用于肝脏疾病的预防剂或治疗剂的制作方法

用于肝脏疾病的预防剂或治疗剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供：用于肝脏疾病的预防剂或治疗剂，其包含AIM、AIM的部分肽、或含有编码所述AIM或所述部分肽的核苷酸序列的核酸；用于筛选用于肝脏疾病的预防剂或治疗剂的方法，其使用通过用高脂肪膳食饲喂AIM表达不足的非人哺乳动物而产生的动物；等等。
【专利说明】用于肝脏疾病的预防剂或治疗剂

【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于肝脏疾病等的预防剂或治疗剂。

【背景技术】
[0002] 代谢综合征是近年来随着生活环境的变化快速出现的现代疾病，并且像多米诺骨 牌的倒下一样发展出各种难于控制的疾病组，诸如2型糖尿病、动脉硬化性疾病等。在该系 列疾病中，从早期阶段起连同肥胖变得显著的是脂肪肝。最近已经阐明，百分之几十的患有 脂肪肝的患者进展至被称为非酒精性脂肪性肝炎（NASH)的疾病。在NASH中，大范围的肝 实质以不依赖于酒精的方式变得纤维化，并且肝硬化和肝癌经常进一步发生。尽管胰岛素 敏化剂、抗氧化剂、护肝剂（liver supporting agent)、抗高脂血症剂、降压药等用于治疗 NASH，但不存在确立的治疗方法，并且已经期望开发有效的治疗药物。
[0003] NASH的准确发病机理仍不清楚。尽管已经提出炎症和胰岛素耐抵抗与脂肪肝组 合从而发生NASH的两次打击理论，但是没有任何结论性的实验证据。作为NASH的动物模 型，可以提到用MCD(甲硫氨酸-胆碱缺乏膳食）或四氯化碳饲喂（load)的小鼠；然而，由 于肝衰竭导致的肝坏死后的纤维化是具有降低的体重的主要部分，并且无法准确反映患有 代谢综合征的人患者中的肝纤维化，其是由于营养过剩而由肥胖和脂肪肝引起的。一旦可 以生成能够再现人病理学的NASH的动物模型，则可以筛选或评估用于NASH的治疗药物。
[0004] 尽管代谢综合征基于获取与肥胖相关的胰岛素耐抵抗，但在最近几年已经阐明， 脂肪组织的慢性炎症是重要的。由于肥胖导致的脂肪组织的持续炎症在整个机体中扩散以 诱导全身性胰岛素耐抵抗。
[0005] 本发明人在最近几年已经阐明，病理学的关键是如下所述（非专利文献1-4)的 AM(巨噬细胞的凋亡抑制剂）。AM由巨噬细胞特异性产生且存在于血液中。由于肥胖， AIM的血液浓度增加，AIM经由⑶36通过胞吞作用被引入脂肪细胞，诱导累积的中性脂肪 的降解（脂解作用），并从脂肪细胞释放游离脂肪酸（非专利文献5)。释放的脂肪酸经由 toll样受体的刺激诱导并维持脂肪组织中的慢性炎症（非专利文献6)。事实上，在AIM敲 除（KO)小鼠中，肥胖不会导致整个机体（包括脂肪组织和肝脏）中的慢性炎症，并且不产 生胰岛素耐抵抗，这进而显著抑制糖尿病和动脉硬化的发生（非专利文献4、6)。然而，AIM 参与肝脏疾病（特别是NASH)的发病和进展迄今仍然未知。
[0006] [文献列表]
[非专利文献] 非专利文献 I: J Exp Med 189: 413-422，1999 非专利文献 2: J Biol Chem 276: 22910-22914，2001 非专利文献 3: Am J Pathol 162: 837-847，2003 非专利文献 4: Cell Metab 1: 201-213，2005 非专利文献 5: Cell Metab 11: 479-492，2010 非专利文献 6: PNAS 108: 12072-12077，2011。
[0007] 发明概述 本发明待解决的问题 本发明的目的是提供用于肝脏疾病的预防药物或治疗药物。此外，本发明的目的是提 供用于评估或筛选用于肝脏疾病等的预防药物或治疗药物的新方法。此外，本发明的另一 个目标提供肝脏疾病的诊断方法。
[0008] 解决问题的方法 本发明人研宄了通过饲喂高脂肪膳食而产生肥胖的AIM敲除小鼠的病理学，并且获得 了非常有趣的发现，即在其中包括肝脏的全身慢性炎症和胰岛素抵抗两者受到抑制的状态 中发生与（1)肥胖、（2)先前脂肪肝、（3)肝实质的纤维化、和（4)高度频繁癌发生的人NASH 的病理学类似的病理学。由此认为，补充AIM变为一系列肝脏疾病诸如脂肪肝、NASH和肝 癌的预防或治疗方案。
[0009] 本发明人已经基于这些发现进行进一步研宄，并且完成了本发明。
[0010] 因此，本发明提供
[1] 用于肝脏疾病的预防剂或治疗剂，其包含AIM或其部分肽、或含有编码所述AIM或 其部分肽的碱基序列的核酸；
[2] 用于肝脏疾病的预防剂或治疗剂，其包含诱导AIM的表达的药物或稳定AIM的药 物；
[3] [1]或[2]的药剂，其中所述肝脏疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化或 肝癌；
[4] 筛选用于肝脏疾病的预防剂或治疗剂的方法，其包括使用通过用高脂肪膳食饲喂 AIM表达缺陷的非人哺乳动物而获得的动物；
[5] [4]的方法，其包括以下步骤： (1) 在高脂肪膳食饲喂条件下向AIM表达缺陷的非人哺乳动物施用测试物质的步骤， (2) 观察用测试物质施用的AIM表达缺陷的非人哺乳动物的以下特性的任何一项或 多项的步骤： (i) 肝重量， (ii) 肝脂肪量， (iii) 肝纤维， (iv) 肝癌，和 (V)肝脏中的炎症应答，和 (3) 通过与未施用所述测试物质比较来选择改善上述特性的测试物质的步骤；
[6] [4]或[5]的方法，其中所述肝脏疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化或 肝癌；
[7] 评估用于肝脏疾病的预防剂或治疗剂的预防或治疗效果的方法，其包括使用通过 用高脂肪膳食饲喂AIM表达缺陷的非人哺乳动物而获得的动物；
[8] [7]的方法，其包括以下步骤： (1) 在高脂肪膳食饲喂条件下向AIM表达缺陷的非人哺乳动物施用用于肝脏疾病的 预防剂或治疗剂的步骤， (2) 观察用用于肝脏疾病的预防剂或治疗剂施用的AIM表达缺陷的非人哺乳动物的 以下特性的任何一项或多项的步骤： (i) 肝重量， (ii) 肝脂肪量， (iii) 肝纤维， (iv) 肝癌， (V)肝脏中的炎症应答， (3)通过将上述特性与未施用用于肝脏疾病的预防剂或治疗剂的特性比较而评估用 于肝脏疾病的预防剂或治疗剂的效果的步骤；
[9] [7]或[8]的方法，其中所述肝脏疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化或 肝癌；
[10] 诊断肝脏疾病的方法，其包括以下步骤： (1) 测量试验主体的样品的AM浓度的步骤， (2) 将所述试验主体的样品的上述AM浓度与健康人的样品的AM浓度比较的步骤， (3) 当所述试验主体的样品的上述AIM浓度低于所述健康人的样品的AIM浓度时，判 断所述试验主体具有肝脏疾病或具有发生肝脏疾病的高可能性的步骤；
[11] [10]的方法，其中所述肝脏疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化或肝 癌；
[12] 用于预防或治疗肝脏疾病的方法，其包括向主体施用有效量的AIM或其部分肽、 或含有编码所述AIM或其部分肽的碱基序列的核酸；
[13] 用于预防或治疗肝脏疾病的方法，其包括向主体施用有效量的诱导AIM表达的 药物或稳定AIM的药物；
[14] [12]或[13]的方法，其中所述肝脏疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化 或肝癌；
[15] AIM或其部分肽、或含有编码所述AIM或其部分肽的碱基序列的核酸，其用于预 防或治疗肝脏疾病；
[16] [15]的AIM或其部分肽、或含有编码所述AIM或其部分肽的碱基序列的核酸，其 中所述肝脏疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化或肝癌；
[17] 诱导AIM表达的药物或稳定AIM的药物，其用于预防或治疗肝脏疾病；和
[18] [17]的药物，其中所述肝脏疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化或肝癌。
[0011] 发明效果 本发明可以提供用于肝脏疾病的预防剂或治疗剂，其包含AIM等作为活性成分。此外， 根据使用本发明的肝脏疾病模型小鼠的筛选方法，可以搜索对于肝脏疾病的预防或治疗有 效的物质。此外，使用本发明的肝脏疾病模型小鼠，可以评估已知的用于肝脏疾病的预防剂 或治疗剂的效果。此外，本发明可以提供通过测量试验主体的样品中的AIM浓度用于诊断 肝脏疾病的方法。
[0012] 附图简述 图1显示表示以下的图：A :用高脂肪膳食饲喂的AM KO小鼠和WT小鼠的肝重量、肝重 量与体重的比率和肝中中性脂肪的重量。平均值土SEM，P〈0. 001。B :用高脂肪膳食 饲喂的AM KO小鼠和WT小鼠的肝组织切片的苏木精-伊红（HE)染色的图像。
[0013] 图2 A:用高脂肪膳食饲喂之后第20周AM KO小鼠和WT小鼠的肝组织切片的天 狼星红染色的图像。B:显示用高脂肪膳食饲喂0、6、12、20、45、55周的AM KO小鼠和WT 小鼠的肝组织切片中纤维化比率的图。C:显示用高脂肪膳食饲喂的AM KO小鼠和WT小 鼠的肝脏中TGFI3 1和a SM的相对mRNA表达水平的图。
[0014] 图3显示A :从用高脂肪膳食饲喂52周的AM KO小鼠（表示为AM-/-)和WT小 鼠（表示为AIM+/+)分离的肝脏的拍摄图像。B:用高脂肪膳食饲喂52周的AIM KO小鼠 的肝组织切片的苏木精-伊红染色的图像。C:显示用高脂肪膳食饲喂0、6、12、20、45、52 周的AM KO小鼠和WT小鼠的肝组织切片中良好分化的肝细胞癌（HCC)的开始频率的图。
[0015] 图4显示用高脂肪膳食饲喂的AM KO小鼠和WT小鼠的肝组织切片的抗AFP抗体 染色的图像，和显示用高脂肪膳食饲喂的AM KO小鼠和WT小鼠的肝脏中AFP的相对表达 水平的图。
[0016] 图5提供显示用高脂肪膳食饲喂的AM KO小鼠和WT小鼠的肝脏中F4/80 (巨噬细 胞）、TNFα、IL-6、IL-lβ的相对表达水平的图。平均值±SEM，*;P〈0·05，** ;P〈0·01， ***; P〈0. OOl0
[0017] 图6显示A :AM KO小鼠、WT小鼠和RAG KO小鼠的血清中存在的AM的蛋白质印 迹图像，和体外结合至单克隆或多克隆IgM的AIM的蛋白质印迹图像，和B :用IgM静脉内 注射的RAG KO小鼠的血清中存在的AM的蛋白质印迹图像。
[0018] 图7显示在小鼠和人的血清中AM和IgM水平之间的相关性的图。
[0019] 图8显示抗AM抗体染色的图像和与AIM孵育的小鼠原代培养肝细胞的蛋白质印 迹图像。
[0020] 图9显示在与油酸预培养之后与或不与AIM孵育的小鼠原代培养肝细胞的油红0 染色的图像，和显示细胞中FSP27的相对表达水平的图。
[0021] 图10是3T3-L1前脂肪细胞中AIM或各SRCR结构域蛋白的脂肪细胞分化抑制效 果的图。
[0022] 图11是显示NASH患者和非NASH患者中血清的AM浓度的图。
[0023] 图12提供A :用高脂肪膳食与rAM或PBS喂食的AM KO小鼠中体重的变化的图， 和B :肝的目视图像，肝组织切片（癌症部位，非癌症部位）的苏木精-伊红染色的图像，显 示癌症发病率的图，和显示用高脂肪膳食与rAIM或PBS喂食的AM KO小鼠中肝中性脂肪 的量的图。
[0024] 实施方案的描述 本发明中的AIM是包含与SEQ ID N0:2中显示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基 酸序列的蛋白。
[0025] AM可以是，例如，从巨噬细胞分离和纯化的蛋白，所述巨噬细胞是温血动物（例 如，人、小鼠、大鼠、兔、绵羊、猪、牛、马、猫、狗、猴、黑猩猩、鸡等）的免疫细胞。它也可以是 化学合成的或在无细胞翻译系统中生物化学合成的蛋白。或者，该蛋白可以是从掺入核酸 的转化体产生的重组蛋白，所述核酸包含编码上述氨基酸序列的碱基序列。
[0026] 与SEQ ID N0:2中显示的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列是指与SEQ ID NO: 2中显示的氨基酸序列等具有约60 %或更高，优选约70 %或更高，进一步优选约80 %或 更高，特别优选约90%或更高，最优选约95%或更高的同源性的氨基酸序列。在这里，"同 源性"是指在使用本【技术领域】中已知的数学算法比对两条氨基酸序列时在最佳比对中相同 的氨基酸残基和类似的氨基酸残基与所有重叠的氨基酸残基的比率（％)(优选地，该算法 考虑在序列的一侧或两侧引入缺口，用于最佳比对）。"类似氨基酸"意指具有类似物理化学 特性的氨基酸；其实例包括在相同组下分类的氨基酸，诸如芳香族氨基酸（Phe、Trp、Tyr)， 脂肪族氨基酸仏]^、1^11、116、'\^11)，极性氨基酸（6111、4811)，碱性氨基酸（1^8、4找、把8)， 酸性氨基酸（Glu、Asp)，具有羟基的氨基酸（Ser、Thr)，和具有小侧链的氨基酸（Gly、Ala、 Ser、Thr、Met)。预期通过此类相似氨基酸的取代不会改变蛋白的表型（即，保守氨基酸取 代）。保守氨基酸取代的具体实例是【技术领域】中已知的，并且描述于各种文献（参见，例如， Bowie 等人，Science, 247:1306-1310 (1990))〇
[0027] 本说明书中的氨基酸序列同源性可以在以下条件（期望值=10 ;允许缺口；矩 阵=BL0SUM62;过滤=OFF)下使用同源性计算算法 NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)来计算。作为用于石角 定氨基酸序列同源性的其它算法的实例，可以提到Karlin等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877 (1993)中描述的算法[该算法被并入NBLAST和XBLAST程序（版本 2.0) (Altschul 等人，Nucleic Acids Res·，25:3389-3402 (1997))]，Needleman 等人， J. Mol. Biol.，48:444-453 (1970)中描述的算法[该算法被并入GCG软件包中的GAP 程序]，Myers和Miller, CABI0S，4:11-17 (1988)中描述的算法[该算法被并入ALIGN 程序（版本2. 0)，这是CGC序列比对软件包的部分]，Pearson等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-2448 (1988)中描述的算法[该算法被并入GCG软件包中的FASTA程 序]等，它们同样可以优选使用。
[0028] 更优选地，与SEQ ID N0:2中显示的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列是与SEQ ID NO:2中显示的氨基酸序列具有约60%或更高，优选约70%或更高，进一步优选约80% 或更高，特别优选约90%或更高，且最优选约95%或更高的同一性的氨基酸序列。
[0029] 作为包含与SEQ ID N0:2中显示的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列的蛋白， 例如，包含与上述SEQ ID N0:2中显示的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列且具有与包 含SEQ ID N0:2等中显示的氨基酸序列的蛋白的活性实质上相同质量的活性的蛋白是优选 的。在这里，"活性"是指，例如，抑制动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的凋亡的活性，维持或促 进动脉硬化的活性，脂肪细胞分化抑制活性，熔化脂肪细胞的脂滴的活性，脂肪细胞降低活 性，CD36结合活性，胞吞至脂肪细胞的活性，FAS结合活性，FAS功能抑制活性，抗肥胖活性 等。"实质上相同的质量"意指其活性是定性地（例如，生理学上或药理学上）相同的。因 此，优选的是，上述活性是相互等效的，但这些活性的定量系数，诸如活性的程度（例如，约 0. 1至约10倍，优选约0. 5至约2倍）和蛋白的分子量，可以是不同的。
[0030] 上述活性可以通过本身已知的方法进行测量。
[0031] 本发明中AM的实例还包括包含以下的蛋白：（1)从SEQ ID N0:2中显示的氨基 酸序列缺失1或2个或更多个（优选约1至100,优选约1至50,进一步优选约1至10,特 别优选1至几个（2、3、4或5))氨基酸的氨基酸序列，（2)向SEQ ID NO:2中显示的氨基酸 序列添加1或2个或更多个（优选约1至100,优选约1至50,进一步优选约1至10,特别 优选1至几个（2、3、4或5))氨基酸的氨基酸序列，（3)在SEQ ID NO: 2中显示的氨基酸序 列中插入1或2个或更多个（优选约1至50,优选约1至10,进一步优选1至几个（2、3、4 或5))氨基酸的氨基酸序列，（4)在SEQ ID N0:2中显示的氨基酸序列中被其它氨基酸取 代1或2个或更多个（优选约1至50,优选约1至10,进一步优选1至几个（2、3、4或5)) 氨基酸的氨基酸序列，或（5)包含其组合的氨基酸序列。
[0032] 当已经如上所述插入、缺失或取代氨基酸序列时，插入、缺失或取代的位置没有特 别限制，只要维持该蛋白的活性。
[0033] 本发明的AIM优选为具有SEQ ID NO:2中显示的氨基酸序列的人AM蛋白 (GenBank登录号：AAD01446)，或其在其它哺乳动物中的同源物[例如，在GenBank中作为 登录号：AAD01445注册的小鼠同源物等]。
[0034] 在本说明书中，根据肽命名的惯例描述蛋白和肽，其中左端表示N末端（氨基末 端），右端表不C末端（幾基末端）。在包括包含SEQ ID NO: 2中显不的氣基酸序列的蛋白 的本发明的AIM中，C末端可以是羧基（-C00H)、羧酸盐（_C00_)、酰胺（-CONH 2)和酯（-C00R) 中的任一种。
[0035] 在这里，作为酯中的R，可以使用Cp6烷基，例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基和正 丁基，c 3_8环烷基，例如，环戊基和环己基，C 6_12芳基，例如苯基和α-萘基，苯基-Cp2烷基， 例如苄基和苯乙基，C 7_14芳烷基，例如，α-萘基-Cp2烷基，例如，α-萘基甲基、新戊酰氧基 甲基;等。
[0036] 当本发明的AIM在除了 C末端以外的位置具有羧基（或羧酸酯）时，其中羧基被 酰胺化或酯化的蛋白也包括在本发明的蛋白中。在此情况下，作为酯，使用例如上述在C末 端的醋等。
[0037] 此外，本发明的AM还包括：其中N末端氨基酸残基的氨基被保护基团（例如，CV6 酰基，诸如CV6烷酰基（alkanoyl)诸如甲酰基和乙酰基等）保护的蛋白；其中可以在体内 在N末端裂解后产生的谷氨酰胺残基已经被转化为焦谷氨酸的蛋白，其中分子中氨基酸的 侧链上的取代基（例如，-〇H、_SH、氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等）被适当的保护基团（例 如，CV 6酰基，诸如C η烷酰基诸如甲酰基和乙酰基等）保护的蛋白，缀合的肽，诸如所谓具 有与之键合的糖链的糖肽等。
[0038] AIM的部分肽（下文有时简称为"本发明的部分肽"）可以是任意的，只要它是具 有上述AM的部分氨基酸序列且具有与AIM实质上相同质量的活性的肽。在这里，"实质上 相同质量的活性"如上文所定义。此外，可以以与AIM的情况下相同的方式测量"实质上相 同质量的活性"。
[0039] 由于AM包含3个包含大量半胱氨酸的SRCR (富含半胱氨酸的清道夫受体）结构 域，所以各SRCR结构域都可以被用作本发明的部分肽。具体而言，例如，在SEQ ID N0:2中 显示的氨基酸序列中，可以使用分别包含SRCRl结构域（SEQ ID N0:2中显示的氨基酸序列 的氨基酸编号24 - 125)、SRCR2结构域（SEQ ID N0:2中显示的氨基酸序列的氨基酸编号 138 - 239)和SRCR3结构域（SEQ ID NO: 2中显示的氨基酸序列的氨基酸编号244 - 346) 的部分氨基酸序列，包含SRCR结构域的任何组合的部分氨基酸序列等。本发明的部分肽的 大小没有特别限制，只要它包含上述功能结构域。部分肽优选包含不小于50的部分氨基酸 序列，更优选不小于100的部分氨基酸序列，进一步优选不小于200的部分氨基酸序列。部 分氨基酸序列可以是单一连续的部分氨基酸序列，或者彼此连接的不连续的多个部分氨基 酸序列。
[0040] 此外，本发明的部分肽的C末端可以是羧基（-COOH)、羧酸盐（_COO_)、酰胺 (-CONH 2)和酯（-COOR)中的任一种。在这里，酯中的R的实例包括类似于AM的上述实例 的那些。当本发明的部分肽在除了C末端以外的位置具有羧基（或羧酸酯）时，羧基被酰 胺化或酯化，其也包括在本发明的部分肽中。作为这种情况下的酯，例如，使用与在C末端 的酯类似的那些等。
[0041] 此外，在本发明的部分肽中，以与上述AIM相同的方式，N末端氨基酸残基的氨基 可以用保护基团保护，N末端的谷氨酰胺残基可以被转化为焦谷氨酸，分子中氨基酸的侧链 上的取代基可以用合适的保护基团保护，或者部分肽可以是其中糖链被键合的合成肽（所 谓的糖狀等），等。
[0042] 本发明中待使用的AM或其部分肽可以是盐的形式。例如，使用与生理学上可接 受的酸（例如，无机酸、有机酸）、碱（例如，碱金属盐）的盐等，并且生理学上可接受的酸加 成盐是优选的。有用的盐包括，例如，与无机酸（例如，盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸）的盐或与 有机酸（例如，乙酸、甲酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯 甲酸、甲磺酸、苯磺酸）的盐等。
[0043] 可以通过本身已知的蛋白纯化方法从上述哺乳动物的巨噬细胞产生AM。具体而 言，AIM或其盐可以通过均质化哺乳动物巨噬细胞，通过低速离心去除细胞碎片，以高速离 心上清液以沉淀包含细胞膜的级分，并且使上清液进行层析诸如反相层析、离子交换层析、 亲和层析等等来制备。
[0044] AIM或其部分肽也可以根据公众已知的肽合成方法来制备（以下在其化学合成的 说明中，全长AIM和其部分肽被综合简称为AIM，除非另有规定）。
[0045] 肽合成的方法可以是，例如，固相合成方法和液相合成方法中的任一种。期望的蛋 白可以通过将能够构成AIM的部分肽或氨基酸与剩余部分缩合，并且去除所得产物可具有 的任何保护基团来产生。
[0046] 在这里，缩合和保护基团去除根据本身已知的方法，例如，下面（1)和（2)中所示 的方法来进行： (1) M. Bodanszky 和 M. A. Ondetti: Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966) (2) Schroeder 和 Luebke: Academic Press, New York (1965)〇
[0047] 因此获得的AM可以通过已知的纯化方法进行纯化或分离。在这里，作为纯化方 法的实例，可以提到溶剂提取、蒸馏、柱层析、液相层析、重结晶、其组合等。
[0048] 当因此获得的AIM是游离形式时，可以将所述游离形式通过已知方法或其类似方 法转化为合适的盐形式，并且在另一方面，当获得盐形式的AM时，它可以通过已知方法或 其类似方法转化为游离形式或者不同的盐的形式。
[0049] 此外，AM也可以通过培养包含编码其的核酸的转化体，以及从获得的培养物中分 离和纯化AM而产生。编码AM或其部分肽的核酸可以是DNA或RNA，或DNA/RNA嵌合体， 优选DNA。此外，核酸可以是双链或单链的。在双链核酸的情况下，它可以是双链DNA、双链 RNA、或DNA = RNA杂合体。在单链的情况下，它可以是有义链（即编码链）或反义链（即非 编码链）。
[0050] 编码AM或其部分肽的DNA的实例包括基因组DNA，源自温血动物（例如人、牛、 猴、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫、豚鼠、大鼠、小鼠、兔、仓鼠、鸡等）的巨噬细胞的cDNA，合成 的DNA等。编码AM或其部分肽的基因组DNA可以通过聚合酶链式反应（在下文中简称 为"PCR方法"）直接扩增，其通过使用从以下制备的基因组DNA级分作为模板：人或其它 温血动物（例如，猴、牛、马、猪、绵羊、山羊、兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、鸡等）的上述动物的 任何细胞[例如，肝细胞、脾细胞、神经细胞、神经胶质细胞、胰脏β细胞、骨髓细胞、肾小球 系膜细胞、朗格汉斯细胞、表皮细胞、上皮细胞、杯状细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细 胞、纤维细胞、肌细胞、脂肪细胞、免疫细胞（例如，巨噬细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、 肥大细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞）、巨核细胞、滑膜细胞、 软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、乳腺细胞、肝细胞或间质细胞、或其对应的祖细胞、 干细胞或癌细胞等]，或其中存在此类细胞的任何组织[例如，脑或脑的任何部分（例如， 嗅球、杏仁核、基底神经节、海马、丘脑、下丘脑、底丘脑核、大脑皮质、延髓、小脑）、脊髓、脑 垂体、胃、胰腺、肾、肝、生殖腺、甲状腺、胆囊、骨髓、肾上腺、皮肤、肺、胃肠道（例如大肠、小 肠）、血管、心脏、胸腺、脾脏、下颁下腺、外周血、前列腺、睾丸、卵巢、胎盘、子宫、骨、关节、月旨 肪组织（例如，棕色脂肪组织、白色脂肪组织）、骨骼肌等]，且编码AM或其部分肽的cDNA 也可以通过PCR方法和逆转录酶-PCR(在下文简称为"RT-PCR方法"）通过分别使用从巨 噬细胞制备的总RNA或mRNA级分作为模板直接扩增。或者，编码AM或其部分肽的基因组 DNA和cDNA也可以通过菌落或噬菌斑杂交方法或PCR方法等从通过将上述基因组DNA和总 RNA或mRNA的片段插入合适的载体中而制备的基因组DNA文库和cDNA文库中克隆。用于 文库的载体可以是任何噬菌体、质粒、粘粒、噬菌粒等。
[0051] 编码AM的DNA的实例包括包含与SEQ ID NO: 1的碱基编号64至1107显示的碱 基序列相同或实质上相同的喊基序列的DNA等。
[0052] 作为包含与SEQ ID NO: 1的碱基编号64至1107显示的碱基序列相同或实质上相 同的碱基序列的DNA，使用包含与SEQ ID N0:1的碱基编号64至1107显示的碱基序列具有 不小于约60%、优选不小于约70%、更优选不小于约80%、特别优选不小于约90 %的同源 性的碱基序列，且编码具有与上述AM等的实质上相同质量的活性的蛋白的DNA。
[0053] 本说明书中的碱基序列同源性可以在以下条件（期望值=10 ;允许缺口；过滤= ON;匹配得分=1;错配得分=-3)下使用同源性计算算法NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)来计算。作为用 于确定碱基序列同源性的其它算法的优选实例，还可以提到上述氨基酸序列同源性计算算 法。
[0054] 编码AM的DNA优选是包含SEQ ID NO: 1的碱基编号64至1107显示的碱基序列 显示的编码人AM蛋白的碱基序列的DNA (GenBank登录号：AF011429)，或其在其它哺乳动 物中的同源物[例如，在GenBank中作为登录号：AF011428注册的小鼠同源物等]。
[0055] 编码本发明的部分肽的DNA可以是任意的，只要它包含编码包含与SEQ ID NO:2 中显示的氨基酸序列的部分相同或实质上相同的氨基酸序列的肽的碱基序列。具体而言， 作为编码本发明的部分肽的DNA，使用（1)包含由SEQ ID NO: 1的碱基编号64至1107显 示的碱基序列显示的部分碱基序列的DNA，或（2)包含与包含SEQ ID NO: 1的碱基编号64 至1107显示的部分碱基序列的DNA具有不小于约60%、优选不小于约70%、更优选不小于 约80%、特别优选不小于约90%的同源性的碱基序列，且编码具有与上述AM等的实质上 相同质量的活性的蛋白的DNA。
[0056] 编码AM或其部分肽的DNA可以通过PCR方法通过扩增具有编码AM或其部分肽 的碱基序列的部分的合成DNA，或将并入合适的表达载体的DNA与编码AM的部分或完整区 域的标记的DNA片段或合成DNA杂交来克隆。杂交可以根据本身已知的方法或基于其上的 方法，例如，描述于Molecular Cloning,第2版（J. Sambrook等人，Cold Spring Harbor Lab. Press，1989)的方法等来进行。当使用商购文库时，杂交可以根据所附说明书手册中 描述的方法来进行。杂交可以优选在高严格条件下进行。
[0057] 作为高严格条件的实例，可以提到在45°C在6 XSSC (氯化钠/柠檬酸钠）中杂交 反应、随后在65°C在0. 2XSSC/0. 1% SDS中洗涤一次或多次的条件等。本领域技术人员能 够通过适当地改变杂交溶液的盐浓度、杂交反应温度、探针浓度、探针长度、错配数、杂交反 应时间、洗涤溶液的盐浓度、洗涤温度等而容易地获得期望的严格性。当使用商购文库时， 杂交可以根据随附所述文库的说明书手册中描述的方法来进行。
[0058] 包含编码AM或其部分肽的DNA的表达载体可以通过以下产生，例如，从编码AM 的DNA切出期望的DNA片段，并且将所述DNA片段接合在适当的表达载体中启动子下游。
[0059] 作为表达载体，使用源自大肠杆菌的质粒（例如，pBR322、pBR325、pUC12、pUC13); 动物细胞表达质粒（例如，pAl_ll、pXTl、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo);动物病毒载体， 诸如逆转录病毒、牛痘病毒、腺病毒等等。
[0060] 该启动子可以是任何启动子，只要它适用于用于表达所述基因的宿主。
[0061] 例如，当宿主是动物细胞时，使用SRa启动子、SV40启动子、LTR启动子、CMV(巨 细胞病毒）启动子、RSV (劳斯肉瘤病毒）启动子、MoMuLV (莫洛尼鼠白血病病毒）LTR、 HSV-TK(单纯疱瘆病毒胸苷激酶）启动子等。在这些中，CMV启动子、SRa启动子等是优选 的。
[0062] 当宿主是属埃希氏菌属的细菌时，trp启动子、Iac启动子、recA 启动子、λ 动子、Ipp启动子、T7启动子等是优选的。
[0063] 除了上述以外，有用的表达载体包括，任选携带增强子、剪接信号、多聚腺苷酸附 加信号、选择标记、SV40复制原点（以下也简称为SV40ori)等的那些。作为选择标记的实 例，可以提到二氢叶酸还原酶（以下也简称为dhfr)基因[甲氨蝶呤（MTX)抗性]、氨苄青 霉素抗性基因（以下也简称为▲￥/)、新霉素抗性基因（以下也简称为AfeA G418抗性）等。 具体而言，当使用缺乏dhfr基因的中国仓鼠细胞以及作为选择标记的dhfr基因时，也可使 用不含胸苷的培养基来选择目标基因。
[0064] 必要时，可以将编码适合用于宿主的信号序列的碱基序列（信号密码子）添加 (或用天然信号密码子取代）至编码AIM或其部分肽的DNA的5'-末端侧。例如，当宿主是 属埃希氏菌属，使用PhoA信号序列、OmpA信号序列等；当宿主是动物细胞时，使用胰岛素信 号序列、α-干扰素信号序列、抗体分子信号序列等。
[0065] AM或其部分肽可以通过用包含上述编码AM或其部分肽的DNA的表达载体转化 宿主并培养获得的转化体来产生。
[0066] 作为宿主，例如，使用属埃希氏菌属、动物细胞等。
[0067] 作为属埃希氏菌属，例如，使用大肠杆菌K12_DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA), vol. 60，160(1968)]，大肠杆菌 JM103 [Nucleic Acids Research, vol. 9， 309 (1981)]，大肠杆菌 JA221 [Journal of Molecular Biology, vol. 120，517(1978)]， 大肠杆菌 HBlOl [Journal of Molecular Biology, vol. 41，459 (1969)]，大肠杆菌 C600 [Genetics, vol. 39，440 (1954)]等。
[0068] 作为动物细胞，例如，使用猴COS-7细胞、猴Vero细胞、中国仓鼠卵巢细胞（以下 简称为CHO细胞）、dhfr基因缺陷的CHO细胞（以下简称为CH0(dhfr_)细胞）、小鼠 L细 胞、小鼠 AtT-20细胞、小鼠骨髓瘤细胞、大鼠 GH3细胞、人FL细胞等。
[0069] 转化可基于公众已知的方法根据宿主种类进行。
[0070] 属埃希氏菌属可以，例如，根据描述于Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 69， 2110 (1972)，Gene, vol. 17，107 (1982)中的方法等进行转化。
[0071] 动物细胞可以，例如，根据描述于 Saibo Kogaku (Cell Engineering)，extra issue 8, Shin Saibo Kogaku Jikken Protocol (New Cell Engineering Experimental Protocol), 263-267 (1995) ,Shujunsha 出版，或 Virology, Vol. 52, 456 (1973)的方 法进行转化。
[0072] 转化体的培养可基于公众已知的方法根据宿主种类进行。
[0073] 作为用于培养转化体（其宿主是属埃希氏菌属的细菌）的培养基的实例，补充有 葡萄糖和酪蛋白水解物的M9培养基[Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433，Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972]是优选的。根据 需要，为了增强启动子效率，可以将化学剂诸如3 β -吲哚丙烯酸添加至培养基中。
[0074] 转化体（其宿主是属埃希氏菌属的细菌）的培养通常在约15°C至约43°C进行约 3至约24小时。如果必要，培养物可以进行通气或搅拌。
[0075] 用于培养转化体（其宿主是动物细胞）的有用的培养基包括，例如，包含约5 -约 20%胎牛血清的最低基础培养基（MEM) [Science, vol. 122，501 (1952)]，Dulbecco 改良 的 Eagle 培养基（DMEM) [Virology, vol. 8，396 (1959)]，RPMI1640 培养基[The Journal of the American Medical Association, vol. 199，519 (1967)]，199 培养基[Proceeding of the Society for the Biological Medicine, vol. 73，1(1950)]等。培养基的 pH 优 选为约6至约8。培养通常在约30°C至约40°C进行约15至约60小时。如果必要，培养物 可以进行通气或搅拌。
[0076] 如上所述，AM可以在转化体的细胞中或细胞外产生。
[0077] AIM或其部分肽可以根据本身已知的方法从通过培养上述转化体获得的培养物中 分离和纯化。
[0078] 例如，当从培养的细菌或细胞的细胞质中提取AIM或其部分肽时，适当地使用以 下方法，其中通过已知方式收集细菌或细胞，将其悬浮在适当的缓冲溶液中，并借助于超声 处理、溶菌酶和/或冻融等破碎，其后，通过离心或过滤获得可溶性蛋白的粗提取物。缓冲 溶液可包含蛋白变性剂诸如尿素或盐酸胍，和表面活性剂，诸如Triton X-100?。此外，当 AIM或其部分肽被分泌在真菌（细胞）外时，使用通过离心、过滤等从培养物等中分离培养 上清液的方法。
[0079] 因此获得的可溶性级分和培养上清液中含有的AIM或其部分肽的分离和纯化可 以根据本身已知的方法来进行。有用的方法包括基于溶解度的方法，诸如盐析和溶剂沉淀； 主要基于分子量差异的方法，诸如透析、超滤、凝胶过滤和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；基于 电荷差异的方法，诸如离子交换层析；基于特异性亲和力的方法，诸如亲和层析；基于疏水 性差异的方法，诸如反相高效液相层析；和基于等电点差异的方法，诸如等电聚焦。这些方 法可以适当地组合。
[0080] 因此获得的AM或其部分肽的存在可以通过酶免疫测定法、蛋白质印迹法等使用 针对AM的抗体来证实。
[0081] 如上所述获得的AIM或其部分肽或其盐或包含编码AM或其部分肽（有时在这里 表示为AIMs)的碱基序列的核酸可以作为用于预防肝脏疾病的发病或肝脏疾病的治疗的 药剂提供。
[0082] 在本发明中，诱导AM表达的药物和稳定AM的药物也可用于替代AMs。
[0083] 诱导AM表达的药物的实例包括具有AM转录活性等的化合物，并且该化合物的 实例包括能够结合AM基因的启动子区域等的转录因子。本发明人还发现，AIM在巨噬细胞 中表达。因此，作为诱导AIM表达的药物，可以提到巨噬细胞分化诱导剂。巨噬细胞分化诱 导剂没有特别限制，只要其可以从祖细胞诸如粒细胞-巨噬细胞集落形成细胞（CFU-GM)、 巨噬细胞集落形成细胞（CFU-M)等诱导巨噬细胞的分化，并且可以使用粒细胞-巨噬细胞 集落刺激因子（GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF)等。转录因子、GM-CSF、M-CSF可 以是通过上述已知方式从哺乳动物组织和细胞中分离和纯化的蛋白，或者可以是化学合成 的或在无细胞翻译系统中生物化学合成的蛋白。或者，它们可以是从用包含编码上述蛋白 的碱基序列的核酸导入的转化体产生的重组蛋白。
[0084] 稳定AIM的药物的实例包括抑制AIM的降解的化合物，抑制排泄到尿中的化合物 等。抑制降解的化合物的实例包括蛋白酶抑制剂，蛋白酶体抑制剂等。蛋白酶抑制剂的实 例包括丝氨酸蛋白酶抑制剂（4-(2-氨基乙基）苯磺酰氟盐酸化物（AEBSGF)、抑肽酶、胰蛋 白酶抑制剂等），半胱氨酸蛋白酶抑制剂（E-64,亮肽素等）等。蛋白酶体抑制剂的实例包 括乳胞素、MG-115、MG-132、蛋白酶体抑制剂I等。抑制排泄到尿中的化合物的实例包括 赋予AM防止通过肾小球基底膜的分子量的化合物。如下述实施例中所示，由于可以证实 IgM与AM的结合，所以IgM可作为抑制AM排泄到尿中的化合物提及。然而，由于担心施 用IgM本身引起免疫系统中的副作用，优选使用通过融合IgM的Fc片段（这是与AIM的结 合位点）和具有防止肾小管的过滤和排泄到尿中的水平的分子量的蛋白而获得的融合蛋 白。尽管待融合的蛋白没有特别限制，但具有较少副作用担心的蛋白是优选的，并且，例如， 可以使用白蛋白。结合可以是直接结合或经由铰链区。铰链区的实例包括串联FLAG标签。 此类分子可以通过常规方法通过连接编码每个的基因且作为单一重组蛋白来产生。
[0085] 在本发明的下述实施例中，与野生型（WT)小鼠相比，AM敲除小鼠在高脂肪膳 食饲喂条件下显示肝脏疾病的促进发病。具体地，肝脏疾病类似于非酒精性脂肪性肝炎 (NASH)的病理学，且进展为肝硬化和肝细胞癌，这是该疾病的特征，被证实为可重复的。从 上述内容中，表明AIMs、诱导AIM表达的药物或稳定AM的药物、或者可以通过下述筛选方 法进行搜索的能够取代AIM的功能的化合物防止肝脏疾病的发病和进展并治疗肝脏疾病。
[0086] 作为本发明的包含AMs、诱导AM表达的药物或稳定AM的药物的药物组合物的 应用目标的肝脏疾病是，例如，脂肪肝、NASH、肝硬化和肝癌。在另一个方面，作为本发明的 包含AMs、诱导AM表达的药物或稳定AM的药物的药物组合物的应用目标的肝脏疾病是， 例如，与肝星状细胞的活化相关的肝脏疾病。肝星状细胞活化的指标是，例如，a SMA(a -平 滑肌肌动蛋白）mRNA的表达。因此，肝脏疾病可能是其中与正常肝组织相比a SM mRNA 显著高表达的肝脏疾病。在又另一个方面，肝脏疾病可能是其中与正常肝组织相比TGF0 1 或胶原4A1显著高表达的肝脏疾病。
[0087] 本发明的包含AMs、诱导AM表达的药物或稳定AM的药物的药物组合物是低毒 性的，并且可以作为液体原样，或作为药物组合物的合适剂型，口服或胃肠外（例如，血管 内施用，皮下施用等）施用于人或其它温血哺乳动物（例如，小鼠、大鼠、兔、绵羊、猪、牛、 猫、狗、猴等）。
[0088] 作为用于胃肠外施用的组合物的实例，使用注射剂、栓剂等；所述注射剂可包括剂 型，诸如静脉内注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌内注射剂和滴注注射剂。此类注射剂可 以根据公众已知的方法来制备。注射剂可以通过以下制备，例如，将上述本发明的AMs、诱 导AM表达的药物或稳定AIM的药物溶解、悬浮或乳化在通常用于注射剂的无菌水溶液或 油性溶液中。作为用于注射的水溶液的实例，可以使用生理盐水、包含葡萄糖或另一种辅助 药物的等渗溶液等，其可以与适当的增溶剂组合使用，所述增溶剂，例如，醇（例如乙醇）， 多元醇（例如，丙二醇，聚乙二醇），非离子表面活性剂[例如，聚山梨酯80，HC0-50 (氢化 蓖麻油的聚氧乙烯（50 mol)加合物）]等。作为油性溶液的实例，可以使用芝麻油、大豆油 等，其可以与作为增溶剂的苯甲酸苄酯、苄醇等组合使用。将制备的注射溶液优选填充在适 当安瓿中。用于直肠施用的栓剂可以通过将上述本发明的AIMs、诱导AIM表达的药物或稳 定AIM的药物与普通栓剂基质混合来制备。
[0089] 作为用于口服施用的组合物，可以提到固体或液体剂型，特别是片剂（包括糖包 衣片剂和薄膜包衣片剂）、丸剂、颗粒剂、粉剂、胶囊（包括软胶囊）、糖浆剂、乳剂、悬浮剂 等。此类组合物通过公众已知的方法产生，并且可以包含在药物制备领域中常用的载体、稀 释剂或赋形剂。作为用于片剂的载体或赋形剂的实例，可以使用乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸镁 等。
[0090] 用于胃肠外或口服施用的上述药物组合物被便利地制备在适用于活性成分的剂 量的药物单位剂型中。作为此类药物单位剂型的实例，可以提到片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂 (安瓿）和栓剂。优选的是，可以以例如，每个药物单位剂型通常5至500 mg，特别是5至 100 mg用于注射剂，或10至250 mg用于其它剂型，来含有上述本发明的AMs、诱导AM表 达的药物或稳定AIM的药物。
[0091] 尽管本发明的包含AMs、诱导AM表达的药物或稳定AM的药物的上述预防剂或 治疗剂的剂量根据施用的主体、目标疾病、症状、施用途径等而变化；例如，当该药剂用于治 疗/预防成人中的肝脏疾病时，基于单一剂量，通过静脉内注射，每天约1至5次，优选每天 约1至3次，通常以约0. 01至20 mg/kg体重，优选约0. 1至10 mg/kg体重，且更优选约 0.1至5 mg/kg体重方便地施用本发明的AIMs。在肠胃外施用和口服施用的其它模式的情 况下，可以施用相似的剂量。在症状特别严重的情况下，可以根据症状增加剂量。
[0092] 每种上述组合物都可以包含当与上述AMs、诱导AM表达的药物或稳定AM的药 物配制时不产生不想要的相互作用的任何其它活性成分。
[0093] 此外，本发明的AMs、诱导AM表达的药物或稳定AM的药物可以与可用于治疗肝 脏疾病的其它药物组合使用，所述可用于治疗肝脏疾病的其它药物诸如胰岛素增敏剂（例 如，噻唑烷衍生物类，诸如罗格列酮、吡格列酮等等，双胍类，诸如二甲双胍、丁双胍等）；抗 氧化剂类（例如，维生素 E、维生素 C、甜菜碱、EPL(多烯磷脂酰胆碱）等）；护肝剂（例如 熊去氧胆酸（UDCA)等）；抗高血脂症剂（例如，贝特类药物、普罗布考、他汀类药物等）； 降压药（例如，血管紧张素 II受体拮抗剂等）；甘草素制剂；中国草药（例如，小柴胡汤 等）；抗癌剂等。本发明的AIMs、诱导AIM表达的药物或稳定AIM的药物和 上述药物可以一次或不同次施用于患者。
[0094] 如上所述，证实了与野生型小鼠相比，AM敲除小鼠在高脂肪膳食饲喂条件下高频 率发生类似于非酒精性脂肪性肝炎（NASH)的病理学的肝脏疾病，并进一步进展为肝硬化 和肝细胞癌。这表明，高脂肪膳食饲喂条件下的AIM敲除小鼠可以作为肝脏疾病的新模型 小鼠提供。因此，本发明提供了针对用于预防或治疗肝脏疾病的药剂的筛选方法，其使用通 过用高脂肪膳食饲喂AM表达缺陷的非人哺乳动物而获得的动物。
[0095] AM表达缺陷的非人哺乳动物意指其中内源AM的表达失活的非人哺乳动物，包 括从其中AIM敲除（KO)的ES细胞制备的AM KO动物，以及其中AIM表达被反义或RNAi 技术失活的敲低（KD)动物等。在这里，"敲除（KO) "意指通过破坏或去除内源基因而防止 完整mRNA的产生，而"敲低（KD) "意指抑制从mRNA翻译为蛋白以失活内源基因的表达。在 下文中，本发明的AM K0/KD动物有时简称为"本发明的K0/KD动物"。本发明的AM KO动 物公开于 Miyazaki T.等人·（J. Exp. Med.，189，413-422，1999) 〇
[0096] 可以是本发明的主体的"非人哺乳动物"没有特别限制，只要它是已经对其建立转 基因系统的非人哺乳动物；实例包括小鼠、大鼠、牛、猴、猪、绵羊、山羊、兔、狗、猫、豚鼠、仓 鼠、大鼠、小鼠等。兔、狗、猫、豚鼠、仓鼠等是优选的；具体而言，从疾病模型动物制备的观点 来看，具有相对短的个体发育时期和生命周期且易于繁殖的啮齿类动物是更优选的；具体 地，小鼠（例如，作为纯系的C57BL/6品系、BALB/c品系、DBA2品系等，作为杂交系的B6C3Fi 品系、BDF1S系、B6D2F i品系、ICR品系）和大鼠（例如，Wistar、SD等）是优选的。
[0097] 除了哺乳动物以外，鸟类诸如鸡可用于与作为本发明的主体的"非人哺乳动物"的 目的相同的目的。
[0098] 用于敲除AIM的具体方法公开于上述Miyazaki T.等人（J. Exp. Med，189， 413-422，1999)。作为其它已知的一般方法，可以优选使用包括以下的方法：通过常规方 法分离源自主体非人哺乳动物的AM(基因组DNA)，并通过例如（1)通过将另一 DNA片段 (例如，药物抗性基因，报道基因等）插入外显子部分或启动子区域而破坏外显子或启动子 的功能，或（2)使用Cre-IoxP系统或Flp-frt系统切出AM的整体或部分以缺失基因，或 (3)将终止密码子插入蛋白编码区以防止翻译为完整蛋白，或（4)将终止基因转录的DNA序 列（例如，多聚腺苷酸附加信号等）插入转录区以防止合成完整的mRNA(以下简称为靶向 载体），通过同源重组等在主体非人哺乳动物的AIM基因座处整合具有构建以随后失活基 因的DNA序列的DNA链。
[0099] 同源重组可以通过，例如，将上述靶向载体引入胚胎干细胞（ES细胞）来获得。
[0100] ES细胞是指在胚泡期源自受精卵的内细胞团（ICM)的细胞，并且可以培养和维 持，同时在体外保持未分化状态。ICM细胞注定形成胚体，是所有组织包括生殖细胞都基于 其的干细胞。所使用的ES细胞可以是建立的细胞系，或根据Evans和Kaufman (Nature, vol. 292，p. 154，1981)的方法新建立的细胞系。例如，在小鼠 ES细胞的情况下，目前通常 使用源自129小鼠品系的ES细胞，但其免疫学背景不清楚；出于获得具有免疫学清楚的遗 传背景的纯系的ES细胞等来替代它的目的，也可以合适地使用从C57BL/6小鼠或从BDF/J、 鼠（C57BL/6和08八/2的？1)建立的ES细胞等，其中可从C57BL/6收集的少数卵子已经通过 与DBA/2杂交而进行改良。除了可收集的卵子数目高且卵子强健的优点以外，BDF 1小鼠具 有C57BL/6小鼠作为其背景；因此，可以有利地使用由其衍生的ES细胞，因为当制备疾病模 型小鼠时，遗传背景可以通过与C57BL/6小鼠回交而用C57BL/6小鼠的遗传背景来替代。ES 细胞可以在适当条件下通过单层培养（直至达到高密度），或悬浮培养（直至形成细胞聚 集物）被分化为许多种类型的细胞，包括体壁肌（parietal muscle)、内脏肌和心肌[M.J. Evans和M.H. Kaufman, Nature vol. 292, p. 154, 1981; G. R. Martin, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ), vol. 78, p. 7634, 1981; T. C. Doetschman 等人，Journal of Embryology and Experimental Morphology，vol. 87，p. 27，1985];通过分化整合有靶向载体的ES细胞获得的AM表达 缺陷的非人哺乳动物的细胞可用于AIM的体外细胞生物学研宄中。
[0101] 例如，如果靶向载体被设计成通过将另一 DNA片段插入AM基因的外显子部分或 启动子区域以破坏外显子或启动子的功能，则该载体可以假定，例如，下面所示的构造。
[0102] 首先，为了确保另一 DNA片段通过同源重组插入AM的外显子或启动子部分，靶向 载体需要包含与其它DNA片段中5'的上游和3'的下游的各目标位点（5'臂和3'臂）同 源的序列。
[0103] 尽管插入的其它DNA片段没有特别限制，但可通过使用药物抗性基因或报道基因 选择在其染色体中整合具有药物抗性或报道基因活性作为指标的靶向载体的ES细胞。在 这里，药物抗性基因的实例和报道基因的实例包括，但不限于，分别新霉素磷酸转移酶II (nptll)基因、潮霉素磷酸转移酶（HPT)基因等，和β-半乳糖苷酶（IacZ)基因、氯霉素乙 酰转移酶（cat)基因等。
[0104] 药物抗性或报道基因优选在任意选择的能够在哺乳动物细胞中发挥功能的启动 子的控制下。例如，可以提到病毒启动子，诸如SV40早期启动子、巨细胞病毒（CMV)长末端 重复（LTR)、劳斯肉瘤病毒（RSV)LTR、小鼠白血病病毒（MoMuLV) LTR、和腺病毒（AdV)衍生 的早期启动子、和用于哺乳动物组成型蛋白基因的启动子，诸如肌动蛋白基因启动子、 PGK基因启动子和转铁蛋白基因启动子等。然而，如果将药物抗性或报道基因插入AIM中， 从而使得其被置于AIM的内源启动子的控制之下，则控制该基因的转录的启动子不需要存 在于革G向载体中。
[0105] 靶向载体优选具有终止从药物抗性或报道基因下游的基因（多腺苷酸化（polyA) 信号，也称为终止子）转录mRNA的序列；例如，可以使用源自病毒基因或源自各种哺乳动物 或鸟类基因的终止子序列。优选地，使用SV40终止子等。
[0106] 通常，哺乳动物中的基因重组主要非同源地发生；引入的DNA被随机地插入染色 体上任意选择的位置。因此，不可能通过基于检测药物抗性或报道基因等的表达的选择 (阳性选择）有效地只选择靶向至由同源重组靶向的内源AM的那些克隆；有必要对于所 有选择的克隆通过DNA杂交或PCR证实整合位点。因此，如果，例如，赋予丙氧鸟苷敏感性 的单纯疱瘆病毒衍生的胸苷激酶（HSV-tk)基因接合在与靶向载体的目标序列同源的区域 之外，则具有随机插入其中的载体的细胞不能在包含丙氧鸟苷的培养基上生长，因为它们 具有HSV-tk基因，而通过同源重组靶向至内源AM基因座的细胞变得对丙氧鸟苷耐受，并 得到选择，因为它们不具有HSV-tk基因（阴性选择）。或者，如果将白喉毒素基因，例如，接 合以替代HSV-tk基因，则具有随机插入其中的载体的细胞由于本身产生的毒素而死亡，从 而使得也可以在药物不存在的情况下选择同源重组体。
[0107] 尽管磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、脂质体转染法、逆转录病毒感染法、凝集法、显微 注射法、基因枪（粒子枪）法、DEAE-葡聚糖法等中的任一种都可用于靶向载体引入ES细 胞，但因为易于处理大量细胞等而通常选择电穿孔法，因为哺乳动物中的基因重组主要非 同源地发生，从而使得如上所述获得同源重组体的频率低。对于电穿孔，可以原样使用用于 转染到动物细胞中的普通条件；例如，电穿孔可以这样进行：通过在对数生长期胰蛋白酶 消化ES细胞以便将它们分散为单细胞，将细胞悬浮在培养基中以获得IO 6至10 8个细胞/ ml的密度，将细胞转移至小杯中，添加10至100 μ g的靶向载体，并施加200至600 V/cm 的电脉冲。
[0108] 其中整合靶向载体的ES细胞可以通过由DNA杂交或PCR筛选从通过在饲养细胞 上培养单细胞获得的集落分离和提取的染色体DNA进行确定；如果药物抗性基因或报道基 因被用作其它DNA片段，则可能在细胞阶段用其表达作为指标来选择转化体。例如，如果使 用包含nptll基因作为用于阳性选择的标记基因的载体，将转染处理后的ES细胞在包含新 霉素系列抗生素诸如G418的培养基中培养，并且选择所得抗性集落作为转化体的候选者。 如果使用包含HSV-tk基因作为用于阴性选择的标记基因的载体，将ES细胞在包含丙氧鸟 苷的培养基中培养，并且选择所得抗性集落作为同源重组体的候选者。将获得的集落转移 至各自培养板，并重复胰蛋白酶消化和培养基交换，其后保留部分用于培养，并且使剩余部 分进行PCR或DNA杂交来证实引入的DNA的存在。
[0109] 当将证实其中整合有引入的DNA的ES细胞返回至源自相同物种的非人哺乳动物 来源的胚胎时，ES细胞整合到宿主胚胎的ICM中，以形成嵌合胚胎。将其移植至受体母体 (雌性胚胎受体）中，并允许继续发育，从而获得嵌合的KO动物。如果ES细胞有助于在嵌 合动物中形成将分化为卵子或精子的原生殖细胞，则将获得种系嵌合体；通过将其交配，可 以制备其中遗传维持AIM的表达缺陷的KO动物。
[0110] 为了制备嵌合胚胎，存在其中将最多至桑椹胚期的早期胚胎粘附并聚集在一起的 方法（聚集嵌合体方法），和其中将细胞显微注射至胚泡的胚泡腔的方法（注射嵌合体方 法）。尽管在使用ES细胞制备嵌合胚胎中已传统上广泛实施后者，但作为不需要显微操作 器且可以容易操作的方法，近来已实施其中通过将ES细胞注射至8细胞期胚胎的透明带中 而生成聚集嵌合体的方法，和其中通过将ES细胞团和去除透明带的8细胞期胚胎共培养并 聚集而生成聚集嵌合体的方法。
[0111] 在所有情况下，宿主胚胎可以收集自如下以相同方式提到的可以用作转染至受精 卵中的用于卵收集的雌性的非人哺乳动物；例如，在小鼠的情况下，为了使得可能通过毛色 确定ES细胞对形成嵌合体小鼠的百分比贡献，优选的是，宿主胚胎收集自显示与ES细胞 来源的品系的毛色不同的毛色的品系的小鼠。例如，在源自129小鼠品系（毛色：深浅环 纹（agouti))的ES细胞的情况下，C57BL/6小鼠（毛色：黑色）或ICR小鼠（毛色：白化） 用作用于收集卵的雌性；在源自C57BL/6或DBF 1小鼠（毛色：黑色）或源自TT2细胞（源 自C57BL/6和CBA的F1 (毛色：深浅环纹））的ES细胞的情况下，ICR小鼠或BALB/c小鼠 (毛色：白化）可用作用于收集卵的雌性。
[0112] 因为种系嵌合体形成能力主要取决于ES细胞和宿主胚胎的组合，所以更优选选 择显示高种系嵌合体形成能力的组合。例如，在小鼠的情况下，优选使用源自C57BL/6品系 的宿主胚胎等用于源自129品系的ES细胞，并使用源自BALB/c品系的宿主胚胎等用于源 自C57BL/6品系的ES细胞。
[0113] 优选的是，用于卵收集的雌性小鼠为约4至约6周龄，并且用于交配的雄性小鼠是 约2至约8个月龄的相同品系。尽管交配可以通过自然交配，但其优选在施用促性腺激素 (促卵泡激素，然后促黄体激素）以诱导过度排卵后进行。
[0114] 在胚泡注射方法的情况下，胚泡胚胎（例如，在小鼠的情况下，在交配后约3. 5天） 收集自用于卵收集的雌性的子宫（或桑椹胚期中或收集自输卵管之前、之后的早期胚胎， 可以在用于胚胎培养的培养基（下述）中培养，直至胚泡期），且将具有引入其中的靶向载 体的ES细胞（约10至约15个细胞）用显微操作器注射入胚泡的胚泡腔，其后将胚胎移植 到假孕胚胎受体雌性非人哺乳动物的子宫中。作为胚胎受体雌性非人哺乳动物，可以以相 同的方式使用可用作转染到受精卵中的胚胎受体雌性的非人哺乳动物。
[0115] 在共培养方法的情况下，8-细胞期胚胎和桑椹胚（例如，在小鼠的情况下，在交配 后约2. 5天）收集自用于卵收集的雌性的输卵管和子宫（或8细胞期中或收集自输卵管之 前、之后的早期胚胎，可以在用于胚胎培养的培养基（下述）中培养，直至8-细胞期或桑椹 胚期），且将透明带溶解在酸性台氏溶液中，其后，将整合有靶向载体的ES细胞团（细胞数： 约10至约15个细胞）置于用矿物油覆盖的用于胚胎培养的介质的微滴中，将上述8-细胞 期胚胎或桑椹胚（优选2个胚胎）进一步放置，并且将它们共同培养过夜。将获得的桑椹 胚或胚泡移植到如上所述的胚胎受体雌性非人哺乳动物的子宫。
[0116] 如果移植的胚胎成功植入且胚胎受体雌性受孕，则嵌合非人哺乳动物幼崽将通过 自然分娩或剖腹产获得。允许已经自然分娩的胚胎受体雌性继续哺乳；如果幼崽通过剖 腹产分娩，则幼崽可以由分别提供的用于哺乳的雌性（通常交配和分娩的雌性非人哺乳动 物）进行哺乳。
[0117] 对于种系嵌合体的选择，如果已经确定ES细胞的性别，则首先选择与ES细胞性别 相同的嵌合体小鼠（通常，选择雄性嵌合体小鼠，因为使用雄性ES细胞），然后基于表型诸 如毛色选择显示高ES细胞贡献率（例如，50%或更高）的嵌合体小鼠被。例如，从D3细胞 (其是源自129小鼠品系的雄性ES细胞）和源自C57BL/6小鼠的宿主胚胎之间的嵌合体胚 胎获得嵌合体小鼠的情况下，优选的是，选择显示高百分比的深浅环纹毛色的雄性小鼠。选 择的嵌合体非人哺乳动物是否是种系嵌合体可以基于通过与相同动物物种的适当品系杂 交获得的F 1动物的表型来确定。例如，在上述嵌合体小鼠的情况下，深浅环纹相对于黑色 是显性的；因此，当雄性小鼠与雌性C57BL/6小鼠杂交时，如果选择的雄性小鼠是种系嵌合 体，则获得的匕的毛色是深浅环纹的。
[0118] 通常获得因此获得的整合有靶向载体的种系嵌合体非人哺乳动物（创建者）作为 AIM仅在同源染色体中任一者中敲除的杂合子。为了获得AIM在两条同源染色体中都敲除 的纯合子，在如上所述获得的F1动物中，可以杂交杂合子的同胞动物。杂合子的选择可以通 过，例如，通过DNA杂交或PCR筛选从F 1动物的尾部分离和提取的染色体DNA来确定。获 得的F2动物的1/4将是纯合子。
[0119] 在使用病毒作为靶向载体的另一个优选实施方案中，可以提到以下方法，所述方 法包括用含有包含在5'和3'臂之间插入的用于阳性选择的标记基因和所述臂外的用于阴 性选择的标记基因的DNA的病毒感染非人哺乳动物的ES细胞（参见，例如，Proceedings of the National Academy of Sciences, USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), vol. 99, No. 4，pp. 2140-2145，2002)。例如，当使用逆转录病毒或慢病毒时，将细胞接种到适当的 培养器诸如培养皿中，将病毒载体添加至培养液（如果需要，聚凝胺可以共存在），将细胞 培养1至2天，其后，如上所述继续培养，并选择其中整合载体的细胞。
[0120] 关于用于敲低AM的具体方法，可以提到以下方法，所述方法包括使用本身已知 的制备转基因动物的技术引入编码AM的反义RNA或siRNA (包括shRNA)的DNA，并允许其 在主体非人哺乳动物细胞等中。
[0121] 包含与期望多核苷酸的目标区域互补的碱基序列的DNA，即与期望多核苷酸可杂 交的DNA可以被称为针对期望多核苷酸是"反义"的。
[0122] 具有与编码AM或其部分的多核苷酸的碱基序列互补或实质上互补的碱基序列 的反义DNA可以是任何反义DNA，只要它包含与编码AM或其部分的多核苷酸的碱基序列互 补或实质上互补且具有抑制多核苷酸表达的作用的碱基序列。
[0123] 与编码AM的多核苷酸实质上互补的碱基序列是，例如，与重叠区域的多核苷酸 的互补链的碱基序列具有约70%或更高，优选约80%或更高，更优选约90%或更高，最优 选约95%或更高的同源性的碱基序列。本文中的碱基序列同源性可以，例如，在以下条件 (期望值=10 ;允许缺口；过滤=ON ;匹配得分=1 ;错配得分=-3)下使用同源性计算算法 NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)来计算。
[0124] 具体地，在编码AIM的多核苷酸的互补链的完整碱基序列中，（a)在意在抑制翻译 的反义DNA的情况下，与编码AIM的N末端部分的部分的碱基序列（例如，在起始密码子 附近的碱基序列等）的互补链具有约70%或更高，优选约80%或更高，更优选约90%或更 高，最优选约95%或更高的同源性的反义DNA是合适的，和（b)在意在用RNaseH降解RNA 的反义DNA的情况下，与编码AM的包括内含子的多核苷酸的完整碱基序列的互补链具有 约70%或更高，优选约80%或更高，更优选约90%或更高，最优选约95%或更高的同源性 的反义DNA是合适的。
[0125] 具体地，当主体非人哺乳动物是小鼠时，可以提到包含与以GenBank登录号： AF011428注册的碱基序列或其部分互补或实质上互补的碱基序列的反义DNA，优选地，包 含与所述碱基序列或其部分互补的碱基序列的反义DNA等。
[0126] 可以基于编码克隆的或测定的AIM的DNA的碱基序列信息设计并合成具有与编码 AIM或其部分的多核苷酸的碱基序列互补或实质上互补的碱基序列的反义DNA(下文也称 为"本发明的反义DNA")。此类反义DNA能够抑制AM的复制和表达。具体地，本发明的反 义DNA能够与从AM转录的RNA (mRNA或初始转录产物）杂交，并且能够抑制mRNA的合成 (加工）或功能（翻译成蛋白）。
[0127] 本发明的反义DNA的目标区域关于其长度没有特别限制，只要翻译成AIM由于反 义DNA的杂交而受到抑制；目标区域可以是编码蛋白的mRNA的整个序列或部分序列，且长 度最短为约10个碱基，并且最长为mRNA或初始转录产物的整个序列。具体地，可以选择 AM的5'末端发夹环、5'末端6碱基对重复、5'末端非翻译区、翻译起始密码子、蛋白编码 区、ORF翻译终止密码子、3'末端非翻译区、3'末端回文区、或3'末端发夹环作为反义DNA 的优选目标区域，但也可以选择AIM基因的任何其它区域作为目标。例如，该基因的内含子 部分也可以是目标区域。
[0128] 此外，本发明的反义DNA可以是以下反义DNA，所述反义DNA不仅与AM的mRNA或 初始转录产物杂交以抑制翻译成蛋白，而且能够结合至作为双链DNA的AM以形成三重链 (三链体（triplex))，从而抑制转录为RNA。或者，本发明的反义DNA可以是形成的DNA: RNA 杂合体以诱导被RNaseH降解的反义DNA。
[0129] 编码能够特异性切割编码AIM的mRNA或编码区域内的初始转录产物（在初始转 录产物的情况下，包括内含子部分）的核酶的DNA也可以涵盖在本发明的反义DNA中。最 通用核酶之一是感染性RNA诸如类病毒和拟病毒中发现的自我剪接RNA，并且锤头型、发夹 型等是已知的。锤头型表现出酶活性，具有长度约40个碱基，并且可能通过使侧接锤头结 构部分的两端的几个碱基（总共约10个碱基）变为与mRNA的期望切割位点互补的序列而 特异性切割目标mRNA。因为这种类型的核酶仅以RNA作为底物，所以它提供了不攻击基因 组DNA的额外优点。如果AM mRNA本身假定双链结构，则可以通过使用通过接合可以特异 性结合RNA解旋酶的源自病毒核酸的RNA基序而制备的杂合核酶而使得目标序列成为单链 的[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10):5572-5577 (2001)]。此外，核酶可以是通过 进一步接合从促进转录产物易位到细胞质的tRNA修饰的序列而制备的杂合核酶[Nucleic Acids Res·，29(13):2780-2788 (2001)]。
[0130] 在本文中，由与AIM的mRNA或初始转录产物的编码区中的部分序列（在初始转 录产物的情况下，包括内含子部分）同源的寡-RNA (oligo-RNA)和与之互补的链（即 所谓的单链干扰RNA(siRNA))组成的双链RNA也可用于制备本发明的KD动物。已知所 谓的RNA干扰（RNAi)(这是当siRNA被引入细胞中，与所述RNA同源的mRNA被降解的 现象）发生在线虫、昆虫、植物等中；因为这种现象被证实也发生在动物细胞中[Nature, 411 (6836) :494-498 (2001)]，所以siRNA已被广泛地用作核酶的替代技术。siRNA可以使 用商购软件（例如RNAi Designer; Invitrogen)基于作为目标的mRNA的碱基序列信息来 适当地设计。
[0131] 本发明的反义寡-DNA和核酶可以通过基于AM的cDNA序列或基因组DNA序 列来确定mRNA或初始转录产物的目标序列，并使用商购的DNA/RNA合成仪（Applied Biosystems, Beckman等）合成与其互补的序列来制备。通过经由根据需要使用的适当接 头（衔接分子）序列将合成的反义寡-DNA或核酶插入在表达载体中启动子的下游，可以制 备编码反义寡-RNA或核酶的DNA表达载体。在这里可以优选使用的表达载体的实例包括 用大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或酵母，菌体诸如λ 菌体，逆转录 病毒诸如莫洛尼白血病病毒，动物或昆虫病毒诸如慢病毒、腺伴随病毒、牛痘病毒和杆状病 毒等扩增的质粒。尤其而言，质粒（优选来自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或酵母的质粒，特别 是来自大肠杆菌的质粒）和动物病毒（优选逆转录病毒、慢病毒）是优选的。启动子的实 例包括病毒启动子，诸如SV40早期启动子、巨细胞病毒（CMV)长末端重复（LTR)、劳斯肉瘤 病毒（RSV)LTR、小鼠白血病病毒（MoMuLV) LTR、和腺病毒（AdV)衍生的早期启动子、和用于 哺乳动物组成型蛋白基因的启动子，诸如肌动蛋白基因启动子、PGK基因启动子和转铁 蛋白基因启动子等。
[0132] 编码较长反义RNA (例如，AM mRNA的全长互补链等）的DNA表达载体可以通过经 由根据需要使用的适当接头（衔接分子）序列以相反方向将通过常规方法克隆的AIM cDNA 插入在表达载体中启动子的下游来制备。
[0133] 同时，编码siRNA的DNA可以通过分别合成编码有义链的DNA和编码反义链的 DNA，并将它们插入适当的表达载体中来制备。作为siRNA表达载体，可以使用具有Pol III 系统启动子诸如U6或Hl的siRNA表达载体。在这种情况下，在整合有载体的动物细胞中， 将有义链和反义链转录并退火以形成siRNA。shRNA可以通过将包含通过长度碱基（所述 长度碱基允许形成适当的环结构（例如，约15至25个碱基））分隔的有义链和反义链的单 元插入适当表达载体中来制备。作为shRNA表达载体，可以使用具有Pol III系统启动子 诸如U6或Hl的shRNA表达载体。在这种情况下，在整合有表达载体的动物细胞中转录的 shRNA本身形成环，然后由内源酶Dicer酶等处理，以形成成熟的siRNA。或者，也可能通过 使用Pol II系统启动子表达包含作为目标的siRNA序列的微小RNA(miRNA)而实现通过 RNAi的敲低。在这种情况下，通过显示组织特异性表达的启动子，组织特异性敲低也是可能 的。
[0134] 为了将包含编码AM的反义RNA、siRNA、shRNA或miRNA的DNA的表达载体引入细 胞，根据目标细胞适当地使用本身已知的方法。例如，为了引入早期胚胎诸如受精卵，使用 显微注射法。为了引入ES细胞，可以使用磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、脂质体转染法、逆转 录病毒感染法、凝集法、显微注射法、粒子枪方法、DEAE-葡聚糖法等。或者，当逆转录病毒、 慢病毒等被用作载体时，有时可能通过将病毒添加至早期胚胎或ES细胞，并培养胚胎或细 胞1至2天以便用病毒感染细胞而便利地实现转染。从ES细胞（建立创建者）再生个体、 传代（制备纯合子）等可以如上关于本发明的KO动物所述来进行。
[0135] 在一个优选的实施方案中，通过显微注射将包含编码AM的反义RNA、siRNA、 shRNA、或miRNA的DNA的表达载体引入作为主体的非人哺乳动物的早期胚胎（受精卵）。
[0136] DNA显微注射至受精卵中可以通过常规方法使用通常已知的装置诸如显微操作器 来进行。简而言之，使用固定移液器将置于用于胚胎培养的培养基的微滴中的受精卵抽吸 并固定，并且使用注射移液器将DNA溶液直接注射至雄性或雌性原核，优选为雄性原核。引 入的DNA优选在使用CsCl密度梯度超速离心或者阴离子交换树脂柱等高度纯化后使用。还 优选的是，将引入的DNA通过使用限制性内切酶切割载体部分预先进行线性化。
[0137] 引入DNA后，将受精卵通过微滴培养法等在5%气态二氧化碳/ 95%大气中在用 于胚胎培养的培养基中培养，直至1细胞期至胚泡期，其后将其移植到使得假孕的用于接 受胚胎的雌性非人哺乳动物的输卵管或子宫。用于接受胚胎的雌性非人哺乳动物可以是任 一种与待移植的早期胚胎来源的动物相同的物种；例如，当移植小鼠早期胚胎时，优选使用 雌性ICR小鼠（优选约8至约10周龄）等。使得用于接受胚胎的雌性非人哺乳动物假孕 的已知方法是，例如，包括将雌性与切除输精管（结扎输精管）的相同物种的雄性非人哺乳 动物（例如，在小鼠的情况下，用雄性ICR小鼠（优选约2个月或更大龄））交配，并选择证 实具有阴道塞的雌性的方法。
[0138] 使用的用于胚胎培养的雌性可以是已经自发排卵的雌性，或者在与切除输精 管（结扎输精管）的雄性交配之前接受施用的促黄体激素释放激素（通常简称为LHRH) 或其类似物以诱导生育力的雌性。LHRH类似物的实例包括[3, 5-Di I-Tyr5] -LH-RH、
[01118]-1^-冊、〇)-六136]-1^-冊、[(168-6171。]-1^-冊、〇)-把8(821) 6]-1^-冊和其乙基酰胺类 (Ethylamides)等。施用的LHRH或其类似物的量和施用后与雄性非人哺乳动物的交配的 时间根据非人哺乳动物的种类而变化。例如，当非人哺乳动物是小鼠（优选ICR小鼠等） 时，通常优选的是，在施用LHRH或其类似物之后约4天将雌性小鼠与雄性小鼠交配；施用的 LHRH或其类似物的量通常为约10至60 μ g/个体，优选约40 μ g/个体。
[0139] 通常，如果待移植的早期胚胎是在桑椹胚期或之后，则将胚胎移植到用于接受胚 胎的雌性的子宫；如果早期胚胎是在桑椹胚期之前的阶段（例如，1-细胞期至8细胞期胚 胎），则将胚胎移植到输卵管。根据待移植的胚胎的发育阶段，在变得假孕之后给定天数过 去之后，适当地使用用于接受胚胎的雌性。例如，在小鼠的情况下，变得假孕之后约0. 5天 的雌性小鼠优选用于移植2-细胞期胚胎，并且变得假孕之后约2. 5天的雌性小鼠优选用于 移植胚泡胚胎。将用于接受胚胎的雌性麻醉（优选地，使用阿佛丁、耐波他等）后，进行切 开，拉出卵巢，并且使用用于胚胎移植的移液器将在用于胚胎培养的培养基中悬浮的早期 胚胎（约5至约10个胚胎）注射入输卵管的腹腔口（abdominal osteum)的附近或子宫角 的输卵管接合部。
[0140] 当移植的胚胎成功植入且胚胎受体雌性受孕时，非人哺乳动物幼崽将通过自然分 娩或剖腹产获得。允许已经自然分娩的胚胎受体雌性继续哺乳；当幼崽通过剖腹产分娩时， 幼崽可以由分别提供的用于哺乳的雌性进行哺乳（例如，在小鼠的情况下，具有通常交配 和分娩的雌性小鼠（优选为雌性ICR小鼠等））。
[0141] 确保在受精卵细胞阶段转移编码AM的反义RNA、siRNA、shRNA或miRNA的DNA， 从而使得引入的DNA将存在于主体非人哺乳动物的所有种系细胞和体细胞中。引入的DNA 是否被整合在染色体DNA中可以通过，例如，通过DNA杂交或PCR筛选从幼崽的尾部分离和 提取的染色体DNA进行确定。如上所述获得的后代非人哺乳动物（F tl)的种系细胞中表达载 体的存在意指该表达载体存在于随后世代（F1)中所有动物的所有生殖系细胞和体细胞中。
[0142] 通常，Ftl动物作为在任一同源染色体中具有引入的DNA的杂合子获得。不同F tl个 体具有在不同的染色体上随机插入的引入的DNA，除非插入是通过同源重组。为了获得在两 条同源染色体中都具有表达载体的纯合子，将F tl动物与非转基因动物杂交以制备F i动物， 并且可以杂交在任一同源染色体中具有引入的DNA的其杂合的同胞动物。如果引入的DNA 只在一个基因座上整合，则1/4获得的F2动物将是纯合的。
[0143] 在使用病毒作为载体的另一个优选的实施方案中，与KO动物的上述情况的一样， 可以提到包括用包含编码AM的反义RNA、siRNA、shRNA或miRNA的DNA的病毒感染非人哺 乳动物的早期胚胎或ES细胞的方法。当受精卵被用作细胞时，优选的是，在感染前去除透 明带。病毒载体感染后培养1至2天后，在早期胚胎的情况下，将受精卵移植到如上所述使 得假孕的用于接受胚胎的雌性非人哺乳动物的输卵管或子宫，或者在ES细胞的情况下，受 精卵继续在添加如上所述的选择药物的情况下进行培养，并且选择整合有载体的细胞。
[0144] 此外，如 Proceedings of the National Academy of Sciences, USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), vol. 98，pp. 13090-13095，2001 中所述，从雄性非人哺乳动物收 集的精原细胞在与STO饲养细胞共培养的过程中用病毒载体感染，其后将精原细胞注入雄 性不育的非人哺乳动物的输精管，并且将雄性不育的非人哺乳动物与雌性非人哺乳动物交 配，由此可以有效获得对于编码AIM的反义RNA、siRNA、shRNA或miRNA的DNA是杂合-Tg (+/-)的幼崽。
[0145] 描述于 Miyazaki Τ·等人（J. Exp. Med.，189，413-422，1999)或通过上述方 法获得的本发明的AIM基因表达缺陷的非人哺乳动物在高脂肪膳食饲喂条件下具有以下 特征： (1) 肝重量增加， (2) 脂肪肝得到促进， (3) 脂肪肝得到发生，和/或 (4) 肝脏中炎症应答受到抑制。
[0146] 此外，像野生型动物一样，本发明的AM表达缺陷的非人哺乳动物在高脂肪膳食 饲喂条件下特征性地显示了促进的肝纤维化。这些表型至少在常规公众已知的AM KO小 鼠中还没有报道。具体地，从脂肪肝变为肝纤维化再变为肝癌类似于NASH的病理学，这是 新发现。
[0147] (1)肝重量增加意指，通过用高脂肪膳食饲喂，与野生型动物相比，本发明的AM 表达缺陷的非人哺乳动物中肝重量和/或肝重量/体重（％)变得显著不同。在下述实施 例中，与野生型小鼠相比，从高脂肪膳食饲喂的第6周起在AIM敲除小鼠中发现显著差异。
[0148] (2)脂肪肝得到促进意指，通过用高脂肪膳食饲喂，与野生型动物相比，本发明的 AIM表达缺陷的非人哺乳动物的肝脏中在早期阶段观察到脂肪积累。脂肪在肝脏中的积累 也可以通过，例如，用油红0染色肝组织切片来证实。或者，它也可以通过测量肝组织中的 中性脂肪的量来证实。在下述实施例中，与野生型小鼠相比，从高脂肪膳食饲喂的第6周起 在AM敲除小鼠中发现显著差异。
[0149] (3)肝癌得到发生意指，通过用高脂肪膳食饲喂，在本发明的AIM表达缺陷的非 人哺乳动物中观察到肝癌的发病。肝癌可以，例如，通过用抗AFP(a -甲胎蛋白）染色肝组 织切片，测定肝组织中的AFP表达水平，或测量血液AFP浓度进行证实。在下述实施例中， 甚至从高脂肪膳食饲喂起一年后也几乎无法在野生型小鼠中证实肝癌，但从高脂肪膳食饲 喂起一年在所有AIM敲除小鼠中都发现肝癌。
[0150] (4)肝脏中炎症应答受到抑制意指，与野生型动物相比，本发明的AM表达缺陷 的非人哺乳动物中炎症应答受到抑制，甚至当它们用高脂肪膳食饲喂时。炎症应答可以通 过例如，F4/80 (巨噬细胞标记物）、TNF a、IL-6或IL-I β的表达来证实。在下述实施例 中，与野生型小鼠相比，从高脂肪膳食饲喂的第12周起在AIM敲除小鼠中肝脏中的炎症受 到显著抑制。
[0151] 肝纤维化得到促进意指，像野生型动物一样，通过用高脂肪膳食饲喂，在本发明的 AM表达缺陷的非人哺乳动物中观察到肝纤维化。肝纤维化可以通过，例如，用天狼星红染 色肝组织切片来证实。尽管已知由于肝星状细胞的胶原合成参与肝纤维化，但它也可以通 过a SMA(其是肝星状细胞的标记物）的表达来证实。它也可以通过肝脏中TGFM、胶原 4Α1的表达来证实。在下述实施例中，从高脂肪膳食饲喂的第20周起在野生型小鼠和AM 敲除小鼠中观察到肝纤维化。此外，从高脂肪膳食饲喂的第20周起在野生型小鼠和AIM敲 除小鼠中观察到a SMA的高表达。TGFM趋向于显示与高脂肪膳食饲喂时期的长度成比 例的表达水平的增加。然而，在野生型小鼠和AIM敲除小鼠之间没有观察到纤维化水平和 a SMA和TGF β 1的表达水平的显著差异。
[0152] 这些发现表明，置于高脂肪膳食饲喂条件下的AIM表达缺陷的非人哺乳动物可用 作肝脏疾病的动物模型，并且可以进一步用于筛选肝脏疾病的预防药物或治疗药物。具体 地，本发明的筛选方法包括以下步骤： (1) 在高脂肪膳食饲喂条件下向AIM表达缺陷的非人哺乳动物施用测试物质的步骤， (2) 观察用测试物质施用的AIM表达缺陷的非人哺乳动物的以下特性的任何一项或 多项的步骤： (i) 肝重量， (ii) 肝脂肪量， (iii) 肝纤维， (iv) 肝癌，和 (V)肝脏中的炎症应答，和 (3) 通过与未施用所述测试物质比较来选择改善上述特性的测试物质的步骤。
[0153] 用于本发明的筛选方法中饲喂AIM表达缺陷的非人哺乳动物的高脂肪膳食没有 特别限制，只要脂质含量高。它通常具有不小于20 %，优选不小于30 %，更优选不小于40 % 的脂质含量。用高脂肪膳食饲喂AM表达缺陷的非人哺乳动物的时期是至少直到可以证实 上述特性。饲喂时期不小于6周，更优选不小于12周，进一步优选不小于20周。
[0154] 作为待施用于AIM表达缺陷的非人哺乳动物的测试物质，可以使用蛋白、肽、抗 体、非肽化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取物、植物提取物、动物组织提取物、血浆 等。施用测试物质的时机可以是高脂肪膳食饲喂的开始前或与其开始同时，或者在AIM表 达缺陷的非人哺乳动物的高脂肪膳食饲喂后观察上述特性之后。施用方法可以是口服或胃 肠外的。对于口服施用，其也可以通过与饲料或饮用水混合来施用。作为肠胃外施用，可以 提到腹膜内施用，通过静脉内注射、皮下注射、皮内注射、肌内注射、滴注等施用，栓剂的直 肠施用等。施用可以包括单次施用或多次施用。
[0155] 用测试物质施用的AIM表达缺陷的非人哺乳动物的特性在施用测试物质后，通常 约4周或更晚，优选6周或更晚进行观察。至于肝重量，它可以通过测量从上述哺乳动物 分离的肝脏的重量和/或肝重量/体重（％)来观察。至于肝脏脂肪，它可以通过用油红 O染色上述分离的肝脏的肝组织切片，并且将其染色水平转化为数值，或者测量肝组织中中 性脂肪的量来观察。至于肝脏纤维，它可以通过用天狼星红染色上述分离的肝脏的肝组织 切片，并且将其染色水平转化为数值来观察。或者，至于肝脏纤维，它也可以通过将上述分 离的肝脏中的a SMA( α -平滑肌肌动蛋白）、TGFf3 1或者胶原4A1的表达水平转化为数值 来证实。至于肝癌，它可以通过用抗AFP(a-甲胎蛋白）染色上述分离的肝脏的肝组织切 片，并且将其染色水平转化为数值，或者将上述分离的肝脏中AFP的表达水平转化为数值， 或者测量血液AFP浓度来观察。至于肝脏中的炎症应答，它可以通过将上述分离的肝脏中 F4/80、TNFa、IL-6或IL-Ιβ的表达水平转化为数值来证实。
[0156] 将如上所述获得的上述特性的观察结果与在测试物质的未施用的情况下的结果 进行比较。或者，预先绘制肝脏疾病的存在与否和上述特性的相关性图，并且可以将获得的 上述特性的观察结果与相关性图进行比较。优选基于显著差异的存在与否进行比较。
[0157] 当获得的上述特性的观察结果相比于测试物质的未施用得到改善时，可以选择测 试物质作为用于肝脏疾病的预防或治疗的药剂。在这里，得到改善意指（i)肝重量低于测 试物质的未施用，（ii )肝脏脂肪量（油红O染色的水平，或中性脂肪的量）低于测试物质 的未施用，（iii)肝纤维化的水平（天狼星红染色的水平，a SMA、TGFf3 1、胶原4A1的表达） 低于测试物质的未施用，（iv )AFP表达低于测试物质的未施用，（V ) F4/80、TNFa、IL-6、 IL-I β的表达高于测试物质的未施用。
[0158] 当上述中选择的测试物质被用作用于预防或治疗肝脏疾病的药剂时，它可以以与 本发明的AIMs相同的方式进行配制，并且通过类似的施用途径并以类似的剂量进行施用。 待作为预防剂或治疗剂的目标的肝脏疾病可以类似于上述那些。
[0159] 此外，由于高脂肪膳食饲喂条件下的AIM表达缺陷的非人哺乳动物可用作肝脏疾 病的动物模型，所以所述哺乳动物可以用于肝脏疾病的预防药物或治疗药物的评估方法。 因此，本发明还提供了评估用于肝脏疾病的预防剂或治疗剂的预防或治疗效果的方法，其 包括使用通过用高脂肪膳食饲喂AIM表达缺陷的非人哺乳动物而获得的动物。具体地，本 发明的评估方法包括以下步骤： (1) 在高脂肪膳食饲喂条件下向AIM表达缺陷的非人哺乳动物施用用于肝脏疾病的 预防剂或治疗剂的步骤， (2) 观察用用于肝脏疾病的预防剂或治疗剂施用的AIM表达缺陷的非人哺乳动物的 以下特性的任何一项或多项的步骤： (i) 肝重量， (ii) 肝脂肪量， (iii) 肝纤维， (iv) 肝癌， (V)肝脏中的炎症应答， (3) 通过将上述特性与未施用用于肝脏疾病的预防剂或治疗剂的特性比较而评估用 于肝脏疾病的预防剂或治疗剂的效果的步骤。
[0160] 本发明的评价方法中待施用于AIM表达缺陷的非人哺乳动物的用于肝脏疾病的 预防剂或治疗剂可以是已知的用于肝脏疾病的预防剂或治疗剂。其实例包括，但不限于， 胰岛素增敏剂（例如，噻唑烷衍生物类，诸如罗格列酮、吡格列酮等等，双胍类，诸如二甲双 胍、丁双胍等）；抗氧化剂类（例如，维生素 E、维生素 C、甜菜碱、EPL(多烯磷脂酰胆碱） 等）；护肝剂（例如熊去氧胆酸（UDCA)等）；抗高血脂症剂（例如，贝特类药物、普罗布考、 他汀类药物等）；降压剂（例如，血管紧张素 II受体拮抗剂等）；甘草素制剂；中国草药（例 如，小柴胡汤等）；抗癌剂等。用于肝脏疾病的预防剂或治疗剂的施用时期、 施用方法、施用频率等可以与上述筛选方法中的那些相同。
[0161] 待通过本发明的评价方法观察的特性的观察方法可以根据上述筛选方法的描述 来进行。当通过评价方法获得的上述特性的观察结果比未施用用于肝脏疾病的预防剂或治 疗剂改善更大程度时，测试物质可以被评价为作为用于预防或治疗肝脏疾病的药剂具有较 高的预防或治疗效果。如本文中所使用，得到改善意指与上述相同。
[0162] 在本发明的下述实施例中，NASH患者的血清AM浓度被证实为比非NASH患者更 低。具体地，进展至肝癌的NASH患者的血清AM浓度被证实为仍然低于没有进展至肝癌的 NASH患者的血清AM浓度。从上述可见，表明肝脏疾病可以通过测量试验主体的血液AM 浓度来诊断。具体地，本发明的诊断方法包括以下步骤： (1) 测量试验主体的样品的AIM浓度的步骤； (2) 将所述试验主体的样品的上述AIM浓度与健康人的样品的AIM浓度比较的步骤； (3) 当所述试验主体的样品的上述AIM浓度低于所述健康人的样品的AIM浓度时，判 断所述试验主体具有肝脏疾病或具有发生肝脏疾病的高可能性的步骤。
[0163] 尽管本发明的诊断方法可适用的试验主体没有特别限制，但例如，可以提到具有 发生肝脏疾病的风险或怀疑已经发生肝脏疾病的试验主体。尽管此类试验主体没有限制， 但例如，可以提到具有肥胖、糖尿病、高血压、动脉硬化、高血脂等的症状的试验主体。作为 健康人，可以提到还没有被临床诊断为具有肝脏疾病的那些，例如，没有上述症状的人。
[0164] 待用于本发明诊断方法的样品没有特别限制，只要它收集自上述试验主体，并且 包含待作为测量目标的AIM基因产物（例如，RNA、蛋白、其裂解产物等）。其实例包括体液， 诸如血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、汗液、唾液、滑液等或其级分，和其中含有的细胞，特别 是巨噬细胞等。
[0165] 从试验主体收集的样品的AM浓度可以通过从巨噬细胞制备RNA (例如，总RNA， mRNA)级分，并测量级分中含有的AM基因的转录产物来测量。尽管RNA级分可以通过使 用已知方法，诸如胍-CsCl超速离心法、AGPC法等来制备，但可以通过使用商购的RNA提取 试剂盒（例如RNeasy Mini试剂盒；由QIAGEN等制造）从痕量巨噬细胞迅速且方便地制 备高纯总RNA。用于检测RNA级分中AM基因的转录产物的方法的实例包括使用杂交的方 法（RNA印迹、斑点印迹、DNA芯片分析等），使用PCR的方法（RT-PCR、竞争性PCR、实时PCR 等）等。定量PCR方法，诸如竞争性PCR、实时PCR等是优选的，因为AIM基因表达的变化可 以从痕量的巨噬细胞迅速、方便且高定量地检测。
[0166] 当采用RNA印迹或斑点印迹杂交时，AM基因的转录产物可以通过使用能够与基 因的转录产物杂交的核酸（探针）来测量。此类核酸的实例包括能够在高严格条件下与包 含AIM基因的转录广物显不的喊基序列（例如，SEQ ID NO: 1中显不的喊基序列）的核酸 杂交的核酸。高严格条件是上述条件等。
[0167] 待用作探针的核酸可以是双链或单链的。在双链核酸的情况下，它可以是双链 DNA、双链RNA、或DNA = RNA杂合体。在单链的情况下，可以使用反义链。尽管核酸的长度没 有特别限制，只要它可以与目标核酸特异性杂交，但例如，它不小于约15个碱基，优选不小 于约30个碱基。核酸优选用能够检测且定量目标核酸的标记来标记。作为标记试剂，例如， 使用放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质等。作为放射性同位素，例如，使用[ 32p]、[3h]、 [14C]等。作为上述酶，优选具有高比活性的稳定酶；例如，使用β-半乳糖苷酶、β-葡萄 糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶、苹果酸脱氢酶等。作为荧光物质，例如，使用荧光胺、异硫 氰酸荧光素等。作为发光物质，例如，使用鲁米诺、鲁米诺衍生物、萤光素、光泽精等。此外， 还可以使用生物素_(链霉）抗生物素蛋白用于结合探针和标记。
[0168] 当采用RNA杂交时，将上述制备的RNA级分通过凝胶电泳分离，转移至硝酸纤维 素、尼龙、聚偏二氟乙烯等的膜，在上述高严格条件下在包含如上述制备的标记探针的杂交 缓冲液中杂交，且通过合适的方法对于各条带测量与膜结合的标记的量，由此可以测量AM 基因的表达水平。此外，在斑点印迹的情况下，AM基因的表达水平可以通过使点有RNA级 分的膜以相同方式进行杂交反应并测量斑点的标记的量来测量。
[0169] 在另一个优选的实施方案中，定量PCR方法用作用于测量AIM浓度的方法。定量 PCR的实例包括竞争性PCR、实时PCR等。
[0170] 用作PCR中的引物的寡核苷酸组没有特别限制，只要它们可以各自与AIM基因的 转录产物的有义链（编码链）和反义链（非编码链）特异性杂交，并且可以扩增它们夹心 的DNA片段。例如，可以提到各自具有约15-约100个碱基、优选约15-约50个碱基的长度 且设计以扩增约100 bp - I kbp DNA片段的寡DNA组。更具体地，作为用作引物的寡核 苷酸组，可以提到能够在高严格条件下与包含与上述碱基序列互补的碱基序列的核酸（反 义链）杂交的核酸。如本文中所使用，高严格条件如上定义。
[0171] 在竞争性RT-PCR中，期望的DNA的量通过以下测定：允许已知量的可以由能够扩 增期望的DNA的引物组扩增的另一种模板核酸作为竞争物在反应液中共存，以引起竞争性 扩增反应，并比较扩增产物的量。因此，当使用竞争性RT-PCR时，除了上述引物组以外，使 用已知量的可以用引物组扩增且在扩增后可以与目标核酸的扩增产物（即AIM基因的转录 产物）区分（例如，不同的扩增大小、限制性酶处理后的片段的不同迀移模式等）的竞争物 核酸。因为当目标核酸和竞争物核酸竞争引物时扩增竞争性地发生，所以扩增产物的定量 比例反映初始模板的定量比例。竞争物核酸可以是DNA或RNA。在DNA的情况下，cDNA通 过逆转录反应从如上所述制备的RNA级分合成，并且PCR可以在上述引物组和竞争物共同 存在的情况下进行。在RNA的情况下，将竞争物添加至RNA级分并进行逆转录反应，且添加 上述引物组并进行PCR。在后者的情况下，可以估计初始mRNA的绝对量，因为还考虑逆转录 反应效率。
[0172] 在实时PCR中，使用荧光试剂实时监测扩增量，并且整体地包含热循环仪和荧光 分光光度计的装置是必要的。此类装置是商购的。根据待使用的荧光试剂，存在几种方法， 并且，例如，可以提到嵌入剂法、TaqMan?探针法、分子信标法等。在任何情况下，cDNA通过 逆转录反应从如上所述制备的RNA级分合成，并将上述引物组和荧光试剂（探针）（例如， 通过结合双链DNA而发射荧光的试剂（嵌入剂），诸如SYBR Green I、溴化乙锭等)、可用 作上述探针的核酸（所述核酸在扩增区域内与目标核酸的杂交）（其中两个末端分别用荧 光物质（例如，FAM、HEX、TET、FITC等）和猝灭物质（例如TAMRA、DABCYL等）等修饰）（ TaqMan1^探针或分子信标探针）各自添加至PCR反应系统。由于嵌入剂结合合成的双链 DNA且在照射激发光之后发射荧光，所以可以通过测量荧光的强度监测扩增产物的量，基于 其可以推定初始模板cDNA的量。TaqMan?探针是能够杂交至目标核酸的扩增区域的寡核 苷酸，其两个末端分别被荧光物质和猝灭物质修饰。它在退火过程中杂交至目标核酸，但由 猝灭物质的存在禁止其发射荧光，并且当在延伸过程中被DNA聚合酶的外切酶活性分解时 (其释放荧光物质）发射荧光。因此，通过测量荧光强度，可以监测扩增产物的量，基于其可 以推定初始模板cDNA的量。分子信标探针是能够杂交至目标核酸的扩增区域且具有发夹 型二级结构的寡核苷酸，其两个末端分别被荧光物质和猝灭物质修饰。当它具有发夹结构 时，它由于猝灭物质的存在而不发射荧光，并且当荧光物质和猝灭物质之间的距离在退火 过程中杂交至目标核酸之后增加而发射荧光。因此，可以通过测量荧光强度监测扩增产物 的量，基于其可以推定初始模板cDNA的量。由于实时RT-PCR允许实时监测PCR的扩增量， 所以它不需要电泳且可以更快速地分析AM基因的表达。
[0173] 在另一个实施方案中，从试验主体收集的样品的AM浓度可以通过从样品制备蛋 白级分并检测级分中含有的AIM来测量。AIM的检测可以使用针对AM的抗体通过免疫测 量方法（例如，ELISA、FIA、RIA、蛋白质印迹等）来进行。或者，A頂的检测也可以通过质谱 法诸如MALDI-TOFMS等来进行。
[0174] 针对AM的抗体可以根据通常用于产生多克隆抗体或单克隆抗体的技术且使用 包含与SEQ ID NO:2中显示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列或其部分氨基酸 序列的蛋白作为免疫抗原来获得。
[0175] 在将这些个别免疫测量方法应用于本发明的诊断方法时，不必设置具体条件、程 序等。使本领域技术人员普通技术考虑各方法中的常规条件和程序，可以构建AIM的测 量系统。对于这些一般技术手段的详情，可以参考汇编、书本等。例如，Hiroshi Irie， 编，"Radioimmunoassay"（Kodansha Ltd.，1974 年出版）、Hiroshi Irie，编，"Sequel to the Radioimmunoassay"（Kodansha Ltd·, 1979 年出版）、Eiji Ishikawa 等人，编， "Enzyme Immunoassay"（Igakushoin, 1978 年出版）、Eiji Ishikawa 等人，编，"Enzyme Immunoassay"（第 2版）（Igakushoin, I982年出版）、Eiji Ishikawa等人，编，"Enzyme Immunoassay"（第 3 版）（Igakushoin, 1987 年出版）、Methods in ENZYM0L0GY， 第 70 卷(Immunochemical Techniques (部分 A))、同上，第 73 卷(Immunochemical Techniques (部分 B))、同上，第 74 卷（Immunochemical Techniques (部分 C))、同 上，Vol. 84 (Immunochemical Techniques ( D: Selected Immunoassays))、同上， 第 92 卷（Immunochemical Techniques (部分 E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、同上，第 121 卷（Immunochemical Techniques ( I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(均由 Academic Press Publishing 出版） 等。
[0176] 如上面所提到，本发明的AM的血液浓度在患有肝脏疾病的患者中降低。因此，当 如上所述测量AM浓度且结果显示与健康人相比降低的浓度时，可以判断试验主体已经发 生肝脏疾病或具有发生肝脏疾病的高可能性。或者，预先绘制肝脏疾病的存在与否和AIM 浓度的相关性图，并且可以将获得的观察结果与相关性图进行比较。优选基于显著差异的 存在与否进行比较。
[0177] 本文序列表中的序列标识号显示以下序列。
[0178] [SEQ ID N0:1] 显不人AIM的喊基序列。
[0179] [SEQ ID NO:2] 显示人AM的氨基酸序列。
[0180] [SEQ ID NO:3] 显不对于F4/80的有乂引物的喊基序列。
[0181] [SEQ ID NO:4] 显示对于F4/80的反义引物的碱基序列。
[0182] [SEQ ID NO:5] 显不对于TNFa的有乂引物的喊基序列。
[0183] [SEQ ID NO:6] 显示对于TNFa的反义引物的碱基序列。
[0184] [SEQ ID NO:7] 显示对于IL-6的有义引物的碱基序列。
[0185] [SEQ ID NO:8] 显示对于IL-6的反义引物的碱基序列。
[0186] [SEQ ID NO:9] 显示对于IL-I β的有义引物的碱基序列。
[0187] [SEQ ID NO: 10] 显示对于IL-I β的反义引物的碱基序列。
[0188] [SEQ ID NO: 11] 显不对于aSMA的有乂引物的喊基序列。
[0189] [SEQ ID NO: 12] 显示对于a SMA的反义引物的碱基序列。
[0190] [SEQ ID NO: 13] 显示对于TGFβ 1的有义引物的碱基序列。
[0191] [SEQ ID NO: 14] 显示对于TGFβ 1的反义引物的碱基序列。
[0192] [SEQ ID NO:15] 显示对于AFP的有义引物的碱基序列。
[0193] [SEQ ID NO: 16] 显示对于AFP的反义引物的碱基序列。
[0194] [SEQ ID NO: 17] 显示对于GAPDH的有义引物的碱基序列。
[0195] [SEQ ID NO: 18] 显示对于GAPDH的反义引物的碱基序列。 实施例
[0196] 本发明下面借助以下实施例和参考例进行更具体地描述，本发明并不限于以下实 施例和参考例。
[0197] 实施例1 :通过用高脂肪膳食（HFD)饲喂AM敲除小鼠而促进脂肪肝 通过用高脂肪膳食（HFD)饲喂AIM敲除小鼠和WT小鼠而研宄肝重量、相对于体重的肝 重量、肝脏中中性脂肪的重量、和通过苏木精-伊红组织染色的肝脂肪的积累。作为结果， 用HFD饲喂WT小鼠直到第20周没有导致肝重量/体重的明显差异，但用HFD饲喂AM敲 除小鼠导致从第6周起相比于WT的肝重量/体重的显著增加（图1A)。此外，肝脏中中性 脂肪重量的结果显示，用HFD饲喂AM敲除小鼠导致从第6周起肝脏中脂肪的积累，并且已 经阐明，与WT相比，脂肪肝得到促进（图1B)。
[0198] 实施例2 :通过用高脂肪膳食（HFD)饲喂AIM敲除小鼠的肝纤维化（肝硬化）的 进展 用高脂肪膳食（HFD)饲喂野生型小鼠（雄性，10只小鼠，12周龄）和AIM敲除小鼠（雄 性，10只小鼠，12周龄），0、6、12、20、45、55周后，用福尔马林固定肝脏，用天狼星红染色片， 并且通过NIH-J图像定量染色的纤维化区域（图2A)。每只小鼠用三个不连续的片分析， 并且显示平均值（纤维化与整片的比率）（图2B)。作为结果，纤维化面积随着HFD饲喂时 期变长而增加，但在野生型小鼠和AIM敲除小鼠之间没有发现显著差异。此外，在固定前 从肝组织的部分提取RNA，并且通过定量RT-PCR分析a SMA和TGF β的mRNA表达水平，所 述a SM和TGF β是参与肝纤维化的代表性基因（图2C)。由于高脂肪膳食（HFD)饲喂后 45、55周时在AIM敲除小鼠中频繁发生癌症，并且正常肝脏区域的准确表达水平难以分析， 所以仅仅在饲喂〇、6、12、20周的小鼠中进行RNA分析。作为结果，尽管aSM和TGF β的 mRNA表达水平随着HFD饲喂而增加，但在它们之间没有发现显著差异。
[0199] 实施例3 :通过用高脂肪膳食（HFD)饲喂AM敲除小鼠的肝细胞癌的发病 当用HFD饲喂WT小鼠52周时，观察到脂肪肝，但大部分没有发生肝细胞癌。然而，在 所有AIM敲除小鼠中观察到肝细胞癌，并且几乎所有观察到的肿瘤都是高度分化型肝细胞 癌（HCC)(图3A、B、C)。通过Hoechst/AFP染色在AM敲除小鼠的肝脏中证实肝细胞癌（图 4)，并且还证实了肝脏中AFP的促进表达。
[0200] 实施例4 :通过高脂肪膳食（HFD)饲喂的AM敲除小鼠的炎症应答 用高脂肪膳食（HFD)饲喂AIM敲除小鼠抑制了肝脏中的炎症应答（图5)。当用HFD 饲喂WT小鼠时，在第12-20周时观察到肝脏中促进的炎症应答，诸如巨噬细胞的积累，以及 TNFa、IL-6、IL_lf3的促进表达。相反，与WT相比，这些炎症应答在AM敲除小鼠中被抑 制（图5)。
[0201] 实施例5 :通过IgM稳定血液AM 通过蛋白质印迹分析由于不存在B淋巴细胞而在血液中缺乏IgM的RAG (重组激活基 因）KO小鼠的血清AM。与WT相比，RAG KO小鼠显示出血清中极低水平的AM，并且没有 检测到AM-IgM复合物（图6A)。因此，在体外检查AM和IgM的结合，以证实AM和IgM 的结合（图6A)。此外，向RAG KO小鼠静脉内施用200 μ g IgM。作为结果，血液AM增加 (图6B)。此外，通过ELISA方法测定小鼠和人血清的AM浓度与IgM浓度。作为结果，阐 明了血液AM浓度和IgM浓度在人中也是相关的，如在小鼠中一样（图7)。从上述可见，表 明AIM与IgM形成复合物，并且在血液中被稳定化。
[0202] 实施例6 :AM在体外的脂肪肝抑制作用 研宄AIM在体外对肝细胞的作用。将小鼠原代培养的肝细胞与AIM反应5小时，并且将 细胞用抗-AIM抗体染色，并进行蛋白质印迹。作为结果，证实了 AIM被细胞所摄取（图8)。 此外，将800 μΜ油酸（OA)添加至小鼠原代培养的肝细胞，并且将细胞培养24小时以生成 脂肪肝，并且在添加或不添加 AM的情况下进一步培养24小时。从油红0染色和FSP27 (脂 肪特异性蛋白27)的mRNA表达水平测量脂肪肝的程度。通过不添加 AIM (0A - DMEM)，油 红0染色的水平和fsp27表达水平相比于不添加 OA增加，并且证实了脂肪肝的程度（图 9)。另一方面，通过添加 AM (0A - AM)，油红0染色的水平和fsp27表达水平没有增加 (图9)，并且证实了 AIM的脂肪肝改善作用。
[0203] 实施例7 :通过SRCR结构域抑制前脂肪细胞分化为脂肪细胞 通过在HEK293T细胞中表达添加 HA (血凝素）标签的每种人SRCR结构域并且通过抗 HA抗体柱对其纯化而获得重组人SRCR结构域（SRCR1、SRCR2、SRCR3)蛋白。将3T3-L1前 脂肪细胞在lμg/mL胰岛素、l μM地塞米松（DEX)、0.5mM异丁基甲基黄嘌呤（IBMX)存 在的情况下培养48小时，以诱导分化为脂肪细胞，并且研宄SRCR结构域和AM的分化抑制 作用。添加的AM是人全长AM (hAM)，并且以20 μ g/ml使用上述3种SRCR结构域蛋 白。基于没有添加的油红O染色的水平作为100%定量向脂肪细胞的分化。在所有SRCR结 构域中都发现与AIM的脂肪细胞分化抑制作用相同的脂肪细胞分化抑制作用（图10)。
[0204] 实施例8 :测量NASH患者的血清AM浓度 在3例NASH患者（2例进展为肝细胞癌）和3例非NASH患者中测量血清AM浓度。使 用抗-A頂抗体通过蛋白质印迹进行测量，并且定量信号的强度。与非NASH患者相比，NASH 患者显示降低的血清AIM浓度（图11)。此外，进展为肝细胞癌的NASH患者显示更加降低 的血清AM浓度（图11)。
[0205] 参考例：AIM施用对用高脂肪膳食（HFD)饲喂的AIM敲除小鼠的作用 繁殖8周龄AIM KO小鼠，同时用高脂肪膳食（HFD)饲喂。从HFD饲喂的第2 - 3周 起每天施用AIM或媒介物，然后观察脂肪在肝脏的积累。当施用后4 - 6周时用油红0染 色肝脏时，在媒介物施用组中观察到脂肪积累，而在AM施用组没有发现这一点。因此，已 知AIM可用于脂肪肝的预防。此外，繁殖8周龄AM KO小鼠，同时用高脂肪膳食（HFD)饲 喂。从HFD饲喂的第6 - 8周起每天施用AIM或媒介物，然后观察脂肪在肝脏的积累。当 施用后4 - 8周时用油红0染色肝脏时，在媒介物施用组中脂肪积累相比于施用前增加，而 在AM施用组脂肪积累相比于施用前降低。因此，已知AIM可用于脂肪肝的改善或治疗。此 夕卜，通过使用能够激动性地（agonistically)控制AIM的功能的药物（包括具有AIM活性 的AIM的部分肽）或诱导AIM的表达药物来替代AM也获得了类似结果。类似地，通过在 当发生肝纤维化和肝癌的时间点施用AIM也证实了 AIM对肝硬化和肝癌的预防、改善或治 疗作用。
[0206] 实施例9 :AIM施用对用高脂肪膳食（HFD)饲喂的AIM敲除小鼠的作用 用高脂肪膳食（HFD)饲喂AIM敲除小鼠（雄性，10只小鼠，12周龄）43周，并且从第 30周至第43周每周一次通过腹膜内注射施用重组AM (rAM) (20 mg/Kg (体重）；5只小 鼠）或PBS (5只小鼠）。在HFD的第43周，将小鼠宰杀，用福尔马林固定分离的肝脏，并且 制备肝组织片。用苏木精-伊红染色获得的肝组织片，并且分析癌症的状态和脂肪肝的状 态。对于每只小鼠以10个非连续片制备肝组织片，并且分析癌症的存在与否、大小和数目。 此外，在固定前部分去除肝（非癌部分），并且测量中性脂肪的含量。作为结果，rAIM施用 组的体重显著降低。另一方面，PBS施用组的体重增加（图12A)。在rAM施用组中没有发 现清楚的癌部分。相反，所有小鼠在PBS施用组中都具有多个癌结节（cancer nodule)。此 夕卜，在组织学上发现多个肝癌。显示目视照片和苏木精-伊红染色图像（图12B)。至于脂 肪肝，在rAM施用组中观察到组织学上明显的改善。此外，与PBS施用组的中性脂肪含量 相比，肝（非癌部分）的中性脂肪含量显著降低（图12B)。
[0207] 工业实用性 本发明可以为肝脏疾病提供预防剂或治疗剂，其包含AIM作为活性成分。此外，本发明 的肝脏疾病模型小鼠有助于阐明肝脏疾病的发病机制，并且根据使用所述肝脏疾病模型小 鼠的筛选方法，可以搜索对于肝脏疾病的预防或治疗有效的物质。此外，使用本发明的肝脏 疾病模型小鼠，可以评估已知的用于肝脏疾病的预防剂或治疗剂的效果。此外，本发明可提 供用于诊断肝脏疾病的方法。
[0208] 本申请基于在日本提交的专利申请号2012-103958(申请日：2012年4月27日）， 其内容完全并入本文。
【权利要求】
1. 用于肝脏疾病的预防剂或治疗剂，其包含AIM或其部分肤、或含有编码所述AIM或其 部分肤的碱基序列的核酸。
2. 用于肝脏疾病的预防剂或治疗剂，其包含诱导AIM的表达的药物或稳定AIM的药物。
3. 根据权利要求1或2的药剂，其中所述肝脏疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝 硬化或肝癌。
4. 筛选用于肝脏疾病的预防剂或治疗剂的方法，其包括使用通过用高脂肪膳食饲喂 AIM表达缺陷的非人哺乳动物而获得的动物。
5. 根据权利要求4的方法，其包括W下步骤： (1) 在高脂肪膳食饲喂条件下向AIM表达缺陷的非人哺乳动物施用测试物质的步骤， (2) 观察用所述测试物质施用的AIM表达缺陷的非人哺乳动物的W下特性的任何一 项或多项的步骤： (i) 肝重量， (ii) 肝脂肪量， (iii) 肝纤维， (iv) 肝癌，和 (V)肝脏中的炎症应答，和 (3) 通过与未施用所述测试物质比较来选择改善上述特性的测试物质的步骤。
6. 根据权利要求4或5的方法，其中所述肝脏疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝 硬化或肝癌。
7. 评估用于肝脏疾病的预防剂或治疗剂的预防或治疗效果的方法，其包括使用通过用 高脂肪膳食饲喂AIM表达缺陷的非人哺乳动物而获得的动物。
8. 根据权利要求7的方法，其包括W下步骤： (1) 在高脂肪膳食饲喂条件下向AIM表达缺陷的非人哺乳动物施用用于肝脏疾病的 预防剂或治疗剂的步骤， (2) 观察用所述用于肝脏疾病的预防剂或治疗剂施用的AIM表达缺陷的非人哺乳动 物的W下特性的任何一项或多项的步骤： (i) 肝重量， (ii) 肝脂肪量， (iii) 肝纤维， (iv) 肝癌， (V)肝脏中的炎症应答， (3) 通过将上述特性与未施用所述用于肝脏疾病的预防剂或治疗剂的特性比较而评 估所述用于肝脏疾病的预防剂或治疗剂的效果的步骤。
9. 根据权利要求7或8的方法，其中所述肝脏疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝 硬化或肝癌。
10. 诊断肝脏疾病的方法，其包括W下步骤： (1) 测量试验主体的样品的AIM浓度的步骤， (2) 将所述试验主体的样品的上述AIM浓度与健康人的样品的AIM浓度比较的步骤， (3) 当所述试验主体的样品的上述AIM浓度低于所述健康人的样品的AIM浓度时，判 断所述试验主体具有肝脏疾病或具有发生肝脏疾病的高可能性的步骤。
11. 根据权利要求10的方法，其中所述肝脏疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬 化或肝癌。
12. 用于预防或治疗肝脏疾病的方法，其包括向主体施用有效量的AIM或其部分肤、或 含有编码所述AIM或其部分肤的碱基序列的核酸。
13. 用于预防或治疗肝脏疾病的方法，其包括向主体施用有效量的诱导AIM表达的药 物或稳定AIM的药物。
14. 根据权利要求12或13的方法，其中所述肝脏疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、 肝硬化或肝癌。 15. AIM或其部分肤、或含有编码所述AIM或其部分肤的碱基序列的核酸，其用于预防 或治疗肝脏疾病。
16. 根据权利要求15的AIM或其部分肤、或含有编码所述AIM或其部分肤的碱基序列 的核酸，其中所述肝脏疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化或肝癌。
17. 诱导AIM表达的药物或稳定AIM的药物，其用于预防或治疗肝脏疾病。
18. 根据权利要求17的药物，其中所述肝脏疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬 化或肝癌。
【文档编号】G01N33/15GK104470531SQ201380022312
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年4月26日 优先权日:2012年4月27日
【发明者】宫崎彻 申请人:宫崎彻