降解或检测甘油磷酸胆碱的酶学方法、产品及其应用与流程

本发明属于生物技术和酶工程领域。更具体而言，本发明涉及一种快速简便降解或检测甘油磷酸胆碱含量的酶学方法及其应用。
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：甘油磷酸胆碱(Glycerophosphocholine,GPC，结构见下式)，是人体内正常存在的水溶性小分子物质。GPC是重要神经传递介质乙酰胆碱(Acetylcholine)的生物合成前体，可以支持大脑和神经系统的功能。在体内，GPC最重要的生理功能在于穿过血脑屏障，为乙酰胆碱和磷脂(PC)的合成提供必要的胆碱。而乙酰胆碱是中枢神经系统中重要的神经传递介质，其帮助脑部完成学习、记忆和认知活动，且能控制浅睡眠和肌动活动。并且，作为一种磷脂类代谢产物,GPC在男性生殖系统的附辜组织及分泌液中具有相当高的含量。近年来，国外许多研究表明精浆中GPC的含量约占人体GPC总量的90％以上，且绝大部分由附睾上皮分泌。精浆中GPC与精子在附睾内发育成熟及受精等过程都密切相关(丁之德等，“我国正常生育力男性精浆中甘油-3-磷酸胆碱含量的研究”，生殖与避孕，1994,14(1):75-76)。由此提示GPC与男性生殖能力和健康的相关性。作为生物体磷脂代谢中的一种重要物质，GPC还与许多疾病存在一定的关联，如与脑缺血型中风、老年痴呆、多发性脑梗死型痴呆、癌症、阿尔兹海默症等(例如参见MoestueS.A.等，“Glycerophosphocholine(GPC)isapoorlyunderstoodbiomarkerinbreastcancer(甘油磷酸胆碱(GPC)是乳腺癌中知之甚少的生物标记物)”.PNAS.2012,109(38):E2506)。近几年，GPC在世界各国引起越来越多的关注(参见赵艳艳等，“甘油磷酸胆碱制备的研究进展”，中国油脂，2013,38(12):50-52)。GPC药物最早在意大利上市，目前已在意大利、波兰、韩国、俄罗斯、希腊、智利、巴西等国家上市，在治疗脑缺血型中风、阿尔茨海默病、多发性脑梗死性痴呆等方面有显著疗效。检测GPC的早期方法包括例如：①使用酸法水解GPC使之产生胆碱，而后使用三碘化物沉淀胆碱并使用分光光度法进行检测(DawsoR.M.C.等，“Glycerylphosphorylcholineandphosphorylcholineinsemen,andtheirrelationtocholine(精液中的甘油磷酸胆碱和磷酸胆碱及其与胆碱的关系)”Biochem.J.,1957,65:627-634)，该方法步骤较为复杂；②使用高碘酸盐氧化GPC并加入甲醛产生生色物质从而检测GPC的方法，但是该方法需要去除果糖等一些杂质等的影响；③先用色谱法纯化GPC，而后通过反应将有机磷转化为无机磷，而后使用定磷法检测磷含量从而得到GPC的量，但是样品中其它磷脂类物质会对结果产生干扰，而且其步骤也十分复杂(ChapJ.H.等，“Simple,RapidEnzymaticDeterminationofGlycerophosphocholineinHumanSeminalPlasma(人精浆中甘油磷酸胆碱的简便快速酶法测定)”，Clin.Chem.1988，34(1):106-109)；等等。相对于这些早期使用的化学法检测，酶法检测GPC具有十分显著的优点，譬如专一性高、检测方法相对简便、耗时短、无需进行分离等优点。ManciniA.等人(ManciniA.等，“Quantitationofglycerophosphorylcholinebyflowinjectionanalysisusingimmobilizedenzymes(采用固定化酶通过流动注射分析定量甘油磷酸胆碱)”，Mol.CellBiochem.，162:83-87，1996)报道了一种使用固定化酶注射分析的方法检测GPC的含量。该方法是将甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶与胆碱氧化酶固定化在一种多孔的玻璃珠上，当含有GPC的样品通过时，GPC会被水解产生游离的胆碱和3-磷酸甘油，其中胆碱又会被胆碱氧化酶氧化产生甜菜碱和过氧化氢，其中的过氧化氢可以通过电流分析的方法进行定量。该方法可以检测10nmol/ml至500nmol/ml的GPC。ChapH.J.等人(ChapJ.H.等，同前，Clin.Chem.1988，34(1):106-109)报道了一种快速简便的酶法检测人精浆中GPC含量的方法，该方法是用PDE(磷酸二酯酶)水解GPC产生胆碱，而后用胆碱氧化酶和过氧化氢酶对其进行定量。美国专利US6,461,830(B1)公开了一种检测甘油磷脂酰胆碱类物质(GPX，与GPC类似只是胆碱可替换为乙醇胺、肌醇、丝氨酸等)的方法，首先使用一种非特异的磷酸二酯酶水解GPX产生3-磷酸甘油，而后采用3-磷酸甘油氧化酶使其产生磷酸二羟丙酮和过氧化氢。磷酸二羟丙酮可在NADH的存在下，在3-磷酸甘油脱氢酶的作用下被还原成3-磷酸甘油，同时NADH被氧化成NAD+进而引起340nm处的吸收值的变化，从而实现GPX的定量。GPC通过水解产生的胆碱可以用胆碱氧化酶氧化产生过氧化氢，该物质与4-氨基比林和苯酚在过氧化物酶的催化下能形成醌亚胺色素，从而在505nm处具有吸收值，因而可以实现GPC的定量。美国专利US2002039757A1和US2003068653A1也公开了类似的检测方法。丁之德等(丁之德等，“我国正常生育力男性精浆中甘油-3-磷酸胆碱含量的研究，生殖与避孕.1994,14(1):75-76.)报道了一种检测精浆中GPC的方法，该方法是将GPC经过酸水解后产生胆碱和3-磷酸甘油，后者在3-磷酸甘油氧化酶存在的条件下被氧化成磷酸二羟丙酮，磷酸二羟丙酮在NADH和3-磷酸甘油脱氢酶存在的情况下被重新还原成3-磷酸甘油，同时产生NAD+。由于NADH在340nm处有吸收而NAD+没有吸收，根据340nm处吸光值的变化可计算出3-磷酸甘油的量，从而可计算出GPC的量。除了酶法检测外，化学发光法、高效液相色谱法、质谱法、核磁共振法检测GPC也有相关报道。如PacificiR.等人(PacificiR.等，“Ahighlysensitivechemiluminescentassayforglycerylphosphorylcholineinhumanseminalplasma(人精浆中甘油磷酸胆碱的高灵敏度化学发光法检测)”，Clin.Biochem.1991,24(6):483-486)报道了一种检测人精浆中GPC的化学发光方法，该方法较普通的分光光度法更灵敏快速。赵艳艳等(赵艳艳等，“甘油磷酸胆碱的鉴别与含量测定”，安徽医药，2012,16(5):601-603)报道了用HPLC-ELSD(蒸发光散射检测器)法定量检测GPC的方法，该方法在100-2000mg/L(即相当于388.8-7775.4nmol/ml)浓度的检测范围内线性良好，平均回收率为99.81％。MuraiS.等人(MuraiS.等，“Animprovedmethodforassayingphosphocholineandglycerophosphocholineinmousetissue(分析小鼠组织中磷酸胆碱和甘油磷酸胆碱的改进方法)”，J.Pharmacol.Toxicol.Methods.2001,46(2):103-109)报道了一种HPLC结合电化学检测器(ECD)的检测GPC和PC的方法。该方法首先是使用0.4N的高氯酸水解GPC，而后使用碱性磷酸酶水解其产物释放胆碱，最后用HPC-ECD的方法进行胆碱的检测。AbbiatiG.等人(AbbiatiG.等，“High-performanceliquidchromatographicassayofL-alpha-glycerophosphorylcholineusingatwo-stepenzymicconversion(通过两步酶转化以高效液相色谱分析L-α-甘油磷酸胆碱)”，JChromatogr.1991May31；566(2):445-51)报道了一种采用酶-HPLC两步法检测GPC的方法。该方法首先用甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶水解GPC产生三磷酸甘油和胆碱，而后采用HPLC对胆碱进行定量。该方法可以检测2-150nmol/ml浓度的GPC。CarpinelliG.等人(CarpinelliG.等，“ModulationsofglycerophosphorylcholineandphosphorylcholineinFrienderythroleukemiacellsuponinvitro-inducederythroiddifferentiation:a31PNMRstudy(体外诱导红细胞分化后弗氏红白血病细胞中甘油磷酸胆碱和磷酸胆碱的调节：31PNMR研究)”，FEBSLett.1984,176(1):88-92.)年报道了使用NMR的方法检测GPC。张康逸等人(张康逸等，“酶法制备甘油磷酸胆碱的研究”，中国油脂，2011,36(5):43-47)发表的酶法制备甘油磷酸胆碱的文献中则是使用LC-MS法对GPC进行定量。综上所述，目前报道的GPC的检测方法大致可以分为如下几类：第一类、早期的化学检测方法，如三碘化物法、高碘酸盐氧化法、消化定磷法等；第二类、酶法检测，其中第一步GPC可以使用磷酸二酯酶水解也可以使用酸法水解，而后则可以使用相应的酶组合物对其GPC的水解产物3-磷酸甘油或胆碱进行定量；第三类、借助一些特殊设备进行定量，如HPLC结合其它的方法、LC-MS法、NMR法等。这几大类方法中，第一类方法存在耗时长、干扰物质多、专一性低等缺点。第三类方法则存在需要借助昂贵实验设备才能展开，且需要专人操作等弊端。第二类的酶法检测方法可避免第一和第三类方法中的以上相应缺点。但是，当前报道的酶学检测方法仍然存在如下的一些缺点，譬如当前报道的方法中均使用了三种或更多酶的组合。其中第一步GPC水解无疑是选择甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶的方案优于酸水解法，因为这种方法的效率更高、选择性更高且干扰物质更少。定量GPC的水解产物之一3-磷酸甘油，当前所使用的方法是用3-磷酸甘油氧化酶、3-磷酸甘油脱氢酶和辅酶NAD通过两步酶反应才能完成定量，无论实验成本还是实验时间上都比较长。定量另一个GPC的水解产物胆碱，需要使用胆碱氧化酶、4-氨基比林、过氧化物酶经过多步反应才能完成，在时间和实验成本上同3-磷酸甘油定量的方法一样存在成本高、耗时长等缺点。因此，本领域中迫切需要开发出一种高灵敏度和精确度的快速简便检测甘油磷酸胆碱的酶学方法。技术实现要素：本发明的主要目的就在于提供一种快速简便检测甘油磷酸胆碱的酶学方法以及该方法的应用。在本发明的第一方面中，提供了一种降解甘油磷酸胆碱的方法，所述方法包括：在适合酶反应的条件下，使甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶和碱性磷酸酶同时或先后与待降解样品中的甘油磷酸胆碱接触。在本发明的第二方面中，提供了一种检测甘油磷酸胆碱含量的方法，所述方法包括：(a)提供待测样品；(b)在适合酶反应的条件下，使甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶和碱性磷酸酶同时或先后与所述待测样品接触并完全反应；(c)对步骤(b)所得反应产物中的无机磷进行定量；(d)根据步骤(c)中所测定的无机磷含量确定所述待测样品中甘油磷酸胆碱的含量。在本发明的一些实施方式中，所述待降解样品或待测样品是：GPC生产过程中的原料、中间产物、取样、食品、保健品、药品(如GPC类保健品或药品)、生物样品，所述生物样品可为选自下组中的一种或多种：全血、血清、血浆、腹水、脑脊液、精液、精浆、尿液、汗液、唾液、细胞代谢物、磷脂类样品。在本发明的一些实施方式中，所述样品可为直接取样的样品，或为经过初步分离、纯化的样品，例如经过离心、过滤、色谱层析、HPLC分离等处理。在本发明的一些实施方式中，适合酶反应的pH条件为：pH7～11，优选7～10，更优选7.5～9.5。在本发明的一些实施方式中，适合酶反应的温度范围为：25～60℃，优选30～55℃，更优选35～50℃。在本发明的一些实施方式中，所述适合酶反应的时间可以在5～240min，优选10～120min更优选15～45min。在本发明的一些实施方式中，可在反应体系中可以加入0～15mM的镁离子，优选0.5～10mM，更优选0.5～5mM。在本发明的一些实施方式中，可在反应体系中可以加入0～500mM的NaCl，优选10～250mM，更优选50～150mM。在本发明的一些实施方式中，所述适合酶反应的条件是：所述甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶的适宜(优选最适)酶反应条件、所述碱性磷酸酶的适宜(优选最适)酶反应条件、根据这两种酶的最适酶反应条件折中选择的适宜酶反应条件。在本发明的一些实施方式中，所述甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶选自下组：动物来源的甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶，如哺乳动物来源的GDE5等；植物来源的甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶；微生物来源的甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶，如来源于酿酒酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉、金黄色葡萄球菌，优选枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、大肠杆菌来源，更优选具有SEQIDNO:2所示序列的甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶。在本发明的一些实施方式中，所述碱性磷酸酶选自下组：动物来源的碱性磷酸酶，如牛小肠碱性磷酸酶CIAP；植物来源的碱性磷酸酶，如来源于芸豆(PhaseolusvulgarisL.)根部的碱性磷酸酶、豆类种子(如豌豆Pisumsativum、鹰嘴豆Cicerarietinum、大豆Glycinemax等)中的碱性磷酸酶等；微生物来源的碱性磷酸酶，如来自于地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)、产酶溶杆菌(Lysobacterenzymogenes)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)及米曲霉(Aspergillusoryzae)，优选牛小肠碱性磷酸酶CIAP和地衣芽胞杆菌等微生物来源的碱性磷酸酶。在本发明的一些实施方式中，这两种酶中的一种或两种是天然酶、合成酶、重组表达的酶，所述酶具有其天然存在时的序列或经过序列优化而具有更高的专一性和/或活性。在本发明的一些实施方式中，这两种酶中的一种或两种是固定化酶。在本发明的一些实施方式中，可用于本发明酶固定化的固体或半固体材料可为天然或合成高分子材料、活性炭、氧化铝。在本发明的一些实施方式中，采用物理吸附、离子吸附、包埋等适当的方法，对本发明的酶进行固定。在本发明的一些实施方式中，步骤(b)中采用的酶的量是过量的。在本发明的一些实施方式中，所述步骤(b)和步骤(c)之间还可任选地包含对酶反应产物进行分离和/或纯化的步骤，例如经过离心、过滤、色谱层析、HPLC分离等处理。在本发明的一些实施方式中，所述检测方法的步骤(c)中的无机磷定量采用选自下组的方法进行：磷钼蓝分光光度法、放射性检测法、钼锑抗比色法、染料结合法、酶联-紫外分光光度法，优选采用磷钼蓝分光光度法。在本发明的一些实施方式中，所述方法中还设置了阴性对照、阳性对照、标准品对照以排除样品中杂质对测定的干扰。在本发明的一些实施方式中，对步骤(a)中的待测样品进行无机磷检测以消除样品中无机磷对测量结果的影响。在本发明的一些实施方式中，设置在酶反应体系中仅加入碱性磷酸酶而不加入甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶的对照样品以消除可被碱性磷酸酶水解的其它底物所造成的干扰。在本发明的一些实施方式中，通过过滤或相分离等方式去除非水溶性的物质，如磷酸胆碱类物质。在本发明的一些实施方式中，选择对甘油磷酸胆碱具有高特异性的甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶来消除甘油磷酸类物质的干扰。在本发明的一些实施方式中，所述方法用于：GPC降解产物的生产；含有GPC或GPC降解产物的食品、保健品或药品的生产；GPC或GPC降解产物生产过程监控；含有GPC或GPC降解产物的食品、保健品、药品生产和/或存储过程中的质量和/或含量的监控；与GPC相关疾病或症状的诊断、治疗监测和/或治疗方案选择。在本发明的一些实施方式中，所述与甘油磷酸胆碱相关疾病或症状选自：脑缺血型中风、老年痴呆、多发性脑梗死型痴呆、癌症、阿尔兹海默症、不孕不育、认知障碍、睡眠障碍等。在本发明的第三方面中，提供了一种用于降解甘油磷酸胆碱和/或检测甘油磷酸胆碱含量的酶组合物，其包含：(i)碱性甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶；和(ii)碱性磷酸酶。在本发明的一些实施方式中，所述酶(i)和/或酶(ii)是固定化的。在本发明的一些实施方式中，所述酶(i)和酶(ii)是独立存在的或在同一体系内的。在本发明的一些实施方式中，所述酶组合物可用于本发明如前所述的方法中。在本发明的第四方面中，提供了一种用于检测甘油磷酸胆碱含量的试剂盒，所述试剂盒包含：(i)碱性甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶；(ii)碱性磷酸酶；(iii)无机磷定量用试剂；(iv)任选的，缓冲液、离子源、pH调节剂、溶剂、容器和/或包装、说明书中的一种或多种。在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒可用于本发明如前所述的各种方法中。在本发明的第五方面中，提供了本发明的方法、酶组合物或试剂盒的应用，其用于：GPC降解产物的生产；含有GPC或GPC降解产物的食品、保健品或药品的生产；GPC或GPC降解产物生产过程监控；含有GPC或GPC降解产物的食品、保健品、药品生产和/或存储过程中的质量和/或含量的监控；与GPC相关疾病或症状的诊断、治疗监测和/或治疗方案选择。在本发明的第六方面中，提供了本发明的酶组合物的应用，其用于制备用于与甘油磷酸胆碱相关疾病或症状的诊断、治疗监测和/或治疗方案选择的试剂盒。在本发明的一些实施方式中，所述与甘油磷酸胆碱相关疾病或症状选自：脑缺血型中风、老年痴呆、多发性脑梗死型痴呆、癌症、阿尔兹海默症、不孕不育、认知障碍、睡眠障碍等。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明下面结合附图对本发明作进一步说明，其中这些附图仅为了图示说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。图1：甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶WGPD-V018的表达载体(pET24a-wgpd-v018)图。图2：WGPD-V018的诱导表达SDS-PAGE图。其中，1：WGPD-V018超声破碎上清；2：WGPD-V018超声破碎沉淀；3：BL21(DE3)宿主超声破碎上清；4：BL21(DE3)宿主超声破碎沉淀；M：蛋白质分子量标记。图3：镍柱纯化后的甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶WGPD-V018的SDS-PAGE图。其中，1：1-WGPD-V018；M：蛋白质分子量标记。图4：磷钼蓝法检测无机磷的工作曲线。图5：GPC的检测值与理论值的线性相关曲线。具体实施方式本发明相对于现有技术方法提供了一种新颖的、易于操作、低成本、耗时短的GPC酶法降解或检测方法。该方法使用可以甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶(优选在碱性范围内作用)和碱性磷酸酶(例如牛小肠碱性磷酸酶，CIAP)同时或先后作用于GPC，经过短时间的充分反应后即实现GPC的降解，并可产生无机磷酸盐，而后通过钼蓝法这种已经得到普遍认可的磷检测方法对这些无机磷酸盐进行定量，从而可以完成GPC的定量。该方法设计的检测路线相较于现有技术中报道的方法(如
背景技术：
部分中提及的US6,461,830(B1)、US2002039757A1和US2003068653A1、ChapH.J.等人于1988年报道的方法、ManciniA.等人1996年报道的方法、丁之德等1994年使用的方法等)具有一定的优势。具体而言，本发明的基本技术路线的原理是：GPC经过甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶水解产生3-磷酸甘油和胆碱；产物之一的3-磷酸甘油经过碱性磷酸酶(如牛小肠碱性磷酸酶CIAP)的水解产生甘油和无机磷酸，从而完成GPC的降解；而后可采用定磷法检测无机磷酸含量，例如可采用如下的磷钼蓝法检测无机磷酸：无机磷酸在酸性条件下同钼酸铵反应形成磷钼杂多酸，该物质经抗坏血酸还原形成钼蓝，钼蓝在660nm处具有最大吸收值，由此对无机磷定量；根据无机磷的量推算出甘油-3-磷酸的产量，从而计算出GPC的量。本发明所提供的技术路线检测GPC时，在3.6-57.8nmol/ml的浓度区间内其检测结果呈线性关系，其灵敏度与与AbbiatiG.等人报道的酶法-HPLC结合的方法的类似(2nmol/ml)，远远高于赵艳艳等人报道的HPLC-ELSD方法(该方法检测范围是388.8nmol/ml)，也优于ManciniA.等人报道的将甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶与胆碱氧化酶制备成固定化酶的注射分析方法(10nmol/ml)的灵敏度。用于本发明方法的酶及反应体系在本发明中可采用甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶和碱性磷酸酶的组合，更优选采用两种均可在碱性范围内发挥其催化作用的酶的组合，即碱性甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶和碱性磷酸酶(例如，牛小肠碱性磷酸酶CIAP)的组合，由此可在同一体系内同时进行两步反应，从而大大提高GPC降解效率。这两类酶均是在其它应用中常用的酶，本领域普通技术人员可通过本领域已知的常规方法或市售途径获得这两类酶。如本文所用，术语“甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶”是指可将甘油磷酸胆碱降解为甘油磷酸和胆碱的磷酸二酯酶。如本文所用，术语“碱性甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶”是指可在碱性条件下将甘油磷酸胆碱降解为甘油磷酸和胆碱的磷酸二酯酶。所述碱性条件可为pH7～11，优选pH7～10，更优选pH7.5～9.5。本发明所用的甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶的来源可为：动物来源，如哺乳动物来源的GDE5等；植物来源，如来源于拟南芥(Arabidopsisthaliana)、白羽扇豆(Lupinusalbus)以及烟草植物来源等；或微生物来源，如来源于酿酒酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉、金黄色葡萄球菌等。在本发明中优选采用源自微生物的甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶，更为优选的使用来自于芽孢杆菌和大肠杆菌的甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶，例如：来源于枯草芽孢杆菌的甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶(如本申请实施例中所用的甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶)；来源于短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)的甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶，如短小芽孢杆菌DSM27的胞外甘油磷酸二酯酶(KusserW.等，“AnovelglycerophosphodiesterasefromBacilluspumilus(源自短小芽孢杆菌的新甘油磷酸二酯酶)”，FEBSLett1984,166:301-306)；来源于大肠杆菌的甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶，例如GlpQ(LarsonT.J.,等，“PurificationandcharacterizationofglpQ-encodedglycerophosphodiesterphosphodiesterasefromEscherichiacoliK-12(源自大肠杆菌K-12的glpQ编码甘油磷酸二酯磷酸二酯酶的纯化和表征)”.ArchBiochemBiophys.1988,260,577–584)、UgpQ(CordaD.等，“Theemergingphysiologicalrolesoftheglycerophosphodiesterasefamily(甘油磷酸二酯酶家族的新生理学机理)”.FEBSJ.2014,281:998-1016)；等等。如本文所用，术语“碱性磷酸酶”是指可在碱性条件下从甘油磷酸中释放出无机磷酸的磷酸酶。所述碱性条件可为pH7～11，优选pH7～10，更优选pH7.5～9.5。可采用本领域中已知的任何碱性磷酸酶，只要其能将3-磷酸甘油催化分解为无机磷酸盐。可用于本发明的碱性磷酸酶包括但不限于：来自于动物的碱性磷酸酶，如牛小肠碱性磷酸酶CIAP；来自于植物的碱性磷酸酶，如芸豆(PhaseolusvulgarisL.)根部的碱性磷酸酶、豆类种子(如豌豆Pisumsativum、鹰嘴豆Cicerarietinum、大豆Glycinemax等)中的碱性磷酸酶等；来自于微生物的碱性磷酸酶，如来自于地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)、产酶溶杆菌(Lysobacterenzymogenes)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)及米曲霉(Aspergillusoryzae)等。在本发明中优选地采用牛小肠碱性磷酸酶CIAP和地衣芽胞杆菌等微生物来源的碱性磷酸酶，考虑到测试成本和酶的易获得性，在本发明的方法中更优选采用已商品化的CIAP(其为分子生物学实验室中常用的一种酶，在本发明公开之前很少有此酶能够作用于3-磷酸甘油产生无机磷的报道)。可采用天然酶、合成酶、重组表达的酶，所述酶可具有其天然存在时的序列或经过序列优化以具有更高的专一性和/或活性。可将碱性甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶和碱性磷酸酶中的一种或两种固定化，即用固体或半固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，使其仍能进行其特有的催化反应、并可回收和/或重复利用。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，又克服了游离酶的不足之处，可呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。可用于本发明酶固定化的固体或半固体材料可为天然或合成高分子材料、活性炭、氧化铝等。可采用物理吸附、离子吸附、包埋等适当的方法，对本发明的酶进行固定。可在同一体系或两个不同的体系中进行本发明的两步酶反应，优选将两步反应集约在同一体系中，即在同一反应体系中同时加入两种酶进行两步酶反应。若本发明中采用了两个不同的体系分别进行两步酶反应，则优选碱性甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶催化反应后得到的反应产物可直接用于下一步的碱性磷酸酶催化反应，而无需经过分离和/或纯化。而将甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶与碱性磷酸酶两步酶反应集约成一个反应体系中完成可大大地节约了反应时间和检测时间，酶反应通常能够在30min之内完成。为了使得本发明的碱性甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶和碱性磷酸酶可在同一反应体系中同时存在和作用，优选选用反应条件和反应体系可兼容且在该条件下具有所需活性的酶进行组合，例如选择具有叠加或相同的反应温度和反应pH范围的碱性甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶和碱性磷酸酶。本发明的酶反应体系可以使用两种酶中任一种最适合反应体系，优选采用较为折衷地反应体系，如选择于两种酶的活力都较高的体系，例如反应温度和/或pH可以选择为碱性甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶的适合温度和/或pH，也可以选择磷酸二酯酶的适合温度和/或pH，优选地采用两种酶活力都较高的反应温度和pH。酶的使用量优选是过量的，更优选的则是在规定的时间内恰好能将所有的底物完全反应产生无机磷的量。本领域普通技术人员可根据酶的种类、活力、反应体系条件等对酶的用量进行调整。无机磷的定量本发明的检测底物GPC是一种水溶性物质，其经过磷酸二酯酶以及碱性磷酸酶CIAP的反应产物也都是水溶性的甘油、胆碱和无机磷酸，因此在酶反应体系中可将样品用离心或微滤的方法使之变为澄清的水溶液。本发明通过酶反应产生的无机磷可采用本领域中已知的定磷方法进行定量。可用于本发明的定磷法包括但不限于：磷钼蓝分光光度法、放射性检测法、钼锑抗比色法、染料结合法、酶联-紫外分光光度法等，优选采用磷钼蓝分光光度法。本发明的无机磷优选采用磷钼蓝分光光度法进行检测，因此需要使酶反应所产生的无机磷的量在该方法的线性检测区间内。酶反应的要求是需要底物几乎完全反应，因此往往需要酶的量要过量，因此底物的检测浓度需要在一个线性区间内。本发明实施例中检测体系的检测线性区间为：3.6-57.8nmol/ml。本发明GPC检测体系在检测一系列不同浓度的GPC时，在线性区间内的线性关系曲线如图5所示，该工作曲线的线性相关系数R2值为0.9996，说明该方法检测GPC的可信度较高。干扰的排除本发明在检测实际样品时，可以通过对照样品的设置、酶的选择、利用干扰物质的性质差异来去除干扰和杂质。例如：●通过对未经酶处理的样品直接进行无机磷检测以消除样品中无机磷对测量结果的影响；●在酶反应体系中仅加入碱性磷酸酶而不加入甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶，而后与检测样品进行相同的处理，其所测结果即可消除一些磷酸酶可以水解的底物所造成的背景；●具有与GPC类似结构的磷脂酰胆碱类物质(如磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱)，因为其不溶于水或不能与甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶作用，也不能与碱性磷酸酶作用，所以不会对检测结果造成干扰；●具有与GPC类似结构的甘油磷酸类物质(如甘油磷酸丝氨酸GPS、甘油磷酸乙醇胺GPE、甘油磷酸甘油GPG、甘油磷酸肌醇GPI等)对检测结果的干扰可以通过选择特异性更高的甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶(例如)来消除。例如可采用来自于老鼠的GDE5酶，其对GPC具有高选择性，其作用于GPC的活性是GPE活性的6-7倍，且几乎不作用于GPS、GPI和甘油磷脂酰甘油(GPG)(参见YuriOkazakiY.等，“ANovelGlycerophosphodiesterPhosphodiesterase,GDE5,ControlsSkeletalMuscleDevelopmentviaaNon-enzymaticMechanism(通过非酶机制控制骨骼肌发育的新型甘油磷酸二酯磷酸二酯酶——GDE5)”.J.Biol.Chem.2010，285(36):27652-27663)；●可任选地采用分离、纯化等步骤去除干扰样品酶反应和/或检测的物质。本发明方法及产品的应用可将用于本发明的一种或多种试剂直接用于检测过程中，也可制成GPC检测试剂盒或其它类型的包装产品以便于进行储藏、运输、销售和进一步使用。本发明的试剂盒或包装产品可包含以下一种或多种物质：酶反应所需物质，如甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶、碱性磷酸酶、缓冲液、pH调节剂、溶剂(如水，优选超纯水)、酶反应所需离子等；定磷反应所需物质，如采用磷钼蓝定磷法时所需的钼酸盐(如钼酸铵或钼酸钠)、还原剂(如抗坏血酸)、缓冲液、稀释用溶剂等；容器；使用说明书等。本发明的方法及产品可用于甘油磷酸胆碱的定量测定，例如可用于GPC生产过程、食品、保健品、药品、生物样品中的甘油磷酸胆碱含量的测定，并由此可进一步用于食品、保健品、药品生产和/或存储过程中的质量和/或含量的监控、临床与甘油磷酸胆碱相关疾病的诊断和/或治疗监测等方面。本发明方法和体系与现有技术GPC检测方法相比具有如下所述的诸多优点，因此具有广泛的应用前景。本发明的优点1.创新：本发明首次报道了一种基于碱性甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶和碱性磷酸酶的酶法检测GPC的方法，之前并无相近或相类似的方法报道。本发明所提供的GPC酶法检测方法相对于现有报道的普通化学法检测、HPLC、LC-MS、NMR法等具有专一性高、耗时短、无需专门设备和专门操作人员即可完成的优点。2.低成本：本发明所提供的GPC检测方法相对于现有报道的酶法检测方法，其使用的酶的种类更少，且可采用易于获得的酶，因此检测成本更低。3.高效：本发明所提供的GPC检测方法相对于现有报道的酶法检测方法，可仅采用两种酶，且这两种酶可以集约于同一反应体系进行反应，因此检测时间大大缩短：本发明的方法中酶反应阶段的时间可以控制在30min乃至更短的时间，这是当前所报道的酶法检测GPC的方法所不具备的。4.简便：本发明所提供的GPC检测方法相对于现有报道的酶法检测方法，因为检测步骤大大减少，操作更为简便高效，大大提高了检测效率。5.灵敏、可靠：本发明所提供的检测方法高度集约了酶法检测方法以及常规的定磷方法(例如钼蓝法)，其检测灵敏、结果可靠。6.应用前景广：本发明所报道的方法中所使用的各种化学物质、酶都是较易于获得的，因此对其无疑相较于现有报道的方法具有更宽广的应用前景。应理解，本文中的各实施方式只是示例性的，本领域普通技术人员基于本申请中的记载和本领域的常识可在不脱离本发明精神和范围的前提下，对各材料、步骤及条件进行组合、改变和优化。实施例下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的组合、修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件(如《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989；《生物化学与分子生物学实验教程》(梁宋平主编高等教育出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1.甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶的制备(1)甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶表达载体的构建本发明所采用的甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶为一种来源于枯草芽孢杆菌GIM1.286的酶，命名为WGPD-V018。该酶的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，其编码多核苷酸序列见SEQIDNO:1。可以采用默克公司的pET24a载体进行异源表达(见图1)。分别采用如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的序列作为上游和下游引物、以枯草芽孢杆菌GIM1.286的基因组为模版进行PCR反应，获得包括NdeI和XhoI限制性内切酶位点的本发明多肽的全长核苷酸序列，经测序验证其序列如SEQIDNO:1所示。然后对PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，并切胶使用美国OmegaBio-Tek公司的E.Z.N.ATM胶回收试剂盒进行目标条带的回收。取200ng左右的回收的核酸，按照下表加入相应酶及缓冲液等。类别体积μL10×NEBbuffer45本发明多肽对应的核酸/pET24a10NdeI2XhoI2100×BSA0.5水30.537℃酶切2h后，用PCR产物回收试剂盒(OmegaBio-Tek公司的E.Z.N.ATM的Cycle-Purekit，货号D6492-01)回收酶切产物。而后按照如下的配方配制连接反应体系为20μl，具体配比如下：类别体积μL10×T4连接酶缓冲液2T4连接酶(5U/μl)0.5pET24a酶切回收产物2目标片段1水13.5而后将该连接体系置于22℃条件下连接3h左右。取100μlDH5α感受态细胞，冰浴融化后，相应加入20μl的连接产物，冰浴30min。而后于42℃热激90秒后，立即放置于冰浴中1-2min后，加入880μl的LB培养基。而后于37℃，200rpm摇床进行预培养60min左右。而后于12000rpm离心3min，去除部分上清液，保留约100μl上清液，充分悬浮沉淀菌体后，取全部液体涂布于相应的含卡那霉素的平板上，37℃培养过夜。取出培养过夜的转化平板，挑选部分菌落进行菌落PCR验证，挑选菌落PCR验证结果为阳性的重组子扩大培养。而后提取重组质粒，该质粒即为构建成功的表达载体，命名为pET24a-wgpd-v018。(2)大肠杆菌重组工程菌株的转化将如上构建的pET24a-wgpd-v018质粒转化于大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，转化方法采用热激转化法，方法同步骤(1)中的DH5α感受态细胞转化。将过夜培养的筛选平板上的菌落，转接并同时做菌落PCR验证，挑选的阳性克隆即为构建成功的重组工程菌BL21-wgpd-v018。(3)重组甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶的诱导表达及分离纯化将上述步骤中获得的重组工程菌BL21-wgpd-v018接种于5ml含有100μg/ml卡那霉素的液体LB培养基中(胰蛋白胨10g/L，酵母浸出物5g/L，NaCl10g/L)，37℃过夜培养过夜。而后按照0.1％的接种量将长好的液体种子接种至发酵摇瓶中，该摇瓶为250ml规格，其中装有50ml的含有100μg/ml卡那霉素的液体LB培养基。而后将摇瓶置于37℃条件下，180rpm培养至OD值在0.6-0.8。立即加入诱导剂IPTG进行诱导，诱导剂的添加浓度为0.2mM。于37℃的条件下进行诱导表达3h左右。取下诱导后的表达摇瓶，10000rpm离心10min，收集菌体。加入含有200mMNaCl的50mMpH7.5的Tris·HCl缓冲液，悬浮好菌体后于冰浴条件下用超声破碎仪进行大肠杆菌菌体的破碎。而后对破碎液进行离心分离，离心条件为4℃，10000rpm离心10min，诱导表达结果见图2。收集超声破碎离心所得的上清液约40ml，往其中加入终浓度为25mM的咪唑，而后加入约200μl的固定结合有镍离子的亲和介质(购自QIAGEN公司的Ni-NTAagrose介质，货号148023851)。混匀后于4-8℃静置30min后，离心弃去上清液，收集沉淀相。再加入含有50mM咪唑的50mMpH7.5的Tris·HCl缓冲液40ml进行洗涤，静置30min后，离心弃去上清液。如此反复2-3次，以除去杂蛋白。最后加入含有250mM咪唑的洗脱缓冲液1-2ml进行洗脱，离心收集上清液弃去沉淀。洗脱缓冲液为含有250mM咪唑以及100mMNaCl的50mMpH7.5的Tris·HCl缓冲液。而后用10KD的离心超滤管对洗脱液进行超滤，置换为不含咪唑的缓冲液，该缓冲液的组成为含有100mMNaCl的50mMpH7.5的Tris·HCl缓冲液。至此即完成本发明中所采用的甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶的纯化，其纯化结果可见图3。与此同时用Bradford法进行蛋白总量的定量，WGPD-V018的量为4.93mg/ml。在37℃条件下，对纯化的重组蛋白进行甘油磷酸二酯酶的活性测定。采用甘油磷酸胆碱-碱性磷酸酶定磷法来测定甘油磷酸二酯酶的活力大小，该方法的原理是以α-甘油磷酸胆碱为底物，其经甘油磷酸二酯酶催化水解产生甘油-3-磷酸和胆碱两种产物。其中甘油-3-磷酸能够被碱性磷酸酶快速高效地催化水解产生甘油和无机磷酸，无机磷酸在酸性条件下同钼酸铵反应形成磷钼杂多酸，该物质经抗坏血酸还原形成钼蓝，钼蓝在700nm处具有最大吸收值，可以实现无机磷的定量。根据无机磷的量推算出甘油-3-磷酸的产量，从而可以计算出甘油磷酸二酯酶的催化效率，即可以计算出甘油磷酸二酯酶的酶活力值。结果显示：WGPD-V018的活力约为1233U/ml。酶活力单位定义为：1个单位即指在标准实验条件下每分钟催化1μmol的GPC所需的酶量。实施例2.磷钼蓝法检测无机磷的工作曲线首先配制浓度为1mg/ml的标准无机磷酸根溶液即相当于浓度为10.53μmol/ml的无机磷溶液(溶质为磷酸二氢钾，溶剂为超纯水)，而后分别稀释2倍、4倍、8倍、16倍、32倍和64倍，从而制备得到不同浓度梯度的无机磷溶液。取40μl的不同浓度梯度的无机磷标准液，加入100μl的钼酸铵溶液和100μl的10w/v％的抗坏血酸水溶液以及760μl的超纯水。而后于45℃水浴中孵育20min。最后于660nm波长下检测其吸光值。以标准无机磷浓度为纵坐标，吸光值A660值为横坐标进行作图，从而得到磷检测工作曲线，工作曲线图见图4。该工作曲线为：[P]＝0.0756×A660其中无机磷浓度的单位为μmol/ml，该曲线的线性相关系数的平方值为0.9996，证明其线性相关性极佳。该曲线表明无机磷的检测范围可以在0～0.15μmol/ml，其中0.004-0.075μmol/ml的无机磷在此条件下检测其吸光值在0.05～1.0范围之内。该实施例中的钼酸铵溶液组成为：钼酸铵2.5％(w/v)，硫酸30％(w/v)。该实施例中的水均为不含无机磷的超纯水。实施例3.GPC的检测精密称取经过干燥的GPC标准品溶于10ml的超纯水制备而得GPC标准溶液，该溶液的浓度为23.8mg/ml，即相当于92.53μmol/ml的GPC浓度。而后将该溶液按照2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍、256倍、512倍、1024倍和2048倍的稀释度进行稀释。取各个稀释度的GPC溶液80μl，分别加入100μl的2×缓冲液、1个单位左右的实施例1所制备的甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶WGPD-V018、1个单位左右的商品CIAP酶(NEWENGLAND公司，货号M0290L)，补充超纯水至反应体积为200μl。上述的2×缓冲液的组成如下：200mMTris·HCl，20mMMgCl2，100mMNaCl，pH8.0将反应管置于37℃水浴中孵育30min或更长时间，使得酶反应尽可能彻底。而后取出样品管按照实施例2中的无机磷检测方法，加入100μl的钼酸铵溶液和100μl的10％的抗坏血酸以及600μl的超纯水。而后于45℃水浴中孵育20min。最后于660nm波长下检测其吸光值。无机磷检测体系中的GPC理论浓度分别为：7.4024μmol/ml(原液)、3.7012μmol/ml(稀释2倍)、1.8506μmol/ml(稀释4倍)、0.9253μmol/ml(稀释8倍)、0.4626μmol/ml(稀释16倍)、0.2313μmol/ml(稀释32倍)、0.1157μmol/ml(稀释64倍)、0.0578μmol/ml(稀释128倍)、0.0289μmol/ml(稀释256倍)、0.0144μmol/ml(稀释512倍)、0.0072μmol/ml(稀释1024倍)、0.0036μmol/ml(稀释2048倍)。将检测得到的A660值按照实施例2中的工作曲线进行计算从而得到该样品管中的无机磷的摩尔浓度，因为1分子GPC对应1分子无机磷，所以该无机磷的摩尔浓度值即为检测的GPC的摩尔浓度值。检测结果表明，在原液和稀释2-64倍的样品管的检测结果与128～2048倍稀释样品的检测结果线性关系不佳，多数稀释倍数低的样品的A660值均已大大超过1.0。稀释倍数为128-2048倍的样品则呈现了良好的线性关系，结果见图5。该图是以实际配制的GPC浓度值为横坐标检测值为纵坐标进行线性拟合。由图5可以发现，GPC的实际浓度为3.6nmol/ml～57.8nmol/ml的范围内其检测值呈很好的线性相关性，其相关系数的平方值达到0.9996。同时该线性相关方程说明，本发明方法的回收率可达98.33％。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。当前第1页1 2 3