微流体装置制造方法

微流体装置制造方法
【专利摘要】本文描述了与微流体装置有关的特定实施方案，所述微流体装置可用于细胞感测、计数、和/或分选。特定的方面涉及能够从稠密的细胞群体中区分单个细胞型的微制造装置。一个特定的实施方案涉及装置和使用该装置来从完整的、未经稀释的血液样品感测、计数、和/或分选白细胞的方法。
【专利说明】微流体装置
[0001]本申请是申请日为2008年4月4日，申请号为200880015296.7，发明题目为“微流体装置”的分案申请。
[0002]相关申请的交叉引用
[0003]本申请要求2007年4月6日提交的美国临时专利申请60/922，296的利益。
[0004]政府利益的声明
[0005]这项工作部分地得到NASA 的 the National Space Biomedical ResearchInstitute的支持，拨款编号NCC9-58-317。美国政府在本发明中具有某些权利。
发明领域
[0006]本公开涉及可用作细胞传感器和/或致动器的制造的微流体装置。在某些实施方案中，所述微流体装置可用于标记、感测、区分、和/或分选目标，特别是细胞群体。
[0007]发明背景
[0008]标准的细胞传感器或致动器通常是基于流细胞计数法且采用电阻抗感测、光散射测量、和化学或免疫染色随后进行光学感测中的一种或其组合。
[0009]对于通过电阻抗感测进行的血细胞区分，借助溶胞除去红细胞，以降低血容量。溶胞通常使用皂甙或表面活性剂进行。在溶胞处理过程中，由于不同程度的细胞质内容物的渗漏和细胞核收缩，白细胞容积变化由细胞型决定。Fujimoto，Sysmex J.1nt.9 (1999)。因此，通过简单的粒子体积电阻抗测量可以实现通常2部分(淋巴细胞对粒细胞)或甚至3部分(淋巴细胞、嗜中性白细胞、和其它白细胞)区分。Hughes-Jones等人，J.Clin.Pathol.27 ；623-625 (1974) ； Oberjat 等人，J.Lab.Clin.Med.76 ;518 (1970);Vandilla 等人，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.125 ；367 (1967) ； Mae da 等人，Clin.Pathol.27 ；1117-1200(1979) ;Maeda 等人，Clin.Pathol.9 ;555_558 (1982)。将直流阻抗和交流阻抗组合，在嗜碱性粒细胞通道中使用特殊的酸性溶血和在嗜酸性粒细胞通道中使用碱性溶血，可以实现5-部分白细胞区分。Tatsumi等人，Sysmex J.1nt.9 ;9_20 (1999)。
[0010]可供选择的光学方法基于细胞器、颗粒和细胞核的光散射和荧光染色。通常，低角散射的光包含关于细胞大小的信息，而高角散射的光可用于探测细胞的内部组成。为了实现5部分区分，某些白细胞种群(例如嗜酸性粒细胞)需要特殊的染色使其散射特征改变为与其它粒细胞不同，且嗜碱性白细胞典型地需要在其它白细胞差别溶胞之后加以单独计数。McKenzie, Clinical Laboratory Hematology, Prentice Hall, 2004 ；Fujimoto, SysmexJ.1nt.9(1999)。
[0011]一般说来，常规的自动细胞分析器体积庞大、价格昂贵、并且机械上复杂，这限制了将其设置在医院或中心实验室。常规的细胞分析器需要更大的样品体积且产生比使用微装置开发的系统更多的废物。此外，对于某些细胞型(例如白细胞)的分析，计数、区分、和/或分选的准确性和速度对于确定疾病状态和治疗来说是重要的。
[0012]附图简述
[0013]图1A显示了吖啶橙的分子结构。[0014]图1B显示了用吖啶橙进行的白细胞染色结果。
[0015]图2显示了新的制造的微流体装置的一个实施方案的顶视图。
[0016]图3显示了光学系统设置的一个实施方案。
[0017]图4A显示了全血中的红细胞浓度。
[0018]图4B显示用100ng/mL浓度的吖啶橙进行的全血中的白细胞染色。
[0019]图4C显示用I μ g/mL浓度的吖啶橙进行的全血中的白细胞染色。
[0020]图4D显示用10 μ g/mL浓度的吖啶橙进行的全血中的白细胞染色。
[0021]图4E显示用100 μ g/mL浓度的吖啶橙进行的全血中的白细胞染色。
[0022]图4F显示在用lmg/mL浓度的吖啶橙进行的全血中的白细胞染色。
[0023]图5显示在一个实施方案中的从单独的白细胞漂白得到的荧光信号。
[0024]图6A显示根据一个实施方案用具有长波通发射过滤器(long pass emissionfilter)的CXD摄像机拍摄的具有聚焦的激光照射流的背景和5 μ m小珠的图像。
[0025]图6B显示根据一个实施方案用具有长波通发射过滤器的CXD摄像机拍摄的具有激光照射流的背景和5 μ m小珠的图像。
[0026]图6C显示根据一个实施方案用具有长波通发射过滤器的CXD摄像机拍摄的具有散射激光照射流的背景和5 μ m小珠的图像。
[0027]图6D显示根据一个实施方案用具有长波通发射过滤器的CXD摄像机拍摄的具有散射激光照射流的背景和5 μ m小珠追踪的图像。
[0028]图7显示用具有长波通发射过滤器的光电二极管检测器进行的5 μ m荧光小珠检测的图。
[0029]图8A显示根据一个实施方案得自用具有长波通发射过滤器的CXD摄像机拍摄的视频的聚焦的激光束的背景图像。
[0030]图SB显示根据一个实施方案用具有长波通发射过滤器的CXD摄像机拍摄的视频的得自稀释的全血试验的白细胞信号。
[0031]图9显示根据一个实施方案用中心处于525nm的绿色发射过滤器得到的吖啶橙染色的未经稀释的全血的放大的光电二极管信号的时间描图，峰经过标记。
[0032]图10显示用具有中心处于525nm的绿色发射过滤器的光电二极管检测器得到的信号强度的柱状图。
[0033]图11显示用具有中心处于650nm的红色发射过滤器的光电二极管检测器得到的信号强度的柱状图。
[0034]图12A显示根据一个实施方案的手持检测盒器具的示例。
[0035]图12B显示根据一个实施方案的组合的检测盒器具。
[0036]图13A显示根据一个具体实施方案的装置的顶视图。
[0037]图13B显示根据一个具体实施方案的装置的顶视图。

【发明内容】

[0038]本文中公开的某些实施方案包括微流体装置，其中所述微流体装置包括具有第一通道的基板，所述第一通道具有限定的物理特性，其中所述第一通道与用于接受流体的至少一个入口流体连通，其中所述第一通道通向限制性进口，并且其中所述第一通道与第二通道流体连通，所述第二通道具有限定的物理特性，其中所述第二通道与至少一个流体流出口流体连通；和流体生物样品。在某些实施方案中，所述限定的物理特性是凹陷或突起。在特定的实施方案中，所述流体生物样品包括血液。在某些实施方案中，所述微流体装置另外包括检测区域、和/或过滤器阵列，各自与所述通道和所述流体流出口流体连通。
[0039]微流体装置包括基板，所述基板具有至少一个第一通道，所述第一通道具有限定的物理特性；在所述第一通道中形成至少一个第一入口，用于接受第一流体；其中所述第一通道与一个分叉的通道流体连通，其中所述分叉的通道与第三通道检测区域流体连通；至少一个第二入口用于接受第二流体，其中所述第二入口与一个有分支的通道流体连通；过滤器结构与储存器流体连通，其中所述储存器与所述第三通道检测区域流体连通；在所述第三通道中形成至少一个流体流出口 ；和流体样品；其中所述第二通道的横截面积与所述第一通道的横截面积的比值为1:10。在某些实施方案中，所述限定的物理特性是凹陷或关起。
[0040]在某些实施方案中，所述过滤器结构包括过滤器阵列，所述第一流体包括鞘流体(sheath fluid)且所述第二流体包括血液。
[0041]本文中公开的某些实施方案涉及包括一个微流体装置且另外包括光源的检测系统；透镜组件；过滤器组件；和图像采集装置。在一些实施方案中，所述检测系统另外包括至少一个显示单元或至少一个记录单元。在某些具体实施方案中，所述激发源包括激光，特别是氩气激光。在特定的实施方案中，所述过滤器组件包括激发过滤器，和至少一个发射过滤器。在某些实施方案中，所述过滤器组件另外包括至少一个孔口和至少一个中性密度过滤器。在特定的实施方案中，所述过滤器组件另外包括至少一个玻璃偏光器。
[0042]在某些实施方案中，检测系统的透镜组件包括至少一个聚光透镜、至少一个物镜、和至少一个分束器。在特定的实施方案中，所述图像采集装置包括至少一个C⑶摄像机、CMOS装置、光电二极管、或光电倍增管。在某些实施方案中，所述过滤器组件包括至少两个发射过滤器且所述图像采集装置包括至少一个光电倍增管。在某些实施方案中，所述显示单元包括一个计算机和所述记录单元包括示波器。在特定的实施方案中，所述激发源包括氩气激光；所述透镜组件包括聚光透镜、物镜、和分束器；所述过滤器组件包括激发过滤器、针眼孔口和中性密度过滤器、和至少一个发射过滤器；所述图像采集装置包括CXD摄像机和光电二极管，且所述显示单元包括个人计算机，且另外包括放大器。
[0043]在特定的实施方案中，检测系统的所述激发源包括氩气激光；所述透镜组件包括聚光透镜、物镜、和分束器，所述过滤器组件包括激发过滤器、至少一个发射过滤器；所述图像采集装置包括光电倍增管，且所述显示单元包括个人计算机。
[0044]本文中公开的其它实施方案涉及用于鉴定靶标的方法，包括为至少一个微流体装置提供流体样品，其中所述流体样品包含至少一种染料；提供激发源以便在靶标中诱导至少一种荧光信号；使用装置中的传感器检测荧光信号；和部分基于对荧光信号的分析鉴定靶标。在某些实施方案中，所述靶标选自:细胞、细胞器、细胞核、颗粒、DNA、和RNA。在其它实施方案中，所述祀标包括选自单核细胞、粒细胞、巨噬细胞、嗜中性白细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、或其它白细胞的细胞。在具体的实施方案中，所述革巴标包括白细胞，且所述染料包括吖啶橙。所述方法的特定的实施方案另外包括借助荧光信号的分析计数或分选样品中的祀标。在特定的实施方案中，所述流体样品包括血液。[0045]发明详述
[0046]本公开涉及可用作细胞传感器和/或致动器的制造的微流体装置。在某些实施方案中，所述微流体装置可用于标记、感测、区分、和/或分选细胞群体。
[0047]微流体细胞传感器和致动器可以提供细胞感测和计数，具有更准确的结果和较低的成本。颗粒计数(包括小珠、红细胞、和培养细胞)已经通过例如电阻抗感测、光散射检测、和荧光感测来说明。Gawad等人，Lab Chipl ;76 (2001) ;Lee等人，Proceedings of thel8thIEEE International Conference on Micro Electro MechanicalSystems (MEMS) 678-681 (2005) ；Satake 等人，Sens.Actuators B: Chem.83 ;77 (2002)；Morgan 等人，Curr.App1.Phys.6, 367-370 (2006) ；Lee 等人，J.Micromech.Microeng.15 ；447-454 (2005) ;Altendorf 等人，Proceedings of the International Conference onSolid State Sensors and Actuators(Transducersj 97)v.1, p.531, Chicago, IL(1997)；Holmes 等人，Biosens.Bioelectron.21 ; 1621-1630 (2006) ；Yang 等人，Meas.Sc1.Technol.17 ；2001-2009 (2006) ；Simonnet 等人，Anal.Chem.78 ;5653_5663 (2006) ；Niehren等人，Anal.Chem.67 ;2666_2671 (1995)。
[0048]在光学感测领域中，微制造已经允许开发微装置来代替基于玻璃毛细管的流动室，和用于使紧凑的光学器件一体化和提供芯片上的样品转运。
[0049]细胞(特别是白细胞)的感测和计数是麻烦的，这部分是由于细胞种群数量。对于基于光学感测的微装置中的白细胞区分，通过硅基片的各向异性湿法蚀刻制造V型槽微通道并且通过二参数光散射对经过稀释的血液进行3部分的白细胞区分，而没有鞘流动。Altendorf, Proceedings of the IntJ I Conference on Solid State Sensors andActuators, v.1, p.531 (1997)。
[0050]然而，在本公开之前，由于种种原因，需要稀释用于细胞传感器和致动器的细胞样品。一个原因是需要进行稀释以防止其中多种细胞同时出现在检测区域中的重合效应。在人血液中，红细胞或红血球与白细胞的比值为约1000:1的数量级,典型地需要约一百到几万的稀释系数，以避免红细胞干涉电阻抗或光散射检测。此外，对于在其中白细胞经过特异性突光标记的样品中计数白细胞，通常需要至少十倍的稀释。Sheenan and Storey, J.Pathol.Bacteriol.59 ；336 (1947) ；Kass, J.Clin.Pathol.76 ;810_12 (1981) ；ffeigl 等人，Biomed.Microdev.3 ;267_274 (2001)；
[0051]还经常需要稀释避免堵塞样品室，还为了除去在运行样品之前溶解的红细胞，特别是对于电阻抗或光散射检测来说。这些规程中的一些还需要另外的固定缓冲液。
[0052]染赳
[0053]在本公开中，可以将染料(例如吖啶橙(3，6-二甲基胺吖啶，图1)用于区分靶标，例如细胞、细胞器、颗粒、细胞核、分子(包括双链或单链的核酸，例如DNA、或RNA、染色体、还包括合成的形式)。在一个特定的实施方案中，可以在无需使红细胞溶胞或固定细胞样品的情况下来检测、计数或分选白细胞。某些染料，例如吖啶橙，由于快速扩散到细胞中、容易商购得到、以及与常见光源(即，氩气激光和可见范围中的其它广谱光源)和滤光器的激发和发射波长相容性，也是合乎需要的。Kosenow, Acta Haematol.7, 217 (1952)；Schiffer, Blood, 19, 200(1962) ；Jackson, Blood, 17, 643(1961) ；HaIlermann 等人，VerhDeutsch Ges Inn Med.70, 217(1964)。[0054]吖啶橙是一种对pH敏感的荧光阳离子染料，其通过静电引力结合于双链DNA并且将吖啶橙插入在碱基对之间。在结合时，激发最大值变为502nm，发射最大值变为525nm(绿色)。吖啶橙还结合于RNA和单链DNA，激发最大值移位到460nm，发射最大值为650nm (红色)。Adams and Kamentsky, Acta Cytol.15, 289 (1971) ；Adams and KamentskyActa Cytol.18，389-91(1974) ;Steinkam等人，Acta Cytol.17，113-17 (1973)。吖啶橙在其在中性pH时为疏水性的且可以容易地扩散通过细胞膜和细胞核膜以结合于RNA和DNA方面也是合乎需要的。在活细胞中，吖啶橙在溶酶体的酸性环境中被质子化，这使得其为阳离子型的并防止染料从溶酶体膜泄漏出来。Moriyama等人，J.Biochem.92 ； 1333-36 (1982)。在吖啶橙用于白细胞分析时，细胞核被染色为绿色带有轻微混合的红色，是由于双链DNA和单链DNA引起的,而细胞质被染色为红色,是由于RNA和溶酶体。因此,可以通过使用绿色荧光通道的强信号容易地实现白细胞计数。可以通过分析得自红色荧光通道的信号来实现白细胞区分。
[0055]对于新染色的白细胞，可以通过研究用吖啶橙染色的经过稀释的血液样品的红色荧光信号实现3部分区分(淋巴细胞、单核细胞、和粒细胞)，而已经用低渗稀释物和新鲜的吖啶橙染色的白细胞样品显示了 5部分区分白细胞(淋巴细胞、单核细胞、嗜中性白细胞、嗜酸性粒细胞、和嗜碱性白细胞)。Adams and Kamentsky, ActaCytol.15,289 (1971) ；Adams and Kamentsky, Acta Cytol.18, 389-391(1974) ;Steinkam等人，Acta Cytol.17，113-17 (1973)。
[0056]其它染料可用于本文中描述的某些实施方案中，例如溴化乙锭、三染料组合物(溴化乙锭、brilliant sulfaflavine、和均二苯乙烯二磺酸衍生物)；恶嗪染料、碱性橙21、和聚甲块染料。Shapiro 等人，J.Histochem.Cytochem.24, 396-411 (1976) ；Shapiro 等人，J.Histochem.Cytochem.25, 836-844 (1977) ；U.S.Patent N0.4, 376, 820 ；U.S.PatentN0.4，882，284 ；Tibbe 等人，Nat.Biotechnol.17，1210-1213(1999) ；U.S.PatentN0.4, 400, 370 ；Kass, J.Histochem.Cytochem.36, 711-715 (1988)。
[0057]觀
[0058]本公开的一个实施方案涉及用于细胞计数和/或分化的设备或装置。在特定的实施方案中，所述设备或装置包括由例如硅、玻璃、塑料、金属、或其它材料的材料形成的基板。本公开的一个特定的实施方案是使用软石板印刷术(soft lithography)制造的。Quake, Science290, 1536-40(2000)。根据具体的实施方案，也可以使用其它光刻或蚀刻技术。
[0059]装置的一个实施方案是使用以10:1比例剧烈混合的两部分PDMS(聚二甲硅氧烧)(Sylgardl84, Dow Corning, MI, USA)微制造的(microfabricated)。在真空脱气约30分钟之后，将混合物倾倒在DRIE蚀刻的硅模具上，所述模具已经用HMDS(六甲基二硅氮烷)预先处理以便在烘焙之后容易分离。将模具在80°C烘焙30分钟。将硬化的PDMS从硅模具上分离，并将PDMS片材切割成碎片并在每个碎片上用Luer短柱适配器(Becton Dickinson, NJ, USA)刺扎射流进入孔。将每个PDMS碎片小心地置于经过净化的载玻片上并在80°C烘焙过夜。在一些情况中，对PDMS和载玻片进行氧气等离子体处理(300mTorr，25W, 30s)，以便改善它们之间的粘着，特别是对于意在重复利用的装置。Bhattacharya 等人，J.Microelectromechan.Syst.14, 590-97 (2005)。[0060]在一个特定的实施方案中，在Icm xlcm PDMS块上模制通道结构，PDMS块的厚度小于3mm。在一个特定的实施方案,通道深度为16 μ m,以便容纳大的白细胞。
[0061]所述装置的一个示例性实施方案显示在图2中。对于这个特定的实施方案，第一流体流动入口 200允许例如鞘流动流体的沉积并与具有第一通道臂260和第二通道臂270的分叉通道流体连通，所述第一通道臂260和第二通道臂270都汇合在储存器290和检测区域240的接头处。在这个特定的实施方案中，所述装置另外包括第二流体流动入口 210，其允许沉积例如样品流体例如血液，第二流体流动入口 210经由有分支的样品流动区域通道220与过滤器阵列结构230流体连通并与流体流出口 250流体连通。在这个特定的示例性实施方案中，采用二维的水动力聚焦来控制检测区域240中的细胞样品的颗粒位置。根据图2中所示的实施方案，鞘流动与中心样品流动的横截面积之比为10:1，检测区域240的通道宽度为50 μ m，被聚焦的样品流动的宽度优选为5 μ m或更小。在特定的实施方案中，通道包括物理特性，例如凹陷或突起。
[0062]装置的一个其它示例性实施方案显示在图13A中。对于这个特定的实施方案，流体流动入口 1340允许样品流体例如生物样品或包含靶标的其它流体样品的沉积。在一个特定的实施方案中，生物样品包括细胞样品，例如血液。在这个示例性的实施方案中，流体入口与第一通道1330流体连通，第一通道1330包含与第二通道1310并列的限制性进口 1320，所述第二通道1310包括检测区域，所述检测区域还与流体流出口 1300流体连通。在某些实施方案中，第一和/或第二通道的高度为大约5 μ m、大约8 μ m、大约10 μ m、大约12 μ m、大约15 μ m、大约20 μ m、大约25 μ m、大约30 μ m、大约35 μ m、大约40 μ m、或其之间的任何值。在某些实施方案中，第二通道的宽度为大约5 μ m、10 μ m、大约15 μ m、大约20 μ m、大约25 μ m、大约30 μ m、大约35 μ m、大约40 μ m、大约45 μ m、大约50 μ m、或其间的任何数值。在图13A中所示的示例性实施方案中，第二通道宽度为大约20μπι大小。
[0063]装置的一个其它示例性实施方案显示在图13Β中。对于这个特定的实施方案，流体流动入口 1440允许样品流体例如生物样品或包含靶标的其它流体样品的沉积。在一个特定的实施方案中，生物样品包括细胞样品，例如血液。在这个示例性的实施方案中，流体入口与第一通道1430流体连通，第一通道1430包含与第二通道1410并列的限制性进口 1420，所述第二通道1410包括检测区域，所述检测区域还与流体流出口 1400流体连通。在某些实施方案中，第一和/或第二通道的高度为大约5 μ m、大约8 μ m、大约10 μ m、大约12 μ m、大约15 μ m、大约20 μ m、大约25 μ m、大约30 μ m、大约35 μ m、大约40 μ m、或其之间的任何值。在某些实施方案中，第二通道的宽度为大约5 μ m、10 μ m、大约15 μ m、大约20 μ m、大约25 μ m、大约30 μ m、大约35 μ m、大约40 μ m、大约45 μ m、大约50 μ m、或其间的任何数值。在图13B中所示的示例性实施方案中，第二通道宽度为大约30μπι大小。
[0064]装置的某些实施方案使用聚焦的激光源用于照射，因为非常期望细胞聚集在检测区域240中。然而，本公开中所包括的其它实施方案使用更均匀地散射的光源和缝隙孔径。这种实施方案利用直的通道几何形状而不用细胞集中。在一个实施方案中，检测区域240的通道长度为ΙΟΟΟμπι。在某些实施方案中，还可以在在样品流动区域220的上游包括过滤器结构230，其将包括红细胞叠连和其它大粒子聚集物在内的污染物过滤掉，以防止检测区域240中的堵塞。在某些实施方案中，过滤器结构230的矩形基柱结构部件的大小为200 μ mx40 μ m。在三列基柱中的每一列之间的间距分别为40 μ m、30 μ m、和20 μ m,其甚至允许最大的白细胞通过过滤器区域230。
[0065]MM
[0066]如图3中所示，在光具座上建立光学系统(透射的激光诱导的荧光检测系统或LIF)。在一个特定的实施方案中，系统设置包括激发或激光光源300、透镜组件340、微流体装置350、可选的另外的透镜组件360、过滤器组件320、330、和图像采集装置390、395。在某些实施方案中，一个或多个发射过滤器包括过滤器组件320、330，在某些实施方案中，图像采集装置395包括电荷耦合器件(CCD)照相机、互补型金属氧化物半导体(CMOS)装置、或光电倍增管(PMT)装置。在特定的实施方案中，图像采集装置395可以偶接为与显示单元或计算装置396例如个人计算机相通讯。本领域技术人员会认识到，有多种和不同的计算机软件程序可用于从系统接受到的数据的积分、汇编、分析、再组合、和其它操作，特别是借助于计算装置396。
[0067]在一个特定的示例性实施方案中，将IS气激光(National LaserNLC210BL, 488nm，和 15-30mW 可调，Salt Lake City, UT, USA)用作激发源。将直径 50 μ m的孔口 310置于激光输出前面，以促进对准过程和降低照射强度。在某些实施方案中，可选的激光-线带通过滤器(带宽等于约1.9nm,中心波长处于488nm)用于进一步纯化激光光源。在某些其它实施方案中，可选的中性密度过滤器(NDF)用于衰减激光激发。或者，针眼和 NDF 被两个线性的玻璃偏光器(Edmond Optics TECH SPEC, Barrington, NJ, USA)代替，以便可以容易地调节装置上的照射水平。
[0068]在一个特定的实施方案中，使用长工作距离显微镜物镜(USMC0 M PlanApo, 10x, 0.28NA, Dayton, NV, USA)作为聚光透镜340。使用另一个长工作距离的显微镜物镜(Bausch&Lomb, 50x, 0.45NA, Rochester, NY, USA)作为物镜 360。在相同的实施方案中，在一个特定的试验中使用三个发射过滤器320:488nm长通过滤器(Chroma H1500LP，转换宽度〈4.9nm,边沿陆度=2.5nm, Rockingham, VT, USA)、中心波长为525nm且频带宽度50nm的绿色带通过滤器(Chroma D525_50m)、和中心波长650nm且频带宽度50nm的红色带通过滤器(Chroma D650_50m)。使用宽带非偏振混频立方体分束器370 (Newport05BC17MB.1，400-700nm, R/T=45%/45%, Irvine, CA, USA)来将光同时引导到光电二极管检测器380和CCD摄像机。
[0069]信号经过电学放大并用娃光电二极管接收机组件390 (Electro-Optical Systems, UVS-025-H, Phoenixville, PA, USA)或光子倍增管(PMT, HamamatsuH5784-20，Japan)检测。电压信号被送往深记忆不波器(deep memory oscilloscope,HP54645A, PaloAlto, CA, USA)。在示波器中的缓冲器充满时，数据可以被加载到计算机并用Matlab峰值-检测程序来分析。可以用模拟的CO)摄像机(Hitachi KP-D20B, Japan)以每秒30帧拍取视频，然后转化为数字格式并储存在计算机396中。在本文中所描述的特定的实施方案中也可以使用其它图像采集装置395，例如CMOS、PMT、或其它装置。在某些示例性试验运行过程中，利用光电二极管检测器和PMT的系统设置比CXD摄像机更灵敏，具有更快的时间响应。在一个示例性的试验运行过程中，首先借助得自CCD摄像机的图像将光学系统粗糙地对准哑设备(dummy device)。使用适当的对准容易地实现检测区域上的10 μ m直径的照射斑点。
[0070]如图12A和图12B中所示，本发明的装置可以被并入到手持的单元中，所述手持单元包括激光光源(例如激光发射二极管或LED120)、至少一个透镜190、至少一个具有可选的分束器的过滤器组件195、在微芯片或其它基板上的本文中所述的微流体装置185、输入/输出端口 130、至少一个图像采集装置100、110 (其可以是光电倍增管)。在某些实施方案中，手持单元可以用外罩壳或壳体150、180和铆钉或螺栓140、160组装并包装起来。
[0071]细胞检测
[0072]本公开的一个方面涉及利用微制造的装置从未经稀释的细胞样品(例如人或其它动物的血液)计数和/或区分细胞(特别是白细胞)的方法。在一个示例性的实施方案中，细胞检测利用吖啶橙和新鲜的全人血来进行。
[0073]在一个示例性实施方案中，新鲜的人血液得自健康的供体并且在收集的3天内使用。向血液样品中添加EDTA以防止凝固。对于吖啶橙染色，可以加入储备溶液，以得到在Ficoll-Paque Plus中的10 μ g/mL的最终染料浓度。Ficoll-PaquePlus还用作鞘流动溶液。荧光的聚苯乙烯小珠(5μπι绿色荧光小珠)购自DukeScientific Corporations, Fremont, CA, USA0 细胞核染色 B丫卩定澄得自 MolecularProbes, Eugene, OR, USA,并溶解于水中，以实现10mg/mL的储备溶液。血液稀释剂Ficoll-Paque Plus 购自 Amersham Biosciences, Sweden。憐酸盐缓冲盐水(10x PBS)得自 Ambion(9625)，Austin, TX, USA。
[0074]染色结果在具有三频带过滤器模块DAP1-FITC-TRITC的荧光显微镜(NikonE800, Japan)下观察，所述过滤器模块具有波长分别为385-400nm、475-490nm、和545-565nm的激发过滤器，波长分别为450-465nm、505-535nm和580_620nm的发射过滤器。在冷却的 CCD 摄像机(RT-KE color3-shot, Diagnostic Instruments, SterlingHeights, MI, USA)拍取图像。使用血球计(HausserScientif ic, Horsham, PA, USA)进行白细胞的粗略计数。必要时，血液或荧光小珠用Ficoll-Paque Plus (比重1.077g/mL)稀释，以使溶剂的比重与白细胞匹配。所有的流体使用注射器泵(Harvard Apparatus PicoPlus, Holliston, MA, USA)泵送到装置中。
[0075]在这个特定的实施方案中，使用模拟的(XD摄像机以匹配的3nL/min样品流速和30nL/min鞘流速的照相机帧速率来进行视频记录。对于光电二极管检测，使用0.1 μ L/分钟的样品流速和I μ L/分钟的鞘流速。对于光子倍增管器具使用I μ L/分钟样品流动和10 μ L/分钟鞘流动。
[0076]为了实现高的信噪比，使用本领域中的常规方法建立用于细胞染色的最大浓度。Adams and Kamentsky, Acta Cytol.15 ;289 (1971)。如图 4 中所不，使用不同的B丫唳澄浓度分析全血样品。白细胞染色的最佳浓度测定为大约I μ g/mL。在图4中利用的特定的示例性实施方案中，盖玻片和格栅表面之间的距离为大约ΙΟΟμπι。如图4Α中可见，在视场下存在有许多的红细胞，而这些细胞不妨碍来自白细胞的荧光信号，如图4B-F中所示。
[0077]如图5中可见，在细胞检测中利用的示例性实施方案未经过任何显著的光致漂白。信号拟合为一级指数式衰减，时间常数为6.4+/-0.7秒。另外两个试验证实了对于一个特定的实施方案的光致漂白时间常数为I秒到10秒之间。通过用吖啶橙染色的全血填充装置来表征一个特定的实施方案的光致漂白时间常数。通过激光焦点扫描通道并将照度设置为与用于试验的相同。整个过程用CCD摄像机记录。当观察到发荧光的白细胞具有与背景明显不同的荧光发射时，停止移动激光焦点并且等待，直到白细胞光退色到背景水平。从视频提取图像，转化为8位灰色标度图像，并用Matlab程序分析。数据拟合为单独的时间常数指数式衰减。
[0078]另外，在约2χ103/μ L的浓度试验绿色荧光小珠，通过C⑶摄像机观察，并显示在图6止。样品流速设置为约3nL/min,鞘流动为约30nL/min。在一个示例性试验运行中，如图6A所示的水动力学聚焦的激光束产生如图6B所示的扩大的光环。通常在每个图像中仅出现一个单个的小珠。使用散射的激光照射，如图6C中所示，可以鉴定小珠的踪迹，如图6D中所示。水动力聚焦限制检测区域的横截面积，但不缩小孔道直径，因此可以改善信噪比而不增加堵塞通道的危险。另外，中心流动的横截面的缩减减少了重合效应。最后，用鞘流动围绕中心样品流动使得装置壁中的荧光染料吸收最小化，由此减少背景噪声。如图7中所示，可以容易地鉴定得自光电二极管检测器的小珠信号。
[0079]如图8中所示，使用红色和绿色发射过滤器，从CCD摄像机拍摄的视频提取的图像都表现出得自用吖啶橙染色的白细胞鉴定的信号，以及得自荧光对照小珠的信号。对于光电二极管检测，对于正常个体的预期的白细胞检测速率为每秒平均为约4-11个细胞。
[0080]在一个示例性实施方案中，使用绿色发射过滤器进行用吖啶橙染色的未经稀释的血液样品的超过50秒的时间追踪,实现了每秒最多约1000个白细胞的处理量。通过描绘柱状图研究得自具有525nm发射过滤器的绿色荧光通道的最大信号强度(图9中所示的峰高)，如图10中所示。正如所料，较低强度部分可能主要由淋巴细胞提供，而较高强度部分可能主要来自单核细胞，中心区域可能大部分来自粒细胞。Steinkam等人,Acta Cytol.17 ；113-117(1973)。
[0081]在一个示例性实施方案中，使用具有650nm发射过滤器的红色荧光通道进行了用吖啶橙染色的未经稀释的血液样品的超过50秒的时间追踪。如图11中所示，鉴定了两个峰，较低强度主要是淋巴细胞，较高强度峰基本上是单核细胞和粒细胞。细胞染色开始到光电二极管记录之间的时间典型地为大于15分钟。
[0082]在两个示例性研究中，利用PMT检测器的一个实施方案的最大的处理量为约每秒1000个白细胞。使用未经稀释的血液，保持了最小的样品体积，增加了处理量。因为试样处理量与体积流率成比例，但是受到最大泵送速率和传感系统的响应时间的限制，在CCD摄像机探测时使用3nL/分钟的中心流动速率。在这个流动速率，典型的白细胞在大约30毫秒内穿过检测区域，这个时间与CCD的帧采集时间大致相等。
[0083]对于光电二极管检测，用于各个实施方案的流动速率可以适合地为大约InL/分钟、大约2nL/分钟、大约3nL/分钟、大约4nL/分钟、大约5nL/分钟、大约6nL/分钟、大约7nL/分钟、大约8nL/分钟、大约9nL/分钟、大约IOnL/分钟、大约20nL/分钟、大约30nL/分钟、大约40nL/分钟、大约50nL/分钟、大约60nL/分钟、大约70nL/分钟、大约80nL/分钟、大约90nL/分钟、大约IOOnL/分钟、大约IlOnL/分钟、大约120nL/分钟、大约130nL/分钟、大约140nL/分钟、大约150nL/分钟、或其之间的任何数值。同样地，对于PMT检测，用于各个实施方案的流动速率可以适当地为大约200nL/分钟、大约300nL/分钟、大约400nL/分钟、大约500nL/分钟、大约600nL/分钟、大约700nL/分钟、大约800nL/分钟、大约900nL/分钟、大约I μ L/分钟、大约2 μ L/分钟、大约3 μ L/分钟、大约4 μ L/分钟、大约5 μ L/分钟的范围，或其之间的任何数值。
[0084]在一个示例性实施方案中，光电二极管接收器模块在低灵敏度设置时的时间响应为0.16毫秒，在高灵敏度设置时为0.6毫秒，而PMT检测器在一个示例性运行中的时间响应为约16微秒。
[0085]此外，通过减小横截面积，中心流动的线性流动速度增加(其需要更快的感测)，并且通过增加检测区域中细胞之间的平均距离减少了重合效应。
[0086]因此，通过利用本文中公开的与微流体装置有关的特定的实施方案，可以在微流动细胞计数器系统中一个接一个地实现白细胞感测、计数、和分选。此外，在本文中描述的某些实施方案中可以使用浓稠的细胞悬液(例如完整的、未经稀释的血液)，这提供了减少样品和废物体积、缩短处理时间、和完全消除芯片上混合和缓冲液储存。在特别的方面中，可以在微流动细胞计数器系统中一个接一个地检测白细胞。
[0087]如本文中所述，装置的某些实施方案可以以不同的规格和结构实施，包括但不限于台上装置、手持装置(如图12中所示的)、可植入装置、纳米技术装置、或其它规格或结构。在较小的示例性结构中，高照度LED被用于激发，微型泵用于以抽吸模式操纵样品，而来自绿色和红色通道的荧光信号可以同时检测。
[0088]参考文献
[0089]在本申请书中提及的和/或在申请书资料表(Application Data Sheet)中列举的上述所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请、和非专利出版物都被全文并入本文作为参考。
【权利要求】
1.微流体装置，其包括 基板，所述基板具有: 与至少一个用于接受流体的入口流体连通的至少一个第一通道； 其中所述第一通道逐渐缩窄，并导向第二通道，所述第二通道具有固定宽度，其包括检测区域并具有与所述第一通道相比降低的横截面流动区域；和 其中所述第二通道与至少一个流体流出口流体连通。
2.权利要求1的微流体装置，其中所述第一通道无障碍物。
3.权利要求1的微流体装置，其中所述第二通道无障碍物。
4.权利要求1的微流体装置，其中所述第一通道和第二通道都无障碍物。
5.权利要求1的微流体装置，其中从所述入口到所述流体流动出口之间的直接流体流动路径无障碍物。
6.权利要求1的微流体装置，其中所述第二通道具有足够细胞通过的宽度。
7.权利要求6的微流体装置，其中所述细胞是白细胞。
8.权利要求7的微流体装置，其中所述白细胞选自单核细胞、粒细胞、巨噬细胞、嗜中性白细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。
9.权利要求1的微流体装置，进一步包括流体递送模块，用于将流体流以层流方式从所述入口、通过所述第一通道和所述第二通道，导向所述流体流动出口。
10.权利要求1的微流体装置，其中所述装置中仅有的通道是所述第一通道和所述第二通道。
11.权利要求1的微流体装置，其中所述第二通道具有的宽度足够单个细胞流动通过。
12.权利要求1的微流体装置，其中所述第二通道的高度是约5μ m-约40 μ m。
13.权利要求1的微流体装置，其中所述第二通道的宽度是约5μ m-约50 μ m。
14.用于鉴定靶标的方法，包括为权利要求1的微流体装置提供流体样品，其中所述流体样品包含至少一种染料；提供激发源以便在靶标中诱导至少一种荧光信号；使用微流体装置中的传感器检测荧光信号；和部分基于对荧光信号的分析鉴定靶标。
15.权利要求14的方法，其中所述靶标选自:细胞、细胞器、细胞核、颗粒、DNA、和RNA。
16.权利要求14的方法，其中所述靶标包括选自以下的细胞:单核细胞、粒细胞、巨噬细胞、嗜中性白细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、或其它白细胞。
17.权利要求14的方法，其中所述靶标包括白细胞，且所述染料包括吖啶橙。
18.权利要求14的方法，另外包括通过分析荧光信号来计数或分选样品中的靶标。
19.权利要求14的方法，其中所述流体样品包括血液。
20.权利要求14的方法，其中所述提供流体样品包括将所述流体样品泵送到所述微粒体装置。
21.权利要求14的方法，其中所述提供所述流体样品包括将所述流体样品抽吸到所述微流体装置中。
22.权利要求14的方法，其中所述流体样品以层流方式从所述入口、通过所述第一通道和第二通道，到所述流体流动出口。
【文档编号】G01N21/64GK103977848SQ201410093616
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2008年4月4日 优先权日:2007年4月6日
【发明者】戴聿昌, 郑斯扬, J·C-H·林, H·L·卡斯丹 申请人:加利福尼亚技术学院