基于上转换发光的妇科肿瘤标志物ca125、ca153、scca、he4芯片检测系统及试剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种基于上转化发光检测妇科肿瘤四项系统(CA125、CA153、SCCA、HE4)，利用反应杯检测系统进行检测。反应杯检测系统包括载体板，反应检测杯，荧光检测仪。反应检测杯由反应检测杯、试管盖组成。滴加样本到反应检测杯中进行检测，反应5-15min将载体板取出插入荧光检测仪的卡槽中读取数值。本发明的特点是：结合上转换发光检测方法同时进行妇科肿瘤CA125、CA153、SCCA、HE4四项标志物的检测。其背景值小，测量便捷、准确，操作简单。数据wifi传输医生快速获得检测结果，达到快速诊断。
【专利说明】基于上转换发光的妇科肿瘤标志物CA125、CA153、SCCA、
HE4芯片检测系统及试剂
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种免疫检测系统和试剂检测妇科肿瘤CA125，CA153，SCCA, HE4四项标志物，是一种通过上转换发光方法检测妇科肿瘤四项标志物的装置，属于医疗产品领域。
【背景技术】
[0002]乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈鳞癌、子宫颈癌等妇科肿瘤疾病是影响广大女性的健康的主要障碍。宫颈癌是女性生殖道最常见的肿瘤，近年来有发病率升高，发病年轻化的特点，在全球范围的妇科癌症中，宫颈癌是导致死亡的主要原因，发生率为493243例/年，死亡率273505例/年，全球范围内的死亡率为55%。妇科肿瘤引起了社会各界和医学领域的广泛关注。妇科肿瘤学家致力于妇科肿瘤早期诊断方法的研究，即找到一种简单、敏感性特异性高的肿瘤标志物。特异性血清检测物的发现，挽救了很多身患妇科恶性肿瘤患者的生命。在治疗过程中可以通过标志物来监测病情。
[0003]常用的妇科肿瘤标志物如:甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、绒毛膜促性腺激素(hCG)、糖类抗原CA125、糖类抗原CA199、糖类抗原CA724等，它们对病情监测有重要作用。
[0004]CA125在妇科肿瘤标志物中有大量的研究，是一种分子量为200000的糖蛋白。Bast等在1983年用卵巢浆液囊腺癌细胞免疫小鼠，并与骨髓瘤细胞杂交得到的单克隆抗体。作为监测上皮性卵巢癌的重要标志物，是区分良恶性疾病的一种常用的非侵入性方法。在近10余年中关于CA125的实验及临床研究文章已多达2000余篇。通过对CA125半衰期的研究发现其与卵巢癌患者的生存期明显相关。Gadducci等研究证明晚期卵巢癌患者CA125半衰期若< 25天，经过减瘤术后化疗达到病理完全缓解(CR)的机率较> 25天的高
3.585倍，半衰期长者显示预后差，应给予加强治疗。CA125半衰期是化疗早期时的一个独立的预后指标，它能提示患者能否达到病理CR及病人的生存期。在临床上CA125除了作为诊断的参考指标外，还可作为随访及病情监测的重要参考指标。经过治疗后CA125值迅速下降则病人的预后往往较好。CA125达到正常值以后再升高，往往预示肿瘤复发。CA125的升高较临床上能检查到肿瘤要早3?6个月。CA125值的升高在大多数的卵巢癌患者中是先于临床表现的，但用它来作为卵巢癌筛查的价值尚未肯定。虽然CA125是较好的卵巢上皮癌的标志物，但主要在卵巢浆液性癌及未分化癌中的阳性率比较高，而在粘液性癌中则阳性率比较低。许多研究也提示在一些良性疾病中也有CA125的升高，如良性卵巢肿瘤、盆腔炎性疾病及肝硬化等。CA125还存在于许多器官的上皮或间皮中，如输卵管、子宫、腹膜、胸膜及心包等，但在非肿瘤者的升高范围不大，在作出临床判断前应加以考虑。CA125作为卵巢癌的辅助诊断是个重要的标志物，与病程有关。
[0005]CA153最早发现于乳腺癌细胞，是位于细胞膜上的一种分子量较大的粘液样糖蛋白，相对分子质量300000-450000，包括一个膜区，一个细胞内区和一个富含糖基的细胞外区，由抗人乳脂球膜抗体115D8和DF3所识别，存在于多种腺癌内，如乳腺癌，肺癌，卵巢癌及胰腺癌。当细胞癌变时，由于糖基转化酶被激活，引起细胞膜上蛋白酶和唾液酸酶活性增高，细胞骨架破坏，CA糖类抗原增多并从癌细胞膜上分离出来，向血液中释放，近年推出作为乳腺癌标志物，正常< 40U/ml哺乳期妇女或良性乳腺肿瘤皆低于此值。乳腺癌晚期100%，其它期75%此值明显升高。可作为肿瘤标志物应用于肿瘤的辅助诊断，疗效监测和转移复发的判定。对乳腺癌的动态追踪、判断复发转移有一定价值。
[0006]SCCA(鳞状细胞癌抗原)是1977年从子宫颈鳞癌的肝转移灶中提取的一种蛋白质，其分子量约为48000。该抗原在子宫颈癌、肺癌、皮肤癌、食管癌、喉癌等肿瘤组织中高表达，是目前为数不多的宫颈癌肿瘤标志物之一。SCCA主要存在于含鳞癌成分的宫颈癌中，其临界值为1.5ng/ml, SCCA的阳性率分别为O期12.4%, I期30.0% -40.0%, II期60.0% -70.0%, III期及IV期80.0 % -90.0%。近期研究表明，术前血清SCCA水平与宫颈癌的临床分期、肿瘤病灶大小、间质浸润深度、淋巴结是否累积等因素有相关性。SCCA值的改变与疾病进展或好转的变化是一致的。如果应用化疗，化疗后的病情改变也与SCCA值的改变一致。如果治疗后2-3个月的SCCA水平持续升高意味着治疗效失败。SCCA先于临床2-6个月发现复发病灶。即使治疗前SCCA呈阴性，当癌瘤复发时它也仍然有可能出现阳性反应。因此SCCA是对宫颈癌病情监测的一个很好的标志物，对患者治疗方案的确定提供了有意义的信息。
[0007]HE4在早期(I期)的卵巢癌中的敏感性及检测卵巢癌总的敏感性均高于CA125，是卵巢癌敏感及特异的标志物，可用于对卵巢癌早期诊断及辅助监控卵巢癌患者的治疗情况。英国的一项研究对200000妇女用30多种肿瘤标记物分别单独或与CA125联合进行卵巢癌筛查，HE4可以使诊断卵巢癌的敏感度和特异性提高。HE4抗原在浆液性、子宫内膜样及透明状细胞性卵巢癌中高表达。未分化和移行细胞癌中有表达。在粘液性、生殖细胞及性索卵巢癌中几乎不表达。
[0008]肿瘤标志物检测的优点是:
[0009](I)可以协助诊断肿瘤来源。
[0010](2)属于无损伤检查，可多次重复检查。
[0011](3)方法简便，基层医院也可检测。
[0012](4)可以获得客观准确的数值。
[0013]但现有临床标志物特异性较差。鉴于目前多数肿瘤标志物的敏感性及特异性尚不理想，假阳性及假阴性时有发生。为提高这些肿瘤标志物检测的准确性，可以把具有不同特点的肿瘤标志物结合起来联合检测。联合检测优于只检测单一任何一种肿瘤标志物，它提高了临床诊断价值。Woolas等用CA125作为标志物来区分盆腔良性与恶性肿块，其敏感性及特异性分别为78.1%及76.8%。若用5种标志物(CA125、OVXU LASA, CA153及CA724)联合检测，并经统计处理，则使其敏感性及特异性分别提高到90.6%及93.2%，大大提高了判断的准确性。因此将CA125、CA153、SCCA、HE4四种抗原组合，联合检测妇科肿瘤，以便提高检测准确性及特异性。
[0014]上转换发光颗粒UCP在标志物检测领域具有巨大潜能。上转换发光具有独特的光学特性，它具有以下特点:
[0015]I)灵敏性高:不受外界的背景干扰。
[0016]2)稳定性高:避免了样本腐蚀或自身衰变引发的淬灭现象。
[0017]3)灵活性高:可以组合多样化光谱。
[0018]4)安全性高:对于检测者、检测样品和环境都没有危害。
[0019]5)方便简易:可对血液，尿液，唾液等样品直接进行检测，无需特殊处理。
[0020]以上特点决定其在生物标记物检验方面应用前景较广阔。特别是在床旁检测领域。
[0021]免疫检测是测定一种特异蛋白的灵敏方法。典型的免疫检测方法包括，酶联免疫吸收分析(elisa)及免疫印迹法检测(western blot)，免疫检测的常规程序冗长费时、不易携带且成本较高。因此床旁检测在医学诊断领域的大势所趋，它的特点是快速，方便携带，操作简单。不仅仅可以在医院使用，还可以在基层使用。因此一种基于上转换发光的检测妇科肿瘤四项标志物的快速检测系统及联合检测试剂在临床检测领域具有重要的应用价值。
【发明内容】
[0022]针对以上存在的问题，本发明提供一种免疫检测系统和试剂检测妇科肿瘤CA125，CA153，SCCA, HE4四项标志物，本发明的特点是:结合上转换发光方法同时检测妇科肿瘤四项标志物。利用四种标记物联检，其准确性及特异性更高；利用上转换发光方法测定，其背景值小，测量便捷、准确，操作简单。
[0023]其中一个优选的实施方案中:基于上转化发光的检测妇科肿瘤四项标志物的反应杯系统，包括:载体板，反应检测杯，荧光检测仪。载体板上同时包被有待检测的四种抗原的抗体鼠抗人CA125、CA153、SCCA、HE4。将反应杯中加入100微升标记了 UCP颗粒的CA125、CA153、SCCA、HE4四种抗体混合液(浓度均为lmg/ml)，将试管盖中间有小孔的盖子盖在反应杯上，在冻干机中冻干。将载体板插入反应检测杯中，滴加100微升血清或体液、组织液等样本进行检测，样本可以直接与一抗及冻干液发生一步反应，反应5-15min将载体板取出插入荧光检测仪的卡槽中读取数值，将数值带入标准曲线中对样本浓度进行计算。直接打印检测结果，或者检测结果通过wifi传输到医院数据中心让医生直接调阅检测结果，到达快速检测，快速诊断的目的。而且该检测仪器轻便，不到IKg;操作简便，一键出结果。广泛适用于体检，120急诊，野外检测等环境。
[0024]所述的载体板是黑色聚苯乙烯板。长宽为6mmX10mm。其上有3X4个点，点间距为1.5_，点直径为1.5_。其上包被有鼠抗人CA125、CA153、SCCA、HE4四种抗体。
[0025]在另一种优选的实施方案中，利用免疫层析试纸条检测系统进行检测。分析膜为硝酸纤维素膜，将膜上四个区域同时包被4种抗体，烘干；在试纸条前端包被兔抗羊IgG (lmg/ml)作为质控点；利用UCP标记CA125、CA153、SCCA、HE4四种抗体，将UCP标记的四种抗体浸润在玻璃纤维垫上，烘干。烘干后裁剪成长条。将硝酸纤维素膜、吸水纸、结合垫、样品垫贴到底板上。结合垫上通过加样区将样品添加到加样垫上，结果判读处对应着分析膜的检测带和质控带。
[0026]所述的突光检测仪大小只有12cmX6cmX5.5cm,可以随意携带。方便操作。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1为试管立体图，为长方体,长宽高依次为10mmX4mmX40mm。底端有负压装置。
[0028]图2为试管正面图，内径为8mm。此侧管体距底部1mm为磨砂透明面。
[0029]图3为试管侧面图，内径为2mm。
[0030]图4插有塑料杆的盖子，盖子为长方形，上端有长方形片状把手，方便盖子开合，盖子中央下端连有宽约1-3_杆子，杆子下端连有可以自由取下的黑色高吸附蛋白的聚苯乙烯板，此板为长方体，长宽高依次为6mmX0.5-lmmX10mm。
[0031]图5为中央带有小孔的盖子，盖子为长方形，中央留有直径为Imm的小孔，盖好盖子后，可以将液体试剂加入试管中在冻干机中进行冻干。
[0032]图6为黑色聚苯乙烯板生产时整体压制为A4纸大小，每个小片可以从整板上方便的拆下来。黑色聚苯乙烯板正面有3X4或者4X5个凹面小孔,孔径为Imm或者0.5mm。
[0033]图7为在板的上端后面有一扣眼，与杆子下端设计小扣，两者可以随意扣合及分离。A为侧面图，B为正面图。
[0034]图8A为荧光检测装置，B为屏幕,在激光灯一侧留有卡槽,如图9。
[0035]图10为聚苯乙烯板取下后可放置在卡板上，然后将卡板放入卡槽中进行读数。
[0036]图11上转发光免疫层析试纸条检测系统结构示意图，其中I为样品垫；2为结合垫；3为分析膜；4为吸水垫；5为粘性低衬；6为4种蛋白连接蛋白抗体-UCP结合物；7为标记蛋白I ;8为标记蛋白2 ；9为标记蛋白3 ； 10为标记蛋白4。
[0037]图12为将样品加入装有UCP颗粒标记的四种抗冻干体混合液的反应杯中。
[0038]图13为将载体板插入反应杯，其中装有样品及四种抗体的冻干混合液。
[0039]图14为反应结合示意图，样品中的抗原与载体板上的抗体及标记了 UCP颗粒的抗体发生一步反应。
【具体实施方式】
[0040]实施案例一:反应杯检测系统
[0041]1，如图1管体内加入UCP颗粒标记的CA125、CA153、SCCA、HE4蛋白溶液共100微升(浓度均为lmg/ml)，盖上如图5中间有圆孔的盖子，放入冻干机内在-50°C条件下冻干。
[0042]2，如图6黑色聚苯乙烯上固定有12-20个点的蛋白，加在如图6的凹面小孔内，每点0.1-0.5微升。点间距0.5-1_。
[0043]3，包被蛋白在聚苯乙烯薄片上，包被4种蛋白鼠抗人CA125、CA153、SCCA, HE4，使4种蛋白在一条与反应杯底边平行的直线上，在检测蛋白的上方，包被兔抗羊IgG(lmg/ml)作为质控点。固定在如图4手柄架上。放入如图1的试管中，放入恒温震荡摇床中在37°C条件下反应10分钟。
[0044]4，反应好后将管放入负压抽滤器中抽出反应的液体，取出带黑色聚苯乙烯薄片的手柄架正面朝上放入如图10的卡槽中，插入检测仪侧面方口中进行检测。
[0045]5，通过荧光检测仪读数得到反应荧光值，通过标准曲线计算样品的浓度。
[0046]实施案例二:免疫层析试纸条检测
[0047]1，包被:将兔抗羊IgG稀释到lmg/ml，作为C线包被液，将鼠抗人CA125、CA153、SCCA、HE4四种单抗(浓度均为lmg/ml)混合，作为T线。通过喷膜机，将T线包被液和C线包被液包被到硝酸纤维素膜上，晾干，即可得到单克隆抗体包被测试条。
[0048]2，利用 UCP 标记 CA125、CA153、SCCA, HE4 四种抗体备用。
[0049]3，结合垫的制备:将上述利用UCP标记的四种抗体浸润在玻璃纤维垫上，放入烘箱37°C下烘烤2h。烤干后裁剪成长条。
[0050]4，组装试纸条:将硝酸纤维素膜、吸水纸、结合垫、样品垫贴到底板上。
[0051]5，将样品加到样品垫上，5_15min后，将试纸条插入荧光检测仪，在分析膜结果观测处进行数值读取。
【权利要求】
1.一种基于上转换发光的妇科肿瘤标志物CA125、CA153、SCCA、HE4芯片检测系统及试齐U，其特征在于:上转换发光UCP颗粒标记了 CA125、CA153、SCCA, HE4四种抗体。
2.一种基于上转换发光的妇科肿瘤标志物CA125、CA153、SCCA、HE4芯片检测系统及试齐U，其特征在于:反应杯检测系统中的载体板为黑色聚苯乙烯，上面包被有鼠抗人CA125、CA153、SCCA, HE4 四种抗体。
3.一种基于上转换发光的妇科肿瘤标志物CA125、CA153、SCCA、HE4芯片检测系统及试齐U，其特征在于:将样品滴加到反应检测杯中进行检测，反应5-15min后将卡取出载体板插入荧光检测仪的卡槽中读取数值，将数值带入标准曲线中对样本浓度进行计算。
4.如权利要求3所述，检测样品为血清、体液、组织液。
【文档编号】G01N33/533GK104422770SQ201310375818
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年8月23日 优先权日:2013年8月23日
【发明者】罗朝领, 王微微, 茅柳娟, 肖建国, 王连会, 王亮, 马丽, 胡丽莉, 罗智允, 罗朝举 申请人:上海凯璟生物科技有限公司