一种脂微球注射液中主药相分配系数的测量方法
【专利摘要】本发明公开了一种测定脂微球注射液中主药相分配系数的方法，该方法未有文献报道，通过联合超滤分离系统和生物试剂盒的方法，解决了目前脂微球制剂特别是主药含量小于100μg/mL的脂微球注射液中主药包封情况无法测定的不足，填补了上市脂微球制剂产品中质量研究中的空白。
【专利说明】一种脂微球注射液中主药相分配系数的测量方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种脂微球前列地尔注射液中前列地尔主药相分配系数的测量方法，具体来讲，涉及使用微超滤分离技术将前列地尔脂微球注射液中油水两相分离，并通过ELISA法测量水相中的前列地尔含量，从而得到前列地尔脂微球注射液中前列地尔主药的相分配系数。
【背景技术】
[0002]脂质体药物的结构与脂微球类似，通常在脂质体研究中均需要测定药物主成分的包封率，以确保该脂质体完全将药物主成分包封。由于脂质体具有磷脂双分子层，其结构相对稳定，药物主成分一旦包封于脂质体内，除非药物结构遭到破坏，否则很难发生变化。而脂微球仅具有一个磷脂分子层，药物位于脂微球内可以自由的在油水两相之间移动，因此包封率这个定义并不适用于脂微球，通常我们应该测量的是药物主成分在油水两相中的分配系数，简称为相分配系数。
[0003]脂微球注射液中含有磷脂包裹的微小油滴组成的脂微球，其平均粒径在0.2 μ m左右。前列地尔分布于脂微球中，脂微球由于具有磷脂外壳，因此可以富集于体内毛细血管的血栓位置，从而形成靶向作用。由于脂微球具有靶向作用，前列地尔注射液中前列地尔的含量仅为5μ g/ml，在保证药效的前提下极大降低了药物的副作用。
[0004]例如，已市售产品前列地尔注射液由日本科学家研制成功，并于20世纪80年代在日本上市。北京泰德制药股份有限公司从日本成功引进了该技术，并于1995年在国内上市。目前前列地尔注射液在国内上市十余年，年产量达到千万支。
[0005]从公开文献中可以看出，前列地尔只有位于脂微球内，才能有效的起到靶向治疗的作用。而由于前列地尔注射液的含量很低，因此虽然前列地尔几乎不溶于水，经过文献检索，前列地尔在水中的溶解度为7.5 μ g/ml，但是这已经大于了前列地尔注射液的含量5 μ g/ml，如果前列地尔较多的溶解并游离于水相中，必然会影响其药效，因此测量前列地尔注射液的相分配系数非常重要。
[0006]根据以往发表的文献，测量脂质体包封率主要有过滤，超滤和柱分离三大类方法。物理过滤方法是无法用于脂微球注射液，因为脂微球注射液仅具有磷脂分子外壳，不具有脂质体的坚固结构，容易发生团聚或变形，在物理过滤过程中容易团聚堵塞滤膜，如果加压过滤则容易变形碎裂后通过滤膜。超滤及柱分离可以在不改变脂微球结构的前提下实现油水两相的分离，但针对前列地尔注射液又具有如下问题:1)传统超滤或柱分析，均需要增加较大量的洗脱液或淋洗液来实现分离，而由于前列地尔是可以在油水两相之间移动，加入大量的洗脱液或者淋洗液后，会改变其相分配系数。经过 申请人:实际试验发现，使用洗脱液的量越大，前列地尔在水相中的含量就越高。2)前列地尔注射液中前列地尔浓度仅为5 μ g/ml，在油相中的浓度为微克级，在水相中的浓度可能为纳克甚至皮克级，如果再加入洗脱液或者淋洗液，则浓度太低，需要非常复杂的再浓缩操作后才有测量其含量的可能性。
[0007]在以往发表的文献中，并未见到任何测量前列地尔注射液相分配系数的报道。 申请人:经过潜心研究发明了前列地尔注射液相分配系数的有效测量方法，并进行了相关的验证。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种可以测量前列地尔注射液中前列地尔相分配系数的有效方法。
[0009]本
【发明者】进行研究后发现,使用Sartorius公司的Vivaspin系列超滤分离系统对药液进行处理后，使用AssayDesign公司的前列地尔ELISA试剂盒进行检验，可以解决前述课题，并进行了相关的方法学验证。
[0010]本发明目的是通过如下技术方案是实施的:
一种脂微球注射液中主药相分配系数的测量方法，其中，采用超滤分离系统和生物试剂盒联合的方法进行测定。
[0011]其中，超滤分离系统为Sartorius公司的Vivaspin系列超滤分离系统；生物试剂盒为ELISA系列的试剂盒。
[0012]其中，脂微球注射液为主药含量小于ΙΟΟμ g/mL。
[0013]其中，脂微球注射液包括前列地尔注射液或贝前列素酸注射液或利马前列素注射液或前列腺素Al注射液。
[0014]一种脂微球注射液中主药相分配系数的测量方法，其步骤包括:
(O精密量取待测药液2-10ml，其中优选为2ml，置于Vivaspin超滤离心管上层衬管
中；
(2)将Vivaspin超滤离心管置于离心机中，使用水平转子或角转子进行离心，优选为水平转子；离心力为15000-30000Xg，优选为20000Xg ;离心温度为2_8°C，优选为4_5°C ；离心时间为15-30分钟,优选为20分钟；进行离心操作；
(3)精密取离心后下层离心管中无色透明水相适量，按照ELISA试剂盒说明书进行操作，96孔酶标板中样品显色后使用酶标仪检测其吸光度读数；
(4)根据对照品标准曲线，使用对数坐标纸绘图法或四阶线性拟合法计算样品中前列地尔的含量，优选为四阶线性拟合法，R应大于0.999 ；
(5)根据检测出的水相中主药浓度，结合检测注射液处方，计算出水相中的主药总量，再根据主药含量检验的结果，计算出其相分配系数。
[0015]其中，Vivaspin超滤离心管滤膜的截留分子量为IOK或，30K,或50K或100K，其中优选为30K或50K。
[0016]其中，Vivaspin超滤离心管滤膜的滤膜材料为聚醚砜、三醋酸纤维素、再生纤维素和Hydrosart,优选为聚醚砜或再生纤维素。
[0017]采用已上市的产品前列地尔注射液对本发明案进行进一步的验证。
[0018]使用Sartorisu公司的Vivaspin系列超滤分离系统,该系统为带有内层衬管的离心管，内层衬管上具有垂直方向的超滤膜，根据要求该衬管具有不同体积，超滤膜也具有不同的分子量规格。将前列地尔注射液的药液适量放入衬管内，将衬管装入离心管中，放入离心机进行离心分离，可以得到离心管底部超滤后的水相及衬管内残留的油相。该超滤分离系统的优点是无需加入洗脱液，可以将样品直接分离，且滤膜方向垂直于离心力方向，为切向过滤，不会造成脂微球的形变。
[0019]在得到水相与油相后，应测量其前列地尔的含量，虽然油相中前列地尔的含量较高，但是其前列地尔包裹于微球内，需要进行二次处理。而油相在分离后为白色油团，难以准确取出定量的体积，且无法保证其内部均匀，难以测量其含量。而水相则为无色澄明液体，可以准确测量其前列地尔的含量。使用AssayDesign公司的前列地尔ELISA试剂盒对其进行含量的检验。ELISA法(酶联免疫吸附剂测定法)为生物检测法，具有极低的检测限，该试剂盒的检测范围为5-5000pg/ml，且具有良好的专属性，对于前列腺素Al，前列腺素BI等结构类似的同系物均无干扰。
[0020]在测得水相中前列地尔含量后，可以根据其处方算出水相中前列地尔的总量，并根据前列地尔注射液含量检验的结果计算出油相中前列地尔的总量，从而计算出其相分配系数(以油相或水相含量百分比来表示)。
[0021]实施发明的最佳方式
精密量取前列地尔注射液2 2ml，置于Vivaspin超滤离心管上层衬管中。Vivaspin超滤离心管滤膜的截留分子量为30K。滤膜材料为聚醚砜，将Vivaspin超滤离心管置于离心机中，使用水平转子或角转子进行离心，优选为水平转子，离心力为20000Xg，离心温度为4°C。离心时间为20分钟。
[0022]精密取离心后下层离心管中无色透明水相适量，按照AssayDesign公司前列地尔ELISA试剂盒说明书进行操作，96孔酶标板中样品显色后使用酶标仪检测其吸光度读数。为保证该水相中前列地尔含量在该试剂盒检测范围内(5-5000pg/ml),应按照数量级数逐级稀释，配置若干份稀释样品同时进行检测。根据对照品标准曲线，使用对数坐标纸绘图法或四阶线性拟合法计算样品中前列地尔的含量，优选为四阶线性拟合法，R应大于0.999。
[0023]根据检测出的水相中前列地尔浓度，结合前列地尔注射液处方(水相含量为90%)，计算出水相中的前列地尔总量，再根据前列地尔注射液含量检验的结果，计算出其相分配系数(以油相或水相含量百分比来表示，通常以油相含量百分比表示)。
实施例
[0024]以下，对本发明的实施例进行说明，但是本发明的范围并不现定于这些实施例。
[0025](一)取市场上销售的前列地尔注射液商品，分别为四个厂家生产，代号为K，M，Y及X各两只，按照药品质量标准测定其前列地尔含量。另取该注射液各两只，精密量取2ml药液，置于Vivaspin超滤离心管中，滤膜材质为聚醚砜，滤膜分子量截留为30K。将离心管置于Thermo Stratos离心机中，使用水平转子,离心力为20000Xg,温度为5°C,离心时间为20分钟。
[0026]离心后离心管下层为无色透明溶液，分别将此溶液稀释10倍，100倍及1000倍。
将此溶液及10倍，100倍，1000倍稀释液分别取100 μ 1，按照前列地尔ELISA试剂盒操作说
明书进行操作，将对照品的吸光度结果绘制曲线，采用四阶线性拟合法，计算各溶液样品中
【权利要求】
1.一种脂微球注射液中主药相分配系数的测量方法，其特征在于采用超滤分离系统和生物试剂盒联合的方法进行测定。
2.根据权利要求1所述的一种脂微球注射液中主药相分配系数的测量方法，其特征在于超滤分离系统为Sartorius公司的Vivaspin系列超滤分离系统。
3.根据权利要求1所述的一种脂微球注射液中主药相分配系数的测量方法，其特征在于生物试剂盒为ELISA系列的试剂盒。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的一种脂微球注射液中主药相分配系数的测量方法，其特征在于脂微球注射液为主药含量小于ΙΟΟμ g/mL的脂微球注射液。
5.根据权利要求4所述的一种脂微球注射液中主药相分配系数的测量方法，其特征在于脂微球注射液包括前列地尔注射液或贝前列素酸注射液或利马前列素注射液或前列腺素Al注射液。
6.根据权利要求1-5任一项所述的一种脂微球注射液中主药相分配系数的测量方法，其步骤包括: (I)精密量取待测药液2-10ml，其中优选为2ml，置于Vivaspin超滤离心管上层衬管中；(2)将Vivaspin超滤离心管置于离心机中，使用水平转子或角转子进行离心，优选为水平转子；离心力为15000-30000Xg，优选为20000Xg ;离心温度为2_8°C，优选为4_5°C ;离心时间为15-30分钟,优选为20分钟；进行离心操作； (3)精密取离心后下层离心管中无色透明水相适量，按照ELISA试剂盒说明书进行操作，96孔酶标板中样品显色后使用酶标仪检测其吸光度读数； (4)根据对照品标准曲线，使用对数坐标纸绘图法或四阶线性拟合法计算样品中前列地尔的含量，优选为四阶线性拟合法，R应大于0.999 ； (5)根据检测出的水相中主药浓度，结合检测注射液处方，计算出水相中的主药总量，再根据主药含量检验的结果，计算出其相分配系数。
7.根据权利要求6所述的一种脂微球注射液中主药相分配系数的测量方法，其特征在于Vivaspin超滤离心管滤膜的截留分子量为IOK或，30K,或50K或100K，其中优选为30K或 50K。
8.根据权利要求6所述的一种脂微球注射液中主药相分配系数的测量方法，其特征在于Vivaspin超滤离心管滤膜的滤膜材料为聚醚砜、三醋酸纤维素、再生纤维素和Hydrosart,优选为聚醚砜或再生纤维素。
【文档编号】G01N33/15GK103575868SQ201310565887
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年11月13日 优先权日:2013年11月13日
【发明者】程栎, 王伟, 周丽莹, 魏祥, 肖萱, 张伟强 申请人:北京泰德制药股份有限公司