检测人精子表面糖结构变化的试剂盒的制作方法

本发明涉及精子检测试剂盒领域，特别是指一种检测人精子表面糖结构变化的试剂盒。
背景技术：
：类精子的冷冻保存技术已有70多年的历史。如今，精子的冷冻保存技术已是辅助生殖技术以及精子库的重要组成部分，此技术水平的提高以及复苏率的稳定性都直接影响着最终受孕率。一方面，通过冷冻复苏捐赠者的精液，为无精症患者及不宜生育的严重遗传性疾病患者提供正常精子，让许多不孕夫妇实现拥有孩子的梦想；另一方面，为某些需要进行化疗放疗的恶性疾病患者，需要接触辐射、放射、毒物等而损失精子的工作人员以及将要进行睾丸切除或输精管结扎术的患者，提前进行精子冷冻储藏，为生殖健康提供保险。虽然冷冻方法一直在不断改良，但冷冻复苏对精子结构和功能依然造成了不可逆转的损伤。精子表面覆盖着一层糖萼，精子从睾丸生成在穿过附睾的过程中，各种糖残基以共价结合的方式结合到精子膜表面的蛋白或脂质上，形成20-60nm厚的糖萼。与仅有三种糖蛋白组成的卵子透明带相比，精子糖萼的组成成分要复杂的多，据估计，约有三百多种不同的糖蛋白和糖脂组成。精子糖萼是雄性配子与外界环境相互作用的主要界面，在精子形成，成熟，获能以及顶体反应过程中，精子表面糖蛋白发生巨大重排，精子糖萼的微妙变化对精子生育力都具有重大影响，精子糖萼的成熟与精子生育力紧密相关。目前，研究细胞表面糖结构的技术手段不多，主要是利用凝集素与寡糖的特异性结合的流式细胞仪技术(flowcytometry，FCM)和荧光显微镜的技术，以及凝集素芯片技术。技术实现要素：本发明提出一种检测人精子表面糖结构变化的试剂盒，丰富了现有技术中的检测方式，能够评价精液中精子质量，为男性不育分子机制的研究以及男性不育病因诊断提供理论依据。本发明的技术方案是这样实现的：一种检测人精子表面糖结构变化的试剂盒，所述试剂盒包括：双孢子蘑菇凝集素(ABA)、曼陀罗植物凝集素(DSL)、菠萝蜜凝集素(AIA)、黑色菜豆凝集素(Blackbeancrude)、田旋花凝集素(CALSEPA)、金雀儿凝集素(CSA)、斑豆凝集素(GSLI-B4)、蜗牛凝集素(HPA)、怀槐凝集素(MAA)、怀槐凝集素(MALII)、豌豆凝集素(PEA)、何首乌凝集素(PMA)、荆豆凝集素(UEAI)、长柔毛野豌豆外源凝集素(VVL)中的一种或几种的组合。作为优选的技术方案，上述凝集素均经过荧光标记。作为优选的技术方案，所述试剂盒还包括：碘化丙啶，50-100ug/ml的异硫氰酸荧光素，TBST洗涤液，PBST洗涤液以及PBS洗涤液。作为优选的技术方案，所述碘化丙啶的浓度为5-20ug/ml。原理：由于不同人的精子质量不同,我们用凝集素芯片筛选出14种凝集素与耐冻性能不同的男性精子结合程度都不同。用FITC和PI标记的这14种凝集素与待检测精子样本孵育结合，经流式细胞仪检测样品的荧光强度，从而判定精 子的耐冻性能。本发明通过14种凝集素组合作为耐冻性能差的筛查方法。应用于临床，能够评价精液中精子质量，为男性不育分子机制的研究以及男性不育病因诊断提供理论依据。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明的试剂盒提供了一种新的检测精子质量的方法，拓宽了研究细胞表面糖结构的方式。(2)本发明的试剂盒，整个检测过程快速简便。(3)本发明利用凝集素的结合与不同人精子样本结合强度的差异，通过流式细胞仪检测荧光强度来评价精子的耐冻性能，实现对其是否可以进行冷冻进行评估，为男性生殖健康和保险提供保障，为男性不育分子机制的研究和男性不育病因诊断提供理论依据。附图说明为了更清楚地说明本发明实施方案或现有技术中的技术方案，下面将对实施方案或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方案，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1耐冻性能不同的男性精子与凝集素结合的差异图；其中a-耐冻，b-不耐冻。图2不同耐冻性能的男性精子冷冻复苏前后与凝集素结合差异图一(耐冻组)；其中c-冷冻复苏前，d-冷冻复苏后。图3不同耐冻性能的男性精子冷冻复苏前后与凝集素结合差异图二(不耐 冻组)；其中c-冷冻复苏前，d-冷冻复苏后。图4为用于评估男性精子耐冻性能的凝集素荧光信号结果图；其中e-耐冻，f-不耐冻。具体实施方式下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1人精子的采集和荧光标记步骤(1)精液样本的采集样本对象禁欲2-7天，通过手淫法获得全份精液，置于37℃水浴30分钟，进行液化。步骤(2)精液样本的分组将液化好的精液样本分为两份，一份为新鲜组，进行后续的处理。另一份为冷冻复苏组，采用一步熏蒸法进行超低温冷冻处理。首先将液化好的精液样本立即与等量冷冻保护剂进行缓慢混合，轻轻的充分混匀后，将平衡后的样品快速转移到离心管中，放到一步熏蒸仪中熏蒸2h以上，迅速转移到液氮中进行保存待用。7天之后，37摄氏度恒温水浴5min，进行解冻复苏。对于复苏率(即冷冻复苏后的前向活动率/新鲜组对前向活动率)低于35％，定义为耐冻性能差的精子样本，复苏率大于70％定义为耐冻性能好的精子样本。步骤(3)精液样本的固定上述精液经500g离心10分钟后，弃精浆，然后用PBS(pH7.4)重悬洗涤，500g离心5分钟；精子沉淀用新鲜配制的2％多聚甲醛和0.2％戊二醛固定 30分钟后，再次用PBS洗涤2次，最后重悬于含0.02％叠氮钠的PBS(pH7.4)中，经精子计数板计数后，调整精子密度为40×106sperm/mL，置于4℃冰箱保存备用；对每份精子样本计数定量是为了保证凝集素芯片上样量的一致性，提高凝集素芯片检测的准确性；步骤(4)精液样本的荧光标记取0.5mL冷藏的精子，加入碘化丙啶(20μg/mL)避光孵育30分钟进行荧光染色，经PBS洗涤一次后，用800μLbindingbuffer重悬，备用。利用凝集素芯片检测耐冻性能不同的精子样本步骤(1)芯片复温：从4℃冰箱拿出芯片，放置在室温下20-30分钟，挥发水汽，恢复温度；步骤(2)芯片封闭：配置50mLTBST,慢慢加到槽内，放置到摇床室温轻轻摇动1小时；步骤(3)芯片洗涤：用50mLPBST清洗10分钟，再用PBS洗涤两次，每次10分钟，晾干备用；步骤(4)芯片孵育槽的准备：把已标记了阵列位置的玻片做为模板放在芯片底部，然后把芯片孵育槽按照阵列所在位置黏贴在芯片上，按压牢固；步骤(5)精子和芯片结合：在凝集素芯片每个孵育槽中加入200μL已标记荧光的精子样本，室温避光孵育1小时；步骤(6)洗涤非特异结合：每张芯片，准备500mLPBST；缓慢倒入洗涤盒中，右手持片，轻轻地把孵育槽揭起来，缓慢翻转芯片约10-20次进行洗涤；步骤(7)芯片扫描：晾干后的凝集素芯片用GenePix4100B(Axon,Sunnyvale,CA)芯片扫描仪进行扫描，分辨率设置为5μm，光电倍增管(PMT)设为100％，先进行预扫描，然后选定点样区域，进行精确扫描，调节明亮度和对比度，达到最佳视觉效果；得到凝集素与标记后精子表面糖链结合的荧光图像；步骤(8)通过GenePix3.0软件对荧光图像进行平均值分析。荧光显微镜以及流式细胞仪检测用100μlPBS重悬5×106精子细胞，加入100μg/mlFITC-ABA重悬混匀，置于37℃，避光孵育30min，然后加入20μg/mlPI重悬混匀，置于37℃，避光孵育10min，然后用0.5mlPBS洗涤一次，取20μl涂片，荧光显微镜观察荧光信号，然后用FacsCalibur流式细胞仪进行荧光强度分析，结果用FlowJo7.6.1软件分析鉴定。实施结果的分析与评价(1)对于凝集素芯片结果，我们对于新鲜样本(未经过冷冻复苏)数据，我们对耐冻组合不耐冻组数据进行独立T检验。比较不同耐冻性能精子与凝集素结合信号，发现有凝集素双孢子蘑菇凝集素(ABA)，曼陀罗植物凝集素(DSL)(如图1所示)具有显著性差异。与耐冻性能好的精子样本相比，耐冻性能差的精子样本与ABA凝集素结合的信号都显著上升，耐冻性能差的精子样本与DSL凝集素结合的信号都显著下降；(2)对于凝集素芯片结果,我们对冷冻复苏前后样本的数据进行配对T检验，耐冻组数据冷冻复苏前后有差异，不耐冻组数据冷冻复苏前后没有差异，筛选出可以评估精子耐冻性能12种凝集素：菠萝蜜凝集素(AIA),黑色菜豆凝集素(Blackbeancrude)，田旋花凝集素(CALSEPA)，金雀儿凝集素(CSA)，斑豆凝集素(GSLI-B4)，蜗牛凝集素(HPA)，怀槐凝集素(MAA)，怀槐凝集素(MALII)，豌豆凝集素(PEA)，何首乌凝集素(PMA)，荆豆凝集素(UEAI)，长柔毛野豌豆外源凝集素(VVL)(如图2和图3)。(3)利用荧光显微镜和流式细胞仪检测不同耐冻性能的精子与FITC-ABA和PI结合强度，发现和凝集素芯片筛选结果一致，耐冻性能差的精子样本，其与FITC-ABA的结合信号显著上升(如图4)。名称不耐冻组-耐冻组凝集素的特异性ABA*Gal(β1-3)GalNAc曼陀罗植物凝集素(DSL)、菠萝蜜凝集素(AIA)、黑色菜豆凝集素(Blackbeancrude)、田旋花凝集素(CALSEPA)、金雀儿凝集素(CSA)、斑豆凝集素(GSLI-B4)、蜗牛凝集素(HPA)、怀槐凝集素(MAA)、怀槐凝集素(MALII)、豌豆凝集素(PEA)、何首乌凝集素(PMA)、荆豆凝集素(UEAI)、长柔毛野豌豆外源凝集素(VVL)的检测结果也跟筛选结果一致。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3