一种制备扫描电镜用寄生虫样品的环氧树脂包埋方法
【专利摘要】本发明公开了一种制备扫描电镜用寄生虫样品的环氧树脂包埋方法，具体包括样品前期处理、样品戊二醛、锇酸固定、样品PBS清洗和丙酮梯度脱水、环氧树脂包埋剂浸渍置换包埋、丙酮清洗与聚合与样品镀膜，即完成寄生虫扫描电镜样品制备。本发明的优点在于：1)寄生虫样品固定前处理易于保持寄生虫正常形态，减少样品的丢失；2）用1％的锇酸再次固定，将寄生虫熏成黑色，即可发挥再次固定的作用，同时将寄生虫固定成易肉眼观察的黑色，便于后续的操作；本发明通过环氧树脂包埋剂梯度浸渍置换包埋替代传统的干燥步骤，因环氧树脂聚合后硬度大，内部稳固支撑寄生虫整体结构，能长期保存，并能更加逼真的展示原始形态特征。
【专利说明】—种制备扫描电镜用寄生虫样品的环氧树脂包埋方法
【技术领域】
[0001]本发明属于寄生虫电镜样品制备【技术领域】，特别涉及一种制备扫描电镜用寄生虫样品的环氧树脂包埋方法。
【背景技术】
[0002]寄生虫为一大群体，寄生于宿主的细胞、组织或腔道内，引起一系列的损伤，并引发各种的疾病，寄生虫可因寄生环境的影响而发生形态构造变化，因此形态学观察是研究寄生虫的基础和热点。早期，应用光学显微镜等传统形态学方法鉴定寄生虫，随着科技的进步和发展，扫描电子显微镜观察已成为研究寄生虫的形态结构是较为先进和常用的手段，对各部位的细微结构具有很高的辨别清晰度，比用光学显微镜进行虫种鉴定更加准确可靠。1988年沈阳农业大学学报刊登的“寄生虫扫描电镜观察样品简易制备法”，提供了一种寄生虫扫描电镜观察样品简易制备法，该方法应用在寄生虫扫描电镜中存在的不足有:I) 70%乙醇固定，固定效果差，且样品采集固定后储存时间短，不能较长时间保存；2)没有用滤纸包裹，容易损失；3)直接70%固定脱水，没有梯度缓慢脱水，寄生虫易失水太快变形；
4)100 %乙醇中只有10分钟，不能保障充分脱水，影响后期置换；5) CO2做临界点干燥，设备、醋酸异戊脂纯度要求高，干燥过程中寄生虫表面还是会产生不同程度的损伤褶皱，效果不是特别完美，易轻微变形，且成功率不高；6)真空镀铝膜，导电性一般。由于寄生虫较多是软体生物，形态较小，样品制备过程中容易变形和丢失。为了适应寄生虫扫描电镜的要求，更好的显露表面形态结构，在制样过程中必须进行特殊处理，才能制备保持高度完整性和良好形态结构特征的寄生虫扫描电镜观察样品。目前这种处理的方法还不够完善，因此需要进一步研究。
[0003]
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于为了克服以上现有技术的不足而提供一种制备扫描电镜用寄生虫样品的环氧树脂包埋方法，为此我们探索了一种用环氧树脂包埋法制备寄生虫样品的方法，利用此方法我们制备过大量的寄生虫样品，结果证明此方法制备寄生虫不易变形，形态逼真，成功率较高，且能较长自然保存。
[0005]本发明是通过以下技术手段实现的:
一种制备扫描电镜用寄生虫样品的环氧树脂包埋方法，包括以下步骤:
步骤一，样品前期处理:将寄生虫活体迅速杀死后包裹于定性滤纸中；
步骤二，样品固定:将样品置于戊二醛中固定2?4小时，然后使用PBS缓冲液将样品表面清洗干净，除去戊二醛，再用锇酸固定，将寄生虫熏成黑色；
步骤三，样品清洗和梯度脱水:使用PBS缓冲液将样品表面清洗干净，除去锇酸，然后用体积浓度为 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%、100%、100%的丙酮作梯度脱水； 步骤四，置换:寄生虫脱水后采用环氧树脂包埋剂与丙酮的混合液中浸溃包埋；
步骤五，清洗:将环氧树脂包埋剂浸溃后的寄生虫挑出放到网眼小于寄生虫体的筛网上，在70°C条件下聚合3?5小时，自然冷却至室温后用丙酮清洗，直到线虫表面变为无光泽为止，再在70°C条件下聚合12?24小时；
步骤六，样品镀膜:将聚合好的样品台用离子溅射仪喷金90?120s，在寄生虫样品表面均匀镀上一层导电的金膜，即完成寄生虫扫描电镜样品的制备。
[0006]所述的制备扫描电镜用寄生虫样品的环氧树脂包埋方法，步骤一中活体寄生虫可以在试管中于60°C、3飞分钟条件下迅速杀死。
[0007]所述的制备扫描电镜用寄生虫样品的环氧树脂包埋方法，步骤二中戊二醛的质量浓度可以为2%。
[0008]所述的制备扫描电镜用寄生虫样品的环氧树脂包埋方法，步骤二中锇酸的质量浓度可以为1%。
[0009]所述的制备扫描电镜用寄生虫样品的环氧树脂包埋方法，步骤四中置换包埋可以为将寄生虫充分脱水后转入体积比为1:3的环氧树脂包埋剂与丙酮的混合液中浸溃2小时，然后转入体积比为1:1的环氧树脂包埋剂与丙酮的混合液中浸溃4小时，再转入体积比为3:1的环氧树脂包埋剂与丙酮的混合液中浸溃6小时，最后转入纯环氧树脂包埋剂中浸溃8?12小时。
[0010]以上所述的制备扫描电镜用寄生虫样品的环氧树脂包埋方法，其中所述的寄生虫是:样品相对较小，形态易变，体内无脊椎骨骼支撑的扁形动物门或者原生动物门。
[0011]本发明对寄生虫样品固定前处理，原理:1)寄生虫生命力顽强，活体直接在2.5%戊二醛中固定，因应激挣扎蜷缩，对寄生虫形态结构有较大影响，高温迅速杀死寄生虫，将易于保持寄生虫正常形态；2)寄生虫小，用定性滤纸包裹，易于减少因操作流程中样品的丢失。环氧树脂包埋剂浸溃置换包埋原理:环氧树脂包埋剂易于与体内丙酮置换，为透射电镜的常用包埋剂，硬度高，浸透容易。
[0012]本发明的优点在于:1)寄生虫样品固定前处理易于保持寄生虫正常形态，减少样品的丢失；2)用1%的锇酸再次固定，将寄生虫熏成黑色，即发挥再次固定的作用，同时将寄生虫固定成易观察的黑色，便于后续的操作；3)寄生虫样品扫描电镜常规制作方法中需CO2临界点干燥法或冷冻真空干燥法，两种干燥法均需要专门的干燥设备，干燥用的C02、叔一丁醇纯度要求高，否则样品干燥不充分，同时干燥过程中寄生虫易出现不同程度的损伤褶皱，干燥后的样品需及时观察，不能长期室外保存。环氧树脂包埋剂梯度浸溃置换包埋替代干燥步骤，可以克服以上缺点，能长期保存，并能更加逼真的展示原始形态特征。
[0013]本发明适用于任何寄生虫样品的处理，原理:寄生虫包含扁形动物门(为无体腔最原始的三胚层动物，包含大部分寄生虫，)；原生动物门(为最原始、最简单、最低等的单细胞动物，原生动物的形状变化很大。有原生质随意流动、形状不定的变形虫，有结构精巧、宛如雕刻着花纹的工艺品的放射虫和有孔虫)；共同特点是样品相对较小，形态易变，体内无脊椎骨骼支撑，常规制样脱水干燥易造成褶皱变形，不能完美逼真展示整体形态。
[0014]本发明的技术特点是方法创新，简便易操作，使用范围广，寄生虫形态结构完整，不变形，成功率较高，技术成本低，可应用于寄生虫扫描电镜样品的制备。
[0015]
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为实施例中所得寄生线虫扫描电镜样品放大2300倍的头部扫描电镜图；
图2为实施例中所得寄生线虫扫描电镜样品放大2000倍的中部扫描电镜图；
图3为实施例中所得寄生线虫扫描电镜样品放大3000倍的尾部扫描电镜图；
图4为扫描电镜显微镜常规真空冷冻干燥法所得寄生线虫放大5000倍的头部扫描电镜图；
图5为扫描电镜显微镜常规真空冷冻干燥法所得寄生线虫放大1600倍的尾部扫描电镜图。
[0017]【具体实施方式】:
实施例1
一种寄生虫扫描电镜样品环氧树脂包埋制备方法，按以下步骤实现:
步骤一，样品前期处理:活体李氏长尾线虫在试管中于60°c、5分钟内迅速杀死，并将寄生虫包在定性滤纸中；
步骤二，样品固定:置于2%的戊二醛中固定4小时，PBS缓冲液清洗三次，每次15分钟，再用I %的锇酸固定2小时，将寄生虫熏成黑色；
步骤三，样品清洗和梯度脱水:PBS缓冲液清洗三次，每次15分钟，用30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%、100%、100%的丙酮作梯度脱水，每次 20 分钟；
步骤四，置换:寄生线虫充分脱水后转入体积比为1:3的环氧树脂包埋剂与丙酮的混合液中浸溃2小时，转入体积比为1:1的环氧树脂包埋剂与丙酮的混合液中浸溃4小时，再转入体积比为3:1的环氧树脂包埋剂与丙酮的混合液中浸溃6小时，最后转入纯包埋剂中浸溃8小时。
[0018]步骤五，清洗:将纯包埋剂浸溃后的寄生线虫挑出来放到300目细眼筛网上，在70°C条件下聚合4小时，冷却后用丙酮一滴滴地清洗，直到线虫表面变为无光泽为止。在70°C条件下完全聚合20小时；
步骤六，样品镀膜:将聚合干燥好的样品台用离子溅射仪喷金100s，在寄生线虫样品表面均勻镀上一层导电的金膜，完成镀金的寄生线虫样品可在扫描电子显微镜下观察，即完成寄生线虫扫描电镜样品制备。
[0019]通过本发明方法制成的寄生线虫扫描电镜观察的形貌如图1、2、3所示。从3图可直观地观察到寄生线虫的整体显微形态，在扫描电子显微镜下，寄生线虫不变形，形态逼真完整、线虫的角质层、环纹、头部、尾部清晰可见。而图4和图5为采用常规真空冷冻干燥法方法处理过的活体李氏长尾线虫的电镜图，可以看出，寄生虫虽然形态完整，但是线虫的角质层、环纹、头部、尾部都不清晰。
[0020]本实施例制备所得寄生线虫扫描电镜样品，用S-3000N(HITACHI)扫描电镜观察，电镜参数设置:图像模式为SE，工作距26.61-27.3mm，样品台倾斜0，加速电压为15.00KV,放大倍数2.0K?3.0K。
[0021]实施例2
一种寄生虫扫描电镜样品环氧树脂包埋制备方法，按以下步骤实现:
步骤一，样品前期处理:活体异钩铗虫在试管中于60°C、4分钟条件下迅速杀死，并将寄生虫包在定性滤纸中；
步骤二，样品固定:置于2%的戊二醛中固定3小时，PBS缓冲液清洗三次，每次15分钟，再用I %的锇酸固定2小时，将寄生虫熏成黑色；
步骤三，样品清洗和梯度脱水:PBS缓冲液清洗三次，每次15分钟，用30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%、100%、100%的丙酮作梯度脱水，每次 20 分钟；
步骤四，置换:异钩铗虫充分脱水后转入体积比为1:3的环氧树脂包埋剂与丙酮的混合液中浸溃2小时，转入体积比为1:1的环氧树脂包埋剂与丙酮的混合液中浸溃4小时，再转入体积比为3:1的环氧树脂包埋剂与丙酮的混合液中浸溃6小时，最后转入纯包埋剂中浸溃10小时O
[0022]步骤五，清洗:将纯包埋剂浸溃后的异钩铗虫挑出来放到200目细眼筛网上，在70°C条件下聚合3小时，冷却后用丙酮一滴滴地清洗，直到线虫表面变为无光泽为止。在70°C条件下完全聚合24小时；
步骤六，样品镀膜:将聚合干燥好的样品台用离子溅射仪喷金90s，在异钩铗虫样品表面均勻镀上一层导电的金膜，完成镀金的异钩铗虫样品可在扫描电子显微镜下观察，即完成寄生线虫扫描电镜样品制备。
[0023]实施例3
一种寄生虫扫描电镜样品环氧树脂包埋制备方法，按以下步骤实现:
步骤一，样品前期处理:活体粘孢子虫在试管中于60°C、3分钟条件下迅速杀死，并将寄生虫包在定性滤纸中；
步骤二，样品固定:置于2%的戊二醛中固定2小时，PBS缓冲液清洗三次，每次15分钟，再用I %的锇酸固定2小时，将寄生虫熏成黑色；
步骤三，样品清洗和梯度脱水:PBS缓冲液清洗三次，每次15分钟，用30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%、100%、100%的丙酮作梯度脱水，每次 20 分钟；
步骤四，置换:粘孢子虫充分脱水后转入体积比为1:3的环氧树脂包埋剂与丙酮的混合液中浸溃2小时，转入体积比为1:1的环氧树脂包埋剂与丙酮的混合液中浸溃4小时，再转入体积比为3:1的环氧树脂包埋剂与丙酮的混合液中浸溃6小时，最后转入纯包埋剂中浸溃12小时。
[0024]步骤五，清洗:将纯包埋剂浸溃后的寄生孢子虫挑出来放到400目细眼筛网上，在70°C条件下聚合5小时，冷却后用丙酮一滴滴地清洗，直到线虫表面变为无光泽为止。在70°C条件下完全聚合12小时；
步骤六，样品镀膜:将聚合干燥好的样品台用离子溅射仪喷金120s，在孢子虫样品表面均勻镀上一层导电的金膜，完成镀金的样品可在扫描电子显微镜下观察，即完成孢子虫扫描电镜样品制备。
【权利要求】
1.一种制备扫描电镜用寄生虫样品的环氧树脂包埋方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤一，样品前期处理:将寄生虫活体迅速杀死后包裹于定性滤纸中； 步骤二，样品固定:将样品置于戊二醛中固定2?4小时，然后使用PBS缓冲液将样品表面清洗干净，除去戊二醛，再用锇酸固定，将寄生虫熏成黑色； 步骤三，样品清洗和梯度脱水:使用PBS缓冲液将样品表面清洗干净，除去锇酸，然后用体积浓度为 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%、100%、100%的丙酮作梯度脱水； 步骤四，置换:寄生虫脱水后采用环氧树脂包埋剂与丙酮的混合液中浸溃包埋； 步骤五，清洗:将环氧树脂包埋剂浸溃后的寄生虫挑出放到网眼小于寄生虫体的筛网上，在70°C条件下聚合3?5小时，自然冷却至室温后用丙酮清洗，直到线虫表面变为无光泽为止，再在70°C条件下聚合12?24小时； 步骤六，样品镀膜:将聚合好的样品台用离子溅射仪喷金90?120s，在寄生虫样品表面均匀镀上一层导电的金膜，即完成寄生虫扫描电镜样品的制备。
2.根据权利要求1所述的制备扫描电镜用寄生虫样品的环氧树脂包埋方法，其特征在于，步骤一中活体寄生虫在试管中于60°C、3飞分钟条件下迅速杀死。
3.根据权利要求1所述的制备扫描电镜用寄生虫样品的环氧树脂包埋方法，其特征在于，步骤二中戊二醛的质量浓度为2%。
4.根据权利要求1所述的制备扫描电镜用寄生虫样品的环氧树脂包埋方法，其特征在于，步骤二中锇酸的质量浓度为1%。
5.根据权利要求1所述的制备扫描电镜用寄生虫样品的环氧树脂包埋方法，其特征在于，步骤四中置换包埋为将寄生虫充分脱水后转入体积比为1:3的环氧树脂包埋剂与丙酮的混合液中浸溃2小时，然后转入体积比为1:1的环氧树脂包埋剂与丙酮的混合液中浸溃4小时，再转入体积比为3:1的环氧树脂包埋剂与丙酮的混合液中浸溃6小时，最后转入纯环氧树脂包埋剂中浸溃8?12小时。
6.根据权利要求1所述的制备扫描电镜用寄生虫样品的环氧树脂包埋方法，其特征在于，所述的寄生虫是:样品相对较小，形态易变，体内无脊椎骨骼支撑的扁形动物门或者原生动物门。
【文档编号】G01N1/28GK104075922SQ201410316245
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年7月4日 优先权日:2014年7月4日
【发明者】聂志娟, 贺子义, 胡冰, 顾若波, 徐钢春, 杜富宽 申请人:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心