基于氧化锌纳米材料的牛伽马干扰素阻抗型免疫传感器的制备方法
【专利摘要】基于氧化锌纳米材料的牛伽马干扰素阻抗型免疫传感器的制备方法，属于电化学免疫分析【技术领域】，将不同形貌、性能优良的氧化锌纳米材料修饰玻碳电极固定牛伽马干扰素抗体，制备得到新颖的电化学阻抗型免疫传感器，可将其应用于牛伽马干扰素的无标记电化学免疫分析，该免疫传感器无需标记、简单、快速、成本低、灵敏度高、重现性和稳定性好，可以用于牛结核病的早期诊断和牛细胞免疫机理的研究。
【专利说明】基于氧化锌纳米材料的牛伽马干扰素阻抗型免疫传感器的 制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于电化学免疫分析【技术领域】，特别是传感器的制备技术。
【背景技术】
[0002] 结核病是对奶牛健康和产乳品质影响最为严重的传染疾病之一。牛伽马干扰素 (BoIFN-γ )是在特定诱生剂刺激作用下，由T细胞分泌的一类具有抗病毒、抗肿瘤和免疫 调节功能等生物活性的糖蛋白，是发现最早、关注最多的细胞因子。
[0003] 目前，牛伽马干扰素的检测常用生物学分析方法，这些生物学分析方法灵敏度低， 费力、耗时、且难于标准化。另外，它们对检测样品中的缓冲剂和其它细胞因子敏感，容易受 到干扰。虽酶联免疫吸附分析也被建立来检测牛伽马干扰素，但是这些方法同样操作繁琐， 费力、耗时，并且灵敏度也不能令人满意。
[0004] 由于牛伽马干扰素分子量较小，且在机体体液中的量极少，目前测定牛伽马干扰 素的方法灵敏度距离临床实际应用还有较大差距。因此，当前急需建立一种超高灵敏度、快 速、可靠的方法检测牛伽马干扰素，为牛结核病的早期诊断提供一个平台。
[0005] 近年来，电化学阻抗免疫分析法由于其无需标记，灵敏度高，特异性好，样品消耗 量小、简单快速等特点，成为一种极有竞争力的现场检测方法。
[0006] 氧化锌纳米材料是具有独特化学、生物、物理和机械性能的纳米材料，为电化学免 疫分析研究提供了新研究途径。
【发明内容】
[0007] 本发明的第一个目的是提出能克服上述牛伽马干扰素检测方法的缺陷，构建一个 基于不同形貌氧化锌纳米材料的牛伽马干扰素电化学阻抗免疫传感器。
[0008] 本发明的技术方案是：将氧化锌纳米材料修饰玻碳电极后，再在电极上固定牛伽 马干扰素抗体，即得到电化学阻抗免疫传感器。
[0009] 本发明采用不同形貌、性能优良的氧化锌纳米材料，比如棒状氧化锌、颗粒状氧化 锌及管状氧化锌纳米材料等，氧化锌纳米材料具有比表面积大，生物相容性好等优点，利用 其固定牛伽马干扰素抗体，有利于保持抗体的生物活性，拓宽检测的线性范围，提高免疫应 特异性和反应效率，减少非特异性吸附，提高检测灵敏度。本发明利用其固定牛伽马干扰素 抗体，实现对牛伽马干扰素的定量检测。
[0010] 具体的制备方法包括以下步骤： 1) 将氧化锌纳米材料分散于去离子水中，形成含有氧化锌的混合剂； 2) 将含有氧化锌的混合剂均匀地涂覆于洁净的玻碳电极表面，经晾干后，再于玻碳电 极表面均匀地涂覆牛伽马干扰素抗体，然后置于4 °C的温度环境下干燥后，再于玻碳电极 表面均匀地修饰一层萘酚膜，最后，采用牛血清蛋白封闭活性位点。
[0011] 通过以上工艺，可将材料和抗体牢牢固定在电极上，制得用于检测牛伽马干扰素 的电化学阻抗免疫传感器。将制得的免疫传感器置于检测体系中，加入牛伽马干扰素抗原， 经温育、冲洗后检测其电化学阻抗信号。以本方法制备的传感器进行测试的方法无需标记、 简单、快速、成本低、灵敏度高、重现性和稳定性好，可以用于牛结核病的早期诊断和牛细胞 免疫机理的研究。
[0012] 另外，为了提高检测的准确性，本发明还在涂覆含有氧化锌的混合剂前，将玻碳电 极先用粒径为0. 05 mm的氧化铝粉抛光，再以去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉后，放入稀硝 酸水溶液中超声清洗，最后依次用乙醇和二次蒸馏水清洗玻碳电极，以此取得表面洁净的 玻碳电极。
[0013] 另外，本发明还提出另一发明目的：以上发明方法制得的电化学阻抗免疫传感器 在牛伽马干扰素检测中的应用。
[0014] 其技术方案是：在以含有 5. 0 mM 的[Fe(CN)6]3_/4lP 0. 1 M KC1 的 0. 1 Μ、pH值 为7. 0的PBS溶液为测试液中，以制得的电化学阻抗免疫传感器为工作电极，饱和甘汞电极 作为辅助电极，钼片电极作为对电极，加入牛伽马干扰素抗原，经37. 5°C温育40 min后，取 出工作电极冲洗，然后检测工作电极的电化学阻抗信号。
[0015] 由于本发明对缓冲溶液的pH、温育温度和温育时间进行了优化，并获得了最佳的 牛伽马干扰素检测条件，提高了分析效果。该方法无需标记、简单、快速、成本低、灵敏度高、 重现性和稳定性好，可以用于牛结核病的早期诊断和牛细胞免疫机理的研究。
[0016] 因此，本发明利用氧化锌纳米材料固定牛伽马干扰素抗体，构建一个无标记电化 学阻抗免疫传感器实现对牛伽马干扰素的定量检测，对牛结核病的早期诊断和牛细胞免疫 机理的研究具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1为牛伽马干扰素免疫传感器制备原理图及无标记阻抗免疫分析示意图。
[0018] 图2为本发明方法制备的BoIFN- γ免疫传感器的线性拟合图。
【具体实施方式】
[0019] 实施例1 : (1)制备颗粒状氧化锌纳米材料。
[0020] 称取〇· 5 g亚微米氧化锌粉末（ZnO )于容积为50 mL的聚四氟乙烯衬里的不锈 钢反应釜中，加入40 mL 20 % H202水溶液，搅拌5 min。然后将其置于烘箱中在120 °C下 反应6 h，待反应体系自然冷却至室温，抽滤，用去离子水洗涤数次，最后烘箱中80 °C干燥 10 h，得到Ζη02白色粉末。
[0021] 称取0. 5 g上述120 °C水热反应6 h所制的Ζη02，置于25 ml的刚玉坩埚中。然 后将其放入马弗炉中在300 °C下加热6 h，待反应体系自然冷却至室温后取出，得ZnO白色 粉末。
[0022] (2)在超声下，将颗粒状氧化锌纳米材料均匀分散于去离子水中，形成氧化锌含量 为lmg/mL的氧化锌混合剂。
[0023] (3)将玻碳电极用0. 05 mm的氧化铝粉抛光，用去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉， 放入稀硝酸溶液中超声清洗，最后依次用乙醇和二次蒸馏水清洗玻碳电极表面，制得预处 理的玻碳电极。
[0024] (4)将含有颗粒状氧化锌的混合剂均匀滴涂于预处理的玻碳电极表面，放置在4 °C冰箱中晾干后，再取5.0 yL 20(^g/mL的anti-BoIFN-γ，将其滴涂在电极上，至于4 °C冰箱中干燥12 h，之后在电极表面滴涂5.0 yL 1%的萘酚。待其干后将电极放入含有 1 wt% (即10 mg/mL)牛血清蛋白的PBS中，在37. 5 °C水浴中温育30 min以封闭电极上 的活性位点，之后用去离子水洗去电极上游离的牛血清蛋白，制得BoIFN-γ免疫传感器， 将其置于4 °C冰箱中储存待用。
[0025] (5)将制得的BoIFN-γ免疫传感器置于检测体系中，加入牛伽马干扰素抗原于 37. 5°C条件下温育BoIFN-γ抗原溶液40 min，用去离子水冲洗后检测其电化学阻抗信号。
[0026] (6)图2为实施例1制备的BoIFN-γ免疫传感器的线性拟合图，图中：横坐标是对 牛伽马干扰素抗原浓度取对数后的值，纵坐标是不同浓度抗原对应的阻抗的相对变化值， 相对变化值的计算公式是：
【权利要求】
1. 基于氧化锌纳米材料的牛伽马干扰素阻抗型免疫传感器的制备方法，其特征在于将 氧化锌纳米材料修饰玻碳电极后，再在电极上固定牛伽马干扰素抗体，即得到电化学阻抗 免疫传感器。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 将氧化锌纳米材料分散于去离子水中，形成含有氧化锌的混合剂； 2) 将含有氧化锌的混合剂均匀地涂覆于洁净的玻碳电极表面，经晾干后，再于玻碳电 极表面均匀地涂覆牛伽马干扰素抗体，然后置于4 °C的温度环境下干燥后，再于玻碳电极 表面均匀地修饰一层萘酚膜，最后，采用牛血清蛋白封闭活性位点。
3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于在涂覆含有氧化锌的混合剂前，将玻 碳电极先用粒径为〇. 05 mm的氧化铝粉抛光，再以去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉后，放入 稀硝酸水溶液中超声清洗，最后依次用乙醇和二次蒸馏水清洗玻碳电极。
4. 一种如权利要求1所述方法制得的电化学阻抗免疫传感器在牛伽马干扰素检测中 的应用，在测试液中，以制得的电化学阻抗免疫传感器为工作电极，饱和甘汞电极作为辅助 电极，钼片电极作为对电极，加入牛伽马干扰素抗原，经温育后，取出工作电极冲洗，然后检 测工作电极的电化学阻抗信号；其特征在于检测条件是： 1) 所述测试液为含有5. 0 mM的[Fe (CN)6]3_/4_和0. 1 M KC1的0. 1 Μ的PBS溶液； 2) 所述PBS溶液的pH为7.0 ; 3) 用于温育的混合体系的温度为37. 5 °C ;温育的时间为40 min。
【文档编号】G01N33/68GK104090116SQ201410348998
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月21日 优先权日:2014年7月21日
【发明者】杨占军, 秦坯芽, 陈祥 申请人:扬州大学