U指采用荧光光度计，以498nm波长光作为激发光(λex＝498nm)，测定得到的藻红蛋白纯化液在最大发射波长(λem＝576nm)下，仪器输出的荧光强度值。A565指采用紫外可见光光度计测定的高纯度藻红蛋白纯化液在565nm波长光下的吸光值。Vf指采用荧光光度计测定藻红蛋白的荧光发射强度时吸取的高纯度藻红蛋白纯化溶液的微升数。由上述的计算方法可知，比荧光强度值(μf)实际上就是代表了采用1cm长度的石英比色皿测定藻红蛋白纯化液的荧光强度值，测液体积量为4毫升时，每1微升体积量的具有0.1个单位的A565吸光值的藻红蛋白溶液的荧光强度值。现有技术的发明专利或相关的非专利文献均尚无涉及藻红蛋白比荧光强度的概念及相应的计算方法的报道。采用本发明专利提出的藻红蛋白比荧光强度的计算方法，可以获得藻红蛋白比荧光强度的数值，从而可以方便地应用于比较不同藻红蛋白样品荧光强度大小，评估分析不同藻红蛋白样品荧光性能，有助于控制藻红蛋白样品荧光性质量标准。具体实施方式及实施例证下面结合实施例，对本发明作进一步说明。下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。本发明提出的计算方法，同样可适用于其他藻胆蛋白，例如藻蓝蛋白，别藻蓝蛋白比荧光强度的计算。具体实施例证1：取从海洋红藻分离纯化的高纯度藻红蛋白溶液(样品1)4毫升，用紫外可见光光度计测定得该溶液在280nm、565nm和625nm波长的吸光值分别为0.226，1.141，0.030；纯度比值A565/A280为5.055，纯度比值A625/A565为0.026。取此高纯度藻红蛋白溶液2.5微升，用超纯水稀释至4毫升，采用荧光分光光度计，在498nm的激发波长光下，荧光发射扫描波长范围为400-700nm，扫描步长0.5nm，测得此溶液在576nm波长时发射的荧光强度A.U数值为898.86。采用本发明专利提出的计算方式：μf＝A.U/[(A565/0.1)×Vf]，获得该高纯度藻红蛋白溶液的比荧光强度值(μf)为31.51。具体实施例证2：取从海洋红藻分离纯化的高纯度藻红蛋白溶液(样品2)4毫升，用紫外可见光光度计测定得该溶液在280nm、565nm和625nm波长的吸光值分别为0.311，1.460，0.018；纯度比值A565/A280为4.700，纯度比值A625/A565为0.013。取此高纯度藻红蛋白溶液2.5微升，用超纯水稀释至4毫升，采用荧光分光光度计，在498nm的激发波长光下，荧光发射扫描波长范围为400-700nm，扫描步长0.5nm，测得此溶液在576nm波长时发射的荧光强度A.U数值为546.55。采用本发明专利提出的计算方式：μf＝A.U/[(A565/0.1)×Vf]，获得该高纯度藻红蛋白溶液的比荧光强度值(μf)为14.97。具体实施例证3：取从海洋红藻分离纯化的高纯度藻红蛋白溶液(样品3)4毫升，用紫外可见光光度计测定得该溶液在280nm、565nm和625nm波长的吸光值分别为0.244，1.221，0.017；纯度比值A565/A280为5.000，纯度比值A625/A565为0.014。取此高纯度藻红蛋白溶液2.5微升，用超纯水稀释至4毫升，采用荧光分光光度计，在498nm的激发波长光下，荧光发射扫描波长范围为400-700nm，扫描步长0.5nm，测得此溶液在576nm波长时发射的××荧光强度A.U数值为984.23。采用本发明专利提出的计算方式：μf＝A.U/[(A565/0.1)×Vf]，获得该高纯度藻红蛋白溶液的比荧光强度值(μf)为32.24。具体实施例证4：取从海洋红藻分离纯化的高纯度藻红蛋白溶液(样品3)4毫升，用紫外可见光光度计测定得该溶液在280nm、565nm和625nm波长的吸光值分别为0.148，0.835，0.004；纯度比值A565/A280为5.629，纯度比值A625/A565为0.005。取此高纯度藻红蛋白溶液3.0微升，用超纯水稀释至4毫升，采用荧光分光光度计，在498nm的激发波长光下，荧光发射扫描波长范围为400-700nm，扫描步长0.5nm，测得此溶液在576nm波长时发射的荧光强度A.U数值为443.90。采用本发明专利提出的计算方式：μf＝A.U/[(A565/0.1)×Vf]，获得该高纯度藻红蛋白溶液的比荧光强度值(μf)为17.72。具体实施例证5：取从海洋红藻分离纯化的高纯度藻红蛋白溶液(样品3)4毫升，用紫外可见光光度计测定得该溶液在280nm、565nm和625nm波长的吸光值分别为0.318，1.636，0.015；纯度比值A565/A280为5.141，纯度比值A625/A565为0.015。取此高纯度藻红蛋白溶液2.0微升，用超纯水稀释至4毫升，采用荧光分光光度计，在498nm的激发波长光下，荧光发射扫描波长范围为400-700nm，扫描步长0.5nm，测得此溶液在576nm波长时发射的荧光强度A.U数值为997.07。采用本发明专利提出的计算方式：μf＝A.U/[(A565/0.1)×Vf]，获得该高纯度藻红蛋白溶液的比荧光强度值(μf)为30.47。具体实施例证6：取从海洋红藻分离纯化的高纯度藻红蛋白溶液(样品3)4毫升，用紫外可见光光度计测定得该溶液在280nm、565nm和625nm波长的吸光值分别为0.326，1.635，0.005；纯度比值A565/A280为5.013，纯度比值A625/A565为0.003。取此高纯度藻红蛋白溶液1.5微升，用超纯水稀释至4毫升，采用荧光分光光度计，在498nm的激发波长光下，荧光发射扫描波长范围为400-700nm，扫描步长0.5nm，测得此溶液在576nm波长时发射的荧光强度A.U数值为526.02。采用本发明专利提出的计算方式：μf＝A.U/[(A565/0.1)×Vf]，获得该高纯度藻红蛋白溶液的比荧光强度值(μf)为21.45。从以上的实施例证的计算结果清楚、准确地表明，按照本发明专利提出的计算方法，获得的不同样品高纯度藻红蛋白溶液在荧光性能方面地体现，可以从他们的比荧光强度值(μf)的大小评判出来，比荧光强度值(μf)越大，其发射荧光的能力就越强，这样的产品质量就越好。根据比荧光强度值(μf)的大小，上述样品液中，发射荧光能力最强的是样品3高纯度藻红蛋白溶液，其比荧光强度值(μf)为最大，达到32.24。样品2高纯度藻红蛋白溶液的比荧光强度值(μf)为最小，仅为14.97，其发射荧光的能力最弱。其他样品的比荧光强度值(μf)介于最高和最低值之间。因而，采用本发明专利提出的计算比荧光强度值(μf)的方法可以方便、准确地评估各种不同高纯度藻红蛋白溶液的荧光性能，评价产品的质量优劣性。