用于实施在斑点上的分析方法的对照标记物与流程

本发明涉及对照标记物用于实施在斑点上的分析方法的用途，尤其是在多重分析的情况下。本发明因此涉及含有所述对照标记物的固体支持体、它们的制备方法和它们在分析方法中的用途。本发明使得可以在分析方法结束时校验斑点的存在、位置和/或完整性，并因此确保所得的结果，同时保证得到的结果的确是来自存在的、完好的且局域化的斑点的结果。

发明背景

多重分析方法允许同时检测在同一样品中的若干种被分析物的潜在存在。典型地使用包含斑点的固体支持体，例如在每个孔里包含斑点的微量培养板(microplate)，来实施多重分析方法，所述斑点各自意在检测被分析物或充当对照。

对于本领域技术人员清楚的是，一个与斑点技术有关的风险是，在用于固体支持体(尤其是微量培养板)的制备方法期间或者在使用所述固体支持体实施分析方法期间没有沉积物，若干斑点消失或劣化。用于沉积样品或试剂的装置可能的确偶然地与一个或若干个斑点接触，从而改变它们的表面，例如通过形成在一个或若干个斑点中的条痕，或者通过拔出一个以上斑点的全部或部分。

例如，在Bastarache等的论文(多重免疫化验平台的精确性和可重现性：确认报告(Accuracy and Reproducibility of a multiplex Immunoassay platform：a validation study)，J.Immunol Methods，Mar 31，2011，367(1-2)33-39)中，存在在测试结束时在光信号上观察到的缺陷，如斑点不规则、导致一个斑点被相邻的斑点污染的丛毛(comas)的存在、以及在斑点的理论位置没有预期的信号。

而且，当在分析方法结束时导致阴性结果时，此结果必须是由于在样品中没有待检测的被分析物造成的结果，而不是由于相应的被分析物的检测斑点不存在或劣化造成的结果。分析方法的确保是至关重要的，尤其是对于它们在人类的诊断中的用途，例如校验用于输血目的的血液样品没有病毒或细菌污染。

用于斑点分析的固体支持体的制造由以下过程组成：在固体支持体的表面上沉积包含待检测的被分析物的捕捉配体的溶液，从而形成斑点。接下来在固体支持体的制造结束时校验固体支持体的品质，从而仅仅保留具有完好的且良好形成的斑点的固体支持体。

因此，文献US2006/0063197描述了在意在形成DNA微阵列的斑点的沉积溶液中荧光团的使用。荧光团用于在用于DNA微阵列的制备方法结束时校验各个斑点的品质。此外，在ELISA试验的实施期间，在添加底物之前，仅仅在斑点处检测到弱的参与荧光信号。

文献WO2012/142397研究了在包含DNA微阵列的微流体设备中的通量问题，并且描述了包含阵列仓的DNA微阵列组装体，所述阵列仓具有在第一端处的用于样品的入口、DNA微阵列和在连接到废物仓的第二端处的用于样品的出口，对于阵列仓的第一端横断的面积比在第二端的横断面积宽。此文献也描述了用于校验DNA微阵列的制造品质的方法，包括测量由在斑点处的内部品质对照荧光团发射的荧光并且将关于阵列的每个斑点的信息以条码、记忆装置或通过射频识别来编码，此信息因此被与DNA微阵列相关联地编码。

此外，在多重分析方法的实施期间，可以在理论读取栅格(reading grid)处检测对应于待检测的被分析物的信号。通常，在多重分析方法结束时，从在充当阳性对照的斑点处检测的信号，限定此理论读取栅格。然而，根据读取尺度，在固体支持体制造期间斑点的定位中和/或在用于检测信号的装置中的固体支持体的定位中相对于理论读取栅格的任何移位都导致斑点的实际位置相对于理论读取栅格的移位，并且因此影响被分析物的检测灵敏度。

因此，对于确保，尤其是通过使得可以在分析方法结束时校验斑点的存在、位置和/或完整性，和/或通过使得可以优化被分析物的检测(例如通过改善被分析物的检测灵敏度)来确保在斑点上的分析方法结束时获得的结果的方案，仍然存在需要。

发明详述

本发明基于发现对照标记物，所述对照标记物可以与样品中的待检测的被分析物的特异性捕捉配体同时沉积形成在固体支持体上的斑点，这些对照标记物能够在使用所述固体支持体实施的分析方法结束时产生信号，很小地干扰或根本不干扰被分析物的检测。根据本发明的对照标记物因此使得可以在分析方法结束时校验斑点的存在、位置和/或完整性。这些对照标记物在此被认定为“耐受性对照标记物”。

表述“分析方法”和“用于检测至少一种被分析物的方法”在此是同义的。

术语“产生”、“产物”或“制备”用于任何形式的信号，并且尤其是任何形式的电磁辐射，不管它涉及放射性的信号、光发射或是吸光度。

当检测的信号是荧光发光信号时，“产生的信号”尤其是“发射的信号”，且“产生信号”和“信号的产生”则分别意指“发射信号”和“信号的发射”。

在本申请中，“至少一种被分析物的检测”(或“检测至少一种被分析物”)意指一种或多种所述被分析物的存在的检测(或检测其存在)，和/或一种或多种所述被分析物的量的检测(或对其量化)。

在本发明的意义内，“分析方法结束”意指在已经在以下物质的存在下安放斑点之后，待分析的样品、配体或用于检测被分析物的配体、如果可用的话与被分析物的检测配体偶联的检测标记物的至少一种(第一)报道物、和如果可用的话与所述第一报道物偶联的检测标记物的至少一种(第二)报道物。

出人意料地，发明人已经因此显示了耐受性对照标记物，其可以被固定在固体支持体上，不干扰分析方法本身，并且在实施了分析方法的不同步骤之后保持完全可检测(尤其是因为它们保持至少部分地被固定在固体支持体上)。当在分析方法结束时由耐受性对照标记物产生的信号使得可以限定满足斑点的品质判据(尤其是存在、位置和/或完整性)的斑点时，则可以在此斑点检测对应于被分析物的信号。尤其是，根据本发明的耐受性对照标记物可以用于以下分析方法中：其中通过由化学发光(优选经由过氧物酶与鲁米诺底物和/或鲁米诺的类似物(例如异鲁米诺)和/或它们的衍生物之一的反应)发射的信号，检测至少一种被分析物的存在。

根据本发明的耐受性对照标记物具有以下优点：使得可以在分析方法结束时，且不仅在所述固体支持体的制备方法结束时，对固体支持体的斑点进行对照。

因此，本发明使得可以向使用者保证结果。尤其是，本发明使得可以保证阴性结果的确是由于在样品中没有被分析物造成的结果，而不是例如由于没有斑点或斑点的读取中的移位造成的结果。换言之，本发明使得可以消除与斑点的缺陷(即，不符合品质判据的斑点)有关的和/或与分析方法结束时斑点的读取缺陷有关的假阴性结果(也称作“假阴性”)，所述假阴性结果在传统使用的多重分析方法(其中例如基于由阳性对照斑点发射的信号理论地调节读取栅格)中不可检测。本发明也使得可以保证阳性结果的确是由于在样品中存在被分析物造成的结果。例如，对应于在斑点的理论位置(由理论读取栅格限定，例如，基于由对照斑点发射的信号受到调节)上的被分析物的标记物，可能检测到信号，而在那个位置没有斑点；这样的假阳性结果(也称作“假阳性”)则会在传统分析方法的实施期间发生；通过在固体支持体的斑点中使用根据本发明的耐受性对照标记物，在斑点的理论位置将检测不到对应于所述耐受性对照标记物的信号，并且分析方法将导致没有造成结果，即使是在那个位置检测到了对应于被分析物的标记物的信号。

本发明的另一个优点在于，实际上，耐受性对照标记物使得可以在分析方法结束时限定读取栅格。而在根据固体支持体的物理参数限定的理论读取栅格和在使用所述固体支持体的分析方法结束时限定的读取栅格之间可能有差异。这些差异可能是例如预期的理论斑点栅格与在分析方法结束时实际获得的栅格(一个或若干个斑点)之间的移位造成的结果；因此这些移位通过在本申请中描述的装置修正。因此，更可靠的是，在分析方法结束时，优选利用与用于检测由被分析物的至少一种检测配体的检测标记物产生的信号的检测装置相同的检测装置，并且优选伴随地，限定固体支持体的读取栅格。因此，由于用于检测被分析物的读取栅格的限定来自在分析方法结束时检测到的斑点的位置，根据本发明的耐受性对照标记物也使得可以通过改善被分析物检测的灵敏度，确保在斑点上的分析方法的结果。

最后，其中斑点包含根据本发明的耐受性对照标记物的固体支持体的制备容易进行，并且不增加任何附加的步骤，耐受性对照标记物例如能够与感兴趣的化合物如捕捉配体简单地混合在要沉积形成斑点的溶液中。

本发明尤其涉及一种用于确保在样品中的至少一种被分析物的检测的固体支持体，其中意在检测被分析物的至少一个斑点包含至少一种耐受性对照标记物和被分析物的至少一种捕捉配体，涉及一种用于制备这样的固体支持体的方法，并且涉及一种使用所述固体支持体的用于至少一个样品中的至少一种被分析物的安全检测方法。

“至少一”在本申请的含义内指的是一或若干，若干尤其意味着二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五或多于十五。类似地，在本申请中，“至少”意味着x或多于x，并且尤其是x+1、x+2、x+3、x+4等，“x”是大于或等于2的整数，例如2或3。

一种特别优选的根据本发明的分析方法是多重分析方法。

本发明也涉及用于选择耐受性对照标记物的方法，以及至少一种耐受性对照标记物在意在检测被分析物的至少一个斑点中用于确保用于检测在样品中的至少一种被分析物的方法的用途。

本发明也提供合适的装置，用于改善的在样品中的至少一种被分析物的检测。

样品

待分析的样品优选是生物样品。

生物样品可以是生物流体，如血液、血液衍生物(如血浆或血清)、尿液、脑脊髓液、唾液、或它们的组合，或组织样品，如由活组织检查获得的组织、细胞、细胞组、植物提取物，或它们的组合。

血液衍生物指的是任何从血液样品获得的产物，尤其是流体。

待分析的样品也可以是培养基和/或培养物上清液。

在被分析之前，样品可以经历一个或若干个前处理步骤，如稀释、离心、热处理、细胞溶解、增溶和改性(例如通过一种或若干种离液剂、一种或若干种还原剂和/或通过加热)、萃取、PCR(聚合酶链反应)、添加未被标记的检测配体、或它们的组合。对于执行中和试验来说，添加未被标记的检测配体尤其有用。

样品也可以是至少两种样品的混合物，所述样品可以是相同性质或不同性质的。

不同性质的样品的混合物的实例是血浆和尿液的混合物、血液和血浆的混合物、血清和血浆的混合物、或血液、血清和血浆的混合物。

一种优选的根据本发明的样品是血液和/或血液衍生物(尤其是血浆和/或血清)的样品或样品混合物。

被分析物

在样品中待检测的被分析物可以是人们希望在样品中检测和/或量化的任何类型的天然的或合成的化合物。

被分析物可以是例如蛋白、肽、糖蛋白、碳水化合物、细胞、细胞器、病毒或核酸。

细胞可以是动物细胞、植物细胞、细菌细胞、原生动物、后生动物细胞、酵母细胞或真菌细胞。

核酸指代通过磷酸二酯键连接的核苷的聚合物，如脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或它们的类似物，如硫代膦酸酯或硫代酯，以单链或双链的形式。

被分析物或多种被分析物的至少一种因此例如选自由以下各项组成的组：抗原、抗体、抗体片段、半抗原、激素、激素受体、酶或核酸。

一种或多种被分析物优选选自由以下各项组成的组：抗原、抗体、抗体片段、半抗原、激素、激素受体和酶。

在本申请的含义内，“抗原”指的是天然的、重组的或合成的分子，其被免疫系统的抗体或细胞所识别并且当它在对宿主的免疫系统合适的条件下存在时能够引起免疫应答。

抗原可以是分子，尤其是多肽，包括或由以下构成：至少一个可以是线性或构象的表位。术语“线性表位”指的是能够结合至针对所述抗原的抗体分子的多肽，尤其是包含或由以下构成的肽：3至15个氨基酸、更通常5至15个氨基酸，优选至少6、8、10或12个氨基酸。术语“构象表位”指的是被抗体所识别并且由空间中的若干氨基酸的并列所决定的三维结构，所述若干氨基酸在此抗体所针对的蛋白质的肽序列(或多肽)中可以是不连续的，但是所述若干氨基酸由于多肽链的折叠而使它们自己在空间中相互靠近，并且因此可以形成可以被抗体识别的图案。

在本申请的含义内，抗原是例如蛋白质(尤其是天然的蛋白质或重组的蛋白质)、肽(例如，合成肽)、糖蛋白、碳水化合物或脂质；所述肽可以与载体分子有关联或没有关联。

“载体分子”尤其指的是蛋白质或碳水化合物载体分子，尤其是载体蛋白质。载体分子可以是多肽(尤其是蛋白质或肽)，其可以是或可以不是天然的(例如，重组的蛋白质或合成的肽)，官能化的聚合物(如葡聚糖、多糖或聚赖氨酸)、混合的共聚物(尤其是不同氨基酸的共聚物，例如赖氨酸-酪氨酸共聚物)。载体分子可以是抗体(尤其是单克隆抗体或多克隆抗体)，例如免疫球蛋白(也称作Ig)。

一种实例载体分子或蛋白质是BSA(牛血清白蛋白)。

在本申请中，“半抗原”在此指的是能够被免疫系统所识别的具有低分子量的分子，但是其仅当它偶联到载体分子时才是免疫原性的。

被分析物优选是使得可以诊断受试者中可以是或可以不是病理性的病况或者诊断发展可以是或可以不是病理性的病况的风险的化合物。非病理性的病况的实例是妊娠。

受试者可以是人类、非人类动物或植物。非人类动物优选是哺乳动物，如猫、狗、猴、兔、小鼠或大鼠。

术语“人类”被广泛使用，并且尤其指代任何年龄的男人或女人，如婴儿、儿童、青少年、成人或老人。

在一个优选的实施方案中，至少一种被分析物从抗原或抗体中选择。

当被分析物或多种被分析物中的一种是抗原时，它优选是使得可以诊断传染的抗原，例如由病毒、细菌、真菌、原生动物或后生动物引起的传染。

当被分析物或多种被分析物中的一种是抗体时，它优选是使得可以诊断传染的抗体，例如由病毒、细菌、真菌、原生动物或后生动物引起的传染。

在另一个优选的实施方案中，至少一种被分析物是核酸。

在另一个优选的实施方案中，一种或多种被分析物不是核酸。

当被分析物或多种被分析物中的一种是核酸时，它优选是使得可以诊断传染(例如由病毒、细菌、真菌、原生动物或后生动物引起的传染)的核酸。

典型地，这可以包括以下各项的一种或若干种抗原和/或一种或若干种抗体和/或一种或若干种特异性核酸：

-病毒，如HIV(人类免疫缺损病毒)，尤其是HIV-1或HIV-2，HBV(乙型肝炎病毒)，HCV(丙型肝炎病毒)，HPV(人乳头瘤病毒)，HTLV(人类嗜T淋巴细胞病毒)，尤其HTLV-I或HTLV-II，

-寄生虫，如可以在人类或非人类动物内引起以下各项的寄生虫：弓形体病(尤其是弓形虫(Toxoplasma gondii))，疟疾(尤其是疟原虫属(Plasmodium genus)的寄生虫，例如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)，间日疟原虫(Plasmodium vivax)，卵形疟原虫(Plasmodium ovale)，三日疟原虫(Plasmodium malariae)或诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi))或查加斯(Chagas)病(尤其是克鲁斯锥虫(Trypanosoma cruzi))，或

-细菌，如能够在人类或非人类动物内引起以下各项的细菌：梅毒(苍白密螺旋体(Treponema pallidum))或莱姆(Lyme)病(尤其是来自包柔氏螺旋体属(Borrelia genus)的细菌)。

“寄生虫”在此指的是充当相对于身体的寄生虫并且引起寄生虫病的后生动物或原生动物。在本发明的含义内的寄生虫因此不是病毒、细菌或真菌。

被分析物或多种被分析物中的至少一种也可以是用于疾病的标记物，如心血管病的标记物或糖尿病标记物，疾病如肝炎的进展的标记物，由病毒、细菌、真菌或寄生虫引起的传染的进展的标记物，对治疗例如对抗病毒治疗、抗生素治疗或癌症治疗的耐性的标记物。

可以在多重分析方法期间，在相同的样品或相同的样品混合物中同时检测若干种(例如，二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五或多于十五种)本申请中所述的被分析物。这可以使得可以在相同的样品或相同的样品混合物中诊断受试者中一种或若干种传染或疾病、传染或疾病的进展、病况(病理性的或不是病理性的)、发展病况(病理性的或不是病理性的)的风险或对治疗的耐性的标记物。

在多重分析方法期间检测的被分析物可以是相同性质的(例如仅为抗体、仅为抗原或仅为核酸)或不同性质的(例如，至少一种抗原和至少一种抗体)。

捕捉配体

捕捉配体是感兴趣的化合物的特异性分子。

捕捉配体优选特异性针对在样品中待检测的被分析物。它通常包括抗体、抗原、肽、碳水化合物、脂质或核酸。

在一个有利的实施方案中，捕捉配体不是核酸。一种或多种捕捉配体例如选自由以下各项组成的组：抗体、抗原、肽、碳水化合物和脂质。

捕捉配体在斑点处被固定到固体支持体的表面。

在一个优选的实施方案中，一种或多种捕捉配体是抗体、抗原或核酸。

在一个更优选的实施方案中，一种或多种捕捉配体是抗体或抗原。

当捕捉配体或多种捕捉配体中的一种是抗体时，它例如包括单克隆抗体或多克隆抗体。

检测配体

检测配体是感兴趣的化合物的特异性分子。它尤其使得可以检测固定到捕捉配体的感兴趣的化合物。

被分析物的检测配体特异性针对在样品中的待检测的被分析物。它尤其使得可以检测固定到捕捉配体的被分析物。

检测配体可以是抗体、抗原、肽、碳水化合物、脂质或核酸。它优选是抗体或抗原。

在另一个实施方案中，一种或多种检测配体是核酸。

在另一个实施方案中，检测配体不是核酸。一种或多种检测配体例如选自由以下各项组成的组：抗体、抗原、肽、碳水化合物和脂质。

当检测配体或多种检测配体中的一种是抗体时，它例如包括单克隆抗体或多克隆抗体。

检测配体或多种检测配体中的一种优选是被标记的检测配体，即，向其附接了检测标记物(其可以例如是生物素或过氧物酶)的检测配体。检测标记物共价或非共价地，优选共价地附接(即，偶联)到检测配体。检测配体或多种检测配体中的一种可以与直接或间接检测标记物偶联。

当检测配体是未被标记的时，可以通过使用所述检测配体的特异性的被标记的抗体，完成它的检测。

检测配体与所用的捕捉配体或所用的多种捕捉配体中的一种可以是同样的，区别在于检测标记物的任何存在，并且/或者在与被捕捉配体或多种捕捉配体中的一种结合的区域相同的区域连结到它特异性针对的被分析物，尤其是当它特异性针对的被分析物处于具有至少两个同样的结合区域的配合物的形式时。因此，当人们希望检测的被分析物中的一种是抗体时，作为所述被分析物的捕捉配体和检测配体，可以使用所述抗体的相同的特异性抗原或包括至少一个允许被二价抗体识别的共享区域(至少一个共享的表位)的两种不同的抗原。

捕捉配体和检测配体也可以特异性针对被分析物处的分开的区域。

在一个特别的实施方案中，特异性针对同一被分析物(例如，抗原)的检测配体和捕捉配体(例如，抗体)不结合到所述被分析物的相同位置。例如，检测配体可以结合到它特异性针对的所述被分析物的区域，该区域与捕捉配体的结合区域分开，例如，从而避免捕捉配体和检测配体关于它们特异性针对的化合物由于空间位阻导致的竞争。

检测配体的检测标记物

与检测配体偶联的检测标记物可以是直接标记物或间接标记物。

直接标记物是其信号可以被直接检测(即不需要在前添加报道物)的标记物。

直接标记物例如选自由以下各项组成的组：放射性同位素、荧光团、来自周期表的重元素如镧系元素、发光化合物、过渡金属如钌、显色剂、以及有色的、荧光的或发光的纳米粒子。

“发光”化合物可以是电致发光化合物、热致发光化合物或化学发光化合物。在一个优选的实施方案中，发光化合物是化学发光化合物。

可以用作直接标记物的一种实例发光化合物(更具体地，热致发光化合物)由二氧化硅纳米粒子组成，所述二氧化硅纳米粒子包含(例如掺杂有)二氧杂环丁烷化合物的分子，尤其是1，2-二氧杂环丁烷化合物，或二氧杂环丁烷化合物的衍生物，例如，1，2-二氧杂环丁烷的衍生物。

间接标记物是这样的标记物：对于其来说，信号的检测需要在前添加报道物(也称作第一报道物)，并且，如果所述报道物它自己与间接检测标记物偶联，需要添加与所述第一报道物偶联的间接检测标记物的第二报道物。

报道物是间接标记物的底物或是特异性结合到间接标记物的分子，所述分子它自己是直接或间接标记物或它自己偶联到直接或间接标记物。

间接标记物例如选自由以下各项组成的组：酶、配体-受体对的配体、配体-受体对的受体、半抗原、抗原和抗体。

配体-受体对的配体或受体是例如生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或地高辛配基(digoxigenin)。

优选的根据本发明的间接标记物是酶，优选通过与底物的反应产生发光化合物的酶。

间接标记物的信号的检测需要在前添加所述间接标记物的报道物。

酶的报道物是例如所述酶的底物。

生物素的报道物是，例如，抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白，优选与直接标记物或间接标记物如酶或催化剂偶联。

生物素的报道物优选与直接或间接检测标记物如酶或催化剂偶联。

实例酶是过氧物酶，例如辣根过氧物酶(HRP或POD)、碱性磷酸酶或萤光素酶。

一种优选的根据本发明的生物素报道物是与过氧物酶、优选辣根过氧物酶偶联的链霉抗生物素蛋白。则生物素的信号的检测需要添加与过氧物酶偶联的链霉抗生物素蛋白，随后添加过氧物酶的底物。

在此优选的实施方案中，检测配体或多种检测配体中的一种与选自过氧物酶或生物素的直接或间接检测标记物偶联。

当被分析物是核酸时，检测标记物或多种检测标记物中的一种可以通过荧光检测到：例如通过使用利用荧光团的直接或间接标记，生物发光，优选通过化学发光，例如通过使用利用发光化合物的直接标记或利用通过与底物的反应产生发光化合物的酶(尤其是过氧物酶)的间接标记。

当被分析物是蛋白质型的化合物时，检测标记物或多种检测标记物中的一种优选通过发光检测到：例如通过使用利用蛋白质型的化合物(尤其是化学发光化合物)的直接或间接标记，或利用通过与底物的反应产生发光化合物的酶作为报道物的间接标记。

在本发明的一个特别的实施方案中，所用的检测标记物或多种检测标记物中的一种具有作为底物的：鲁米诺、异鲁米诺、吖啶、腔肠荧光素(coelenterazine)、二氧杂环丁烷或过氧草酸化合物，或它们的衍生物的一种，且尤其是在出版物Dodeigne C.等人(2000)，Talanta 51，415-439，“作为诊断工具的化学发光.回顾(Chemiluminescence as diagnostic tool.A review)”中描述的化合物。

在一个特别的实施方案中，所用的检测标记物或多种检测标记物中的一种具有作为底物的鲁米诺、鲁米诺的类似物(例如异鲁米诺)、或它们的衍生物中的一种。

“鲁米诺”指的是3-氨基苯二甲酰肼，也称作5-氨基-2，3-二氢-酞嗪-1，4-二酮。鲁米诺的原式是C₈H₇N₃O₂。作为实例，可以使用在实施例中描述的ELISTAR ETA C Ultra ELISA(Cyanagen，Italy)底物。

“异鲁米诺”指的是4-氨基苯二甲酰肼。

鲁米诺或鲁米诺的类似物的衍生物优选分别是通过所有可能的一种或多种修改(例如，化学的和/或酶的)从鲁米诺或鲁米诺的类似物获得的分子。鲁米诺或鲁米诺的类似物的衍生物例如是过氧物酶的底物，所述过氧物酶与鲁米诺或鲁米诺的类似物的衍生物的反应使得可以产生化学发光化合物。

异鲁米诺的衍生物可以是例如氨基乙基异鲁米诺(或AEI)、氨基乙基乙基异鲁米诺(或AEEI)、氨基丁基异鲁米诺(或ABI)、氨基丁基乙基异鲁米诺(或ABEI)、氨基戊基乙基异鲁米诺(或APEI)、氨基己基异鲁米诺(或AHI)、氨基己基乙基异鲁米诺(或AHEI)、氨基辛基甲基异鲁米诺(或AOMI)或氨基辛基乙基异鲁米诺(或AOEI)，如在出版物Dodeigne C.et al(2000)，Talanta 51，415-439，“作为诊断工具的化学发光.回顾(Chemiluminescence as diagnostic tool.A review)”中所述。

在本发明的一个特别的实施方案中，可以以组合物(或制剂)的形式贡献“鲁米诺、鲁米诺的类似物(例如异鲁米诺)、吖啶、腔肠荧光素、二氧杂环丁烷或过氧草酸化合物，或它们的衍生物的一种”，所述组合物包含所述鲁米诺、吖啶、腔肠荧光素、二氧杂环丁烷或过氧草酸化合物，或它们的衍生物的一种。

耐受性对照标记物

本发明基于使用一种或若干种耐受性对照标记物(例如，多种耐受性对照标记物的混合物)，所述耐受性对照标记物使得可以对在固体支持体的表面上存在的一个或多个斑点的品质进行对照，所述品质尤其是在固体支持体的表面上存在的一个或多个斑点的存在、位置和/或完整性，此对照(或这些对照中的一个)能够在进行的分析方法结束时完成。

耐受性对照标记物是能够被检测(例如通过产生信号)的化合物。产生的信号可以是例如放射性信号或光信号。它也可以包括通过光吸收被检测到的对照标记物(例如，着色的对照标记物)。

光信号对应于光的发射，尤其是在给定的波长范围内的。

耐受性对照标记物可以例如是通过荧光、磷光或发光(尤其是电致发光、热致发光或化学发光)发射光的标记物。

当耐受性对照标记物或多种耐受性对照标记物中的一种是通过发光发射光的标记物时，它优选通过化学发光发射光。

一种优选的耐受性对照标记物是通过荧光发射光的标记物。

正如它的名字指出的，根据本发明的耐受性对照标记物是耐受性的。

在此，“耐受性对照标记物”指的是其信号在分析方法结束时被检测到的标记物。耐受性对照标记物尤其是这样的标记物：在固体支持体的制备方法期间，并且也在实施所述支持体的分析方法期间，所述标记物全部或至少部分地保持被固定在固体支持体的表面上的斑点处，并且所述标记物能够在分析方法结束时产生可检测的信号，即，包括在被分析物的检测配体的检测标记物的存在下，和/或当一种或若干种间接检测标记物的情况时在一种或若干种报道物的存在下。

在表述“能够在分析方法结束时产生可检测的信号的标记物”中，“能够”意指，当所述分析方法已在没有所述斑点的劣化的情况下进行时，在斑点中存在的耐受性对照标记物在分析方法结束时在那个斑点处产生可检测的信号。

在分析结束时，表述“能够被检测”、“其信号被检测到”、“能够产生可检测的信号”或“产生可检测的信号”意指(尤其是在耐受性对照标记物是荧光团的情况下)“被检测的信号”(由耐受性对照标记物产生的并且在相应的像素区域处在图像传感器上测量的信号)减去(即从它减去)周围像素的平均信号大约比周围像素信号的水平高三个标准差。当检测到的信号减去周围像素的平均信号达到比周围像素的信号的水平高至少三个标准差时，所述检测到的信号被认定为“可检测的信号”。

在本发明的含义内，对照标记物因此对于伴随在分析方法期间使用的不同试剂(如一种或多种检测配体、一种或多种报道物、一种或多种底物、样品、一种或若干种稀释剂)的洗涤和温育步骤有耐性。

尤其是，根据本发明的耐受性对照标记物对于被分析物的检测配体的一种或多种检测标记物的使用有耐性，如果被分析物的检测配体的一种或多种检测标记物的(第一)报道物可用的话并且如果与所述第一报道物偶联的间接标记物的(第二)报道物可用的话。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的耐受性对照标记物对以下物质的使用有耐性：一种或若干种酶，尤其是碱性磷酸酶和/或过氧物酶，以及所述一种或多种酶的一种或多种底物。

一种优选的根据本发明的对照标记物对选自由以下各项组成的组的底物的使用有耐性：鲁米诺、异鲁米诺或它们的衍生物的一种。

在一个有利的实施方案中，根据本发明的耐受性对照标记物也对于包含选自由以下各项组成的组的底物的组合物(或制剂)的使用有耐性：鲁米诺、异鲁米诺或它们的衍生物的一种。所述组合物可以例如包含过氧化氢和/或对于鲁米诺、异鲁米诺或它们的衍生物的一种的功效有贡献的化学分子(或辅助因子)。

“对化合物的使用有耐性”或“对化合物有耐性”在此意指对照标记物在分析方法期间对所述化合物的使用有耐性。尤其是，对照标记物对于在所述化合物的存在下被安放有耐性。

为了确定给定的化合物是否是本发明的含义内的耐受性对照标记物，可以实施包括以下步骤的方法：

a)在固体支持体的表面上沉积所述化合物，以形成至少一个斑点，

b)优选地将固体支持体的表面饱和，

c)任选地将固体支持体的表面干燥，

d)任选地进行一个以上洗涤步骤，

e)任选地在检测配体的存在下安放斑点，

f)任选地进行一个以上洗涤步骤，

g)任选地在至少一种报道物或至少一种酶(例如可以或不可以与报道物偶联的过氧物酶)的存在下安放一个或多个斑点，

h)任选地进行一个以上洗涤步骤，

i)在至少一种底物(所述底物优选是将用在人们希望在其中实施所述耐受性对照标记物的分析方法中的底物)的存在下安放一个或多个斑点，所述底物优选过氧物酶的底物，例如鲁米诺，

i)在一个或多个斑点处测量由所述化合物产生的信号，和

k)如果在步骤j)测得的信号是可检测的信号，认为所述化合物是耐受性对照标记物。

“可检测的信号”尤其定义如上。

在步骤j)中测量的信号的类型取决于被测试的化合物。基于被测试的化合物，本领域技术人员知道什么类型的信号必须被检测和如何检测它。

在步骤e)中的检测配体或多种检测配体中的一种可以与生物素型的检测标记物偶联，步骤g)中的报道物或多种报道物中的一种可以是与酶(例如过氧物酶)偶联的链霉抗生物素蛋白型的报道物，和/或步骤i)中的底物中的一种可以是所述酶的底物，例如鲁米诺、鲁米诺的类似物、和/或鲁米诺或鲁米诺的类似物的衍生物。

出人意料地，发明人因此已经显示了已经简单沉积在固体支持体的表面上的、与感兴趣的化合物例如捕捉配体混合从而形成斑点的对照标记物的耐性属性。因此，在本发明的一个特别的实施方案中，根据本发明的耐受性对照标记物不共价地固定到固体支持体的表面和/或不共价地偶联到到捕捉配体。

最后，在本发明的一个优选实施方案中，耐受性对照标记物很小干扰或优选完全不干扰由在分析方法中使用的被分析物的检测配体的检测标记物产生的信号。

“由被分析物的检测配体的检测标记物产生的信号”指的是由被分析物的检测配体的检测标记物它自己产生的信号或对应于检测配体的检测标记物的信号。事实上，例如，在酶或其他间接标记物类型的情况下，信号不由被分析物的检测配体的检测标记物它自己产生，而是通过报道物产生或由报道物(例如酶)与它的底物的反应产生的化合物产生；在这种情况下，此信号对应于被分析物的检测配体的检测标记物。

表述“很小干扰由被分析物的检测配体的检测标记物产生的信号的耐受性对照标记物”意指，对使用者来说，分析方法的功能性不受耐受性标记物的存在的影响，尤其是灵敏度的降低小于40％，优选小于35％，更优选小于30％，再更优选小于25％。根据一个特别的实施方案，此表述进而意指特异性没有劣化。

表述“特异性没有劣化”意指阈值的增加小于或等于40％，优选小于或等于35％，更优选小于或等于30％，且再更优选小于或等于25％。

阈值是在分析方法结束时对阴性样品获得的信号的平均加上12倍这些样品的信号的标准差。

耐受性对照标记物可以是中性的，或带正电或带负电的。

在本申请中，“带正电或带负电的分子”意指包括分别是正或负的整体电荷的分子，尤其是整体上分别包括一个、两个、三个、四个或多于四个正或负的电荷的分子。

耐受性对照标记物可以包含载体分子或与载体分子例如蛋白质，如BSA偶联。

当耐受性对照标记物“包含”载体分子时，它通常包含对照标记物(例如，荧光团)和载体分子(例如，BSA)或由它们组成，所述对照标记物与所述载体分子偶联。此偶联使得可以使在没有偶联的情况下不会有耐性的对照标记物有耐性。

在对照标记物或耐受性对照标记物与载体分子之间的偶联由耐受性对照标记物和载体分子之间的共价或非共价键(优选共价键)造成。

能够共价地或非共价地与对照标记物或耐受性对照标记物偶联的载体分子例如选自由以下各项组成的组：BSA、免疫球蛋白(也称作Ig)、葡聚糖、聚赖氨酸和混合的共聚物，尤其是不同的氨基酸的共聚物(例如，赖氨酸-酪氨酸共聚物)。

能够共价地或非共价地与对照标记物或耐受性对照标记物偶联的载体分子的其他实例是寡核苷酸或多核苷酸，尤其是DNA或RNA。

根据本发明的耐受性对照标记物可以是例如在如下定义的用于耐受性对照标记物的选择方法结束时选择的标记物。

耐受性对照荧光团

一种优选的根据本发明的耐受性对照标记物是荧光团。在这种情况下，它称作耐受性对照荧光团。

荧光团，也称作荧色物或荧光分子，是能够在用光能激发之后发射荧光的物质，尤其是化学或蛋白物质(或多肽物质)。

荧光团通常包含若干个共轭的芳族核心和/或具有一个或若干个π键的平面且环形的分子。

荧光团可以是荧光蛋白质，例如B-藻红蛋白。

根据本发明的耐受性对照标记物，尤其是耐受性对照荧光团，优选其特征在于它的激发光谱与被分析物的检测配体的检测标记物的发射光谱或对应于的被分析物的检测配体(其用在分析方法中)的检测标记物的发射光谱不交叠，并且特征在于它的发射光谱与被分析物的检测配体的检测标记物的发射光谱或对应于被分析物的检测配体(其用在分析方法中)的检测标记物的发射光谱不交叠，或部分交叠。

“对应于检测配体的检测标记物的发射光谱或激发光谱”是例如以下物质的发射光谱或激发光谱：与检测配体偶联的间接检测标记物的间接标记物或报道物，与(尤其是检测配体的间接检测标记物的)报道物偶联的间接检测标记物的报道物，或是由酶型报道物与它的底物的反应产生的化合物。

在根据本发明的耐受性荧光团的情况下，激发光谱可以对应于吸收光谱。

优选的根据本发明的耐受性对照标记物，尤其是优选的耐受性对照荧光团，是特征如下的荧光团：它的激发光谱与鲁米诺、它的类似物中的一种(尤其是异鲁米诺)、和/或它们的衍生物的一种的发射光谱不交叠，并且它的发射光谱与鲁米诺、它的类似物中的一种(尤其是异鲁米诺)、和/或它们的衍生物的一种的发射光谱不交叠或仅部分交叠。

“鲁米诺、它的类似物中的一种(尤其是异鲁米诺)、和/或它们的衍生物的一种的发射光谱”指的是从鲁米诺、它的类似物中的一种(尤其是异鲁米诺)、和/或它们的衍生物的一种与过氧物酶的反应形成的化学发光化合物的发射光谱。

优选地，根据本发明的耐受性对照标记物，尤其是耐受性对照荧光团，其特征在于，它的激发光谱与鲁米诺、异鲁米诺或它们的衍生物的一种的发射光谱不交叠。

当根据本发明的耐受性对照标记物尤其是耐受性对照荧光团的发射光谱与一种或若干种检测配体的检测标记物的发射光谱或对应于一种或若干种检测配体的检测标记物的发射光谱部分交叠时，使用滤光器使得可以消除由所述检测标记物发射的波长从而仅保留由荧光团发射的特异性信号，和/或使用滤光器使得可以消除由所述荧光团发射的波长从而仅保留由所述检测标记物发射的特异性信号，是有利的。

在一个优选的实施方案中，在以下两项之间：

-根据本发明的一种或多种耐受性对照标记物，尤其是一种或多种耐受性对照荧光团，和

-检测配体的一种或多种检测标记物和/或产生对应于在分析方法中使用的检测配体的一种或多种检测标记物的信号的一种或多种化合物，

尤其是在根据本发明的一种或多种耐受性对照标记物(尤其是一种或多种耐受性对照荧光团)和通过鲁米诺、它的类似物中的一种(例如异鲁米诺)、和/或它们的衍生物的一种与过氧物酶的反应获得的发光化合物之间，没有通过共振的能量转换。

在一个有利的实施方案中，根据本发明的一种或多种耐受性对照标记物(尤其是一种或多种耐受性对照荧光团)具有如下的激发波长范围和发射波长范围：严格大于鲁米诺、它的类似物中的一种(例如异鲁米诺)、和/或它们的衍生物的一种的发射波长范围，或严格小于鲁米诺、它的类似物中的一种(例如异鲁米诺)、和/或它们的衍生物的一种的发射波长范围。

作为实例，当使用鲁米诺作为底物时，根据本发明的耐受性对照标记物，尤其是优选的根据本发明的耐受性对照荧光团，不发射425nm左右、尤其是375nm至550nm、优选375nm至580nm、更优选350nm至580nm的光。换言之，当使用鲁米诺作为底物时，优选的根据本发明的耐受性对照荧光团发射在以下范围之外的波长的光：375nm至550nm、375nm至580nm或350nm至580nm。它可以仅发射波长小于(或小于或等于)375nm、370nm、360nm或350nm的光，或波长大于(或大于或等于)550nm、560nm、570nm、580nm、590nm或600nm的光。

表述“值X至值Y”意指包括边界X和Y。

在一个特别的实施方案中，出人意料地，在由根据本发明的接收对照标记物发射的信号的检测中，且尤其是通过根据本发明的耐受性对照荧光团的检测中，含有鲁米诺、鲁米诺的类似物和/或它们的衍生物的一种的反应介质的碱性pH，在反应介质中过氧化物、一种或若干种有利于电子转移的试剂和酰化催化剂的存在，都不会引起问题的起源的光谱的移位。

根据本发明的一个实施方案，根据本发明的耐受性对照标记物，尤其是根据本发明的耐受性对照荧光团，其吸收窗不包含对应于由检测配体的检测标记物发射的信号的波长范围，并且尤其不包含鲁米诺的发射波长范围。例如，一种优选的根据本发明的耐受性对照荧光团不吸收375至530nm、375至550nm或350至580nm(含)的波长。因此，可以例如使用仅吸收小于(或小于或等于)375、370、360或350nm的波长的荧光团，或仅吸收大于(或大于或等于)530、540、550、560、570、580、590或600nm的波长的荧光团。

根据一个特别的实施方案，耐受性对照标记物可以是中性的荧光团、带正电的荧光团或带负电的荧光团或荧光蛋白质，所述荧光团任选地偶联到载体分子，例如蛋白质如BSA。

在一个优选的实施方案中，耐受性对照荧光团包含至少一个带正电的官能团，且尤其是至少一个胺官能。

根据一个特别的实施方案，耐受性对照标记物包含至少一个荧光团和至少一个载体分子(例如，BSA)或由它们组成，所述至少一个荧光团偶联到所述至少一个载体分子，并且所述至少一个荧光团例如能够是中性的、带正电的或或带负电的荧光团、或荧光蛋白质。

载体分子尤其是如上文中在“被分析物”段落中定义的。

耐受性对照荧光团例如选自由以下各项组成的组：香豆素、若丹明、carbopyronine、噁嗪、苯并吡喃鎓、藻红蛋白和它们的衍生物。所述荧光团任选地偶联到载体分子，例如蛋白质如BSA。

耐受性对照荧光团例如选自由以下各项组成的组：香豆素、若丹明、carbopyronine、噁嗪、苯并吡喃鎓衍生物、它们的衍生物、和藻红蛋白。耐受性对照荧光团例如从在申请WO00/64986 A1中描述的和/或由公司Atto-Tec市售的化合物中选出。

一种优选的耐受性对照荧光团例如选自由以下各项组成的组：carbopyronine、噁嗪、噁嗪衍生物、苯并吡喃鎓衍生物、和藻红蛋白。

另一种优选的耐受性对照荧光团选自由以下各项组成的组：carbopyronine衍生物、噁嗪、噁嗪衍生物、苯并吡喃鎓衍生物、和藻红蛋白。

一种再更优选的耐受性对照荧光团例如选自由以下各项组成的组：carbopyronine、苯并吡喃鎓衍生物、和藻红蛋白。

另一种再更优选的耐受性对照荧光团例如选自由以下各项组成的组：carbopyronine衍生物、苯并吡喃鎓衍生物、和藻红蛋白。

一个实例包括由公司Atto-Tec市售的Atto 633carbopyronine和它的衍生物尤其是胺衍生物，以及苯并吡喃鎓的衍生物(像是由公司Dyomics市售的那些)，尤其是当它们与载体分子(例如BSA)偶联时的Dye 634或Dye 630，或与载体(例如BSA)偶联或未偶联的Dye 634或Dye 630的胺衍生物。

一种优选的根据本发明的carbopyronine是包含以下基础结构的分子：

能够用作耐受性对照荧光团的carbopyronine，像是来自Atto 633的胺衍生物，例如具有以下特性：最大吸收波长＝629nm，在最大吸收波长处的摩尔吸收系数＝1.3x 10⁵M^-1cm^-1，最大发射波长＝657nm，和量子效率＝64％。

能够用作耐受性对照荧光团的苯并吡喃鎓衍生物例如具有以下特性：

-最大吸收波长(乙醇中)：635nm，

-最大发射波长(乙醇中)：658nm，和

-在最大吸收波长处的摩尔吸收系数：200,000M^-1cm^-1。

这例如包括具有下式的称为Dye 634的荧光团(以其与载体分子(例如BSA)偶联的形式)：

Dye 634也可以以其胺形式(Dye 634-胺)用作耐受性对照荧光团。它可以与载体分子(且尤其是BSA)偶联或未偶联使用。

还另一种能够用作耐受性对照荧光团的苯并吡喃鎓衍生物例如具有以下特性：

-最大吸收波长(乙醇中)：636nm，

-最大发射波长(乙醇中)：657nm，和

-在最大吸收波长处的摩尔吸收系数：200,000M^-1cm^-1。

这例如包括Dye 630(以其与载体分子(例如BSA)偶联的形式)。

Dye 630具有下式：

Dye 630也可以以其胺形式(Dye 630-胺)使用，其与载体分子例如BSA偶联或未偶联。

作为耐受性对照标记物的酶

根据本发明的耐受性对照标记物的另一个实例是酶，例如通过与所述酶的底物的反应产生发光化合物的酶。

优选地，发光化合物是化学发光化合物。

能够用作根据本发明的耐受性对照标记物的酶例如是碱性磷酸酶或萤光素酶。

碱性磷酸酶底物是例如Lumi-Phos 530或Lumi-Phos底物，更多由Lumigen市售。

萤光素酶底物是例如萤光素或腔肠荧光素(coelenterazine)底物。

当耐受性对照标记物是产生发光化合物的酶时，对应于耐受性对照标记物的被检测的信号是由通过所述酶与所述酶的底物的反应产生的发光化合物发射的信号。

信号的检测

直接或间接地检测由检测配体的一种或多种检测标记物产生的信号或由一种或多种耐受性对照标记物产生的信号。

取决于所用的标记物，可以例如通过荧光或发光尤其是通过化学发光检测信号。

酶型的标记物需要加入使得可以产生可检测的产物的底物，例如，加入允许产生光的底物。

通过电致发光发射光的耐受性对照标记物需要加入钌配合物和加入三丙基胺(TPA)，以及施加允许产生光的电流。

如上文指出的，生物素型的间接标记物需要添加报道物，优选与直接或间接检测标记物偶联的报道物。

如果报道物偶联到酶型的间接标记物(例如过氧物酶)，必须在后面的步骤中加入那种酶的底物，例如鲁米诺或鲁米诺的类似物(如异鲁米诺)或鲁米诺或鲁米诺的类似物的衍生物。

可以有利地使用根据如下文定义的本发明的装置检测信号。

在另一个优选的实施方案中，通过荧光检测由一种或多种耐受性对照标记物发射的信号，并且通过发光例如通过化学发光检测由检测配体的一种或多种检测标记物发射的信号。

通常，使用包含至少两个溶液的试剂盒完成化学发光反应。

第一溶液包含用于过氧物酶的底物，例如鲁米诺、异鲁米诺和/或鲁米诺或异鲁米诺的衍生物，和电子中介体；第二溶液包含氧化剂。作为实例，可以使用以下试剂盒：″Immun-star western C″(Bio-Rad，United States)，″ELISTAR ETA C Ultra ELISA″(Cyanagen，Italy)，″Supersignal West Pico″(Thermo Scientific，United States)，″Chemiluminescent Sensitive Plus HRP″(Surmodics，United States)。

用于在样品中的至少一种被分析物的改善的检测的固体支持体

用于进行根据本发明的分析方法的一种或多种支持体是固体支持体。

根据一个特别的实施方案，使用根据本发明的用于制备固体支持体的方法获得固体支持体。

固体支持体可以由任何适合于进行分析方法的材料制成。固体支持体是例如具有聚合物的或聚合物的混合物的基底的支持体。

适合的固体支持体是例如由聚苯乙烯、聚丙烯、聚(甲基)丙烯酸酯、聚丁二烯或它们的组合制成的支持体。

适合的固体支持体的另一个实例是膜，例如由硝基纤维素、PVDF(聚亚乙烯氟化物)、尼龙或它们的组合制成的膜。

适合的固体支持体的还另一个实例是无机支持体，例如玻璃载片和/或金属支持体。

一种优选的固体支持体是由聚苯乙烯或聚丙烯制成的。

固体支持体包含至少一个区划(也称作分析区域)，优选至少两个区划。

根据本发明的一个特别的实施方案，固体支持体包含单一的区划。所述单一的区划可以是包括一个或若干个壁的区划。备选地，所述单一的区划可以不具有壁并且那么与固体支持体它自己是可比的。那么区划的底部可以由固体支持体的上面构成。这样的包含可以包括或可以不包括一个或若干个壁的单一区划的固体支持体的一个实例是载片或膜。

根据一个特别的本发明的实施方案，固体支持体，其可以是例如微量培养板或膜，包含至少两个区划。

当固体支持体包含至少两个区划时，它们是相互隔离的，使得它们不相互沟通，即，使得在分析期间用于分析的各种组合物或溶液不能从一个区划流通到另一个。因此，添加到一个区划中的溶液将不进入其他的区划。例如，一个或多个区划包含或由以下组成：底部和一个或若干个壁，所述一个或多个壁将一个或多个区划相互隔离开，使得它们不相互沟通。

典型地，每个待分析的试样使用固体支持体的至少一个(例如一个或两个)区划。

在其中固体支持体(例如载片或膜)包含单一区划的本发明的一个特别的实施方案中，典型地，每个待分析的试样使用至少一个(例如一个或两个)固体支持体。

固体支持体是例如微量培养板。在这种情况下，一种实例区划是孔。

微量培养板典型地是具有96个孔或386个孔的微量培养板。

本发明因此设计用于检测在至少一个样品中的至少一种被分析物的固体支持体，其特征在于所述固体支持体包含至少一个区划，所述区划包含至少一个斑点，所述斑点包含至少一种耐受性对照标记物和至少一种捕捉配体。

耐受性对照标记物尤其是如上文，尤其是在段落“耐受性对照标记物”、“耐受性对照荧光团”和“作为耐受性对照标记物的酶”中定义的，或者是使用在下文中在段落“耐受性对照标记物的选择方法”中定义的选择方法获得的。

尤其是，一种或多种所述耐受性对照标记物是在用于检测至少一种被分析物的方法的实施期间保持至少部分地被固定于固体支持体的表面上的所述斑点处从而在检测方法结束时产生可检测的信号的标记物的标记物。

意在分析样品的固体支持体的区划包含至少一个斑点，例如两个斑点、三个斑点、四个斑点或五个斑点，或至少六个斑点，优选六个斑点、七个斑点、八个斑点，更优选至少九个斑点，例如九个斑点、十个斑点、十一个斑点、十二个斑点、十三个斑点、十四个斑点、十五个斑点、十六个斑点或多于十六个斑点。

在此，“斑点”指的是固体支持体的区划的表面上的区域，其包含至少一种耐受性对照标记物和/或至少一种感兴趣的化合物，优选至少一种耐受性对照标记物和至少一种感兴趣的化合物，例如捕捉配体。一种或多种耐受性对照标记物和一种或多种感兴趣的化合物因此通过非共价物理化学相互作用(尤其是弱键类型，例如，离子的、范德华、氢和/或疏水的)或通过共价键同时固定到在区划的表面上的所述区域。

斑点除了一种或多种感兴趣的化合物之外可以含有至少一种聚合物，尤其是至少一种包括亲水基团的聚合物，例如至少一种水凝胶。

在一个特别的实施方案中，区划的全部斑点，优选固体支持体的全部斑点，包含可以在全部斑点中以相同浓度或以不同浓度使用的单一的耐受性对照标记物或耐受性对照标记物的单一的混合物。

备选地，可以在固体支持体的同一区划的多个斑点中使用不同的(至少两种)耐受性对照标记物和/或耐受性对照标记物的不同的(至少两种)混合物。

本发明特别涉及用于检测在至少一个样品中的至少一种被分析物的固体支持体，其特征在于所述固体支持体包含至少一个区划，所述区划包含至少一个斑点，所述斑点包含单一的耐受性对照标记物和至少一种捕捉配体。

优选地，全部意在检测被分析物的斑点，尤其是全部包含捕捉配体的斑点，仅包含一种耐受性对照标记物，所述耐受性对照标记物优选在同一区划的全部意在检测被分析物的斑点中是相同的，且更优选地，其在固体支持体的全部区划的全部意在检测被分析物的斑点中是相同的。

斑点对应于孔限定的区域，例如包含0.0078mm²至5.309mm²之间、优选0.196mm²至3.142mm²、更优选包含0.503mm²至2.011mm²。

斑点具有平圆形的、圆柱形的或半球形的、或大约平圆形的、圆柱形的或半球形的(例如卵形的)形状，尤其是当固体支持体是微量培养板或载片时。

备选地，斑点可以具有正方或矩形的形状(尤其是条带)，例如当固体支持体是膜时，或任何其他形状。

使用本领域技术人员熟知的技术，如在专利US 7,470,547 B2、US 6,576,295 B2、US 5,916,524 A和US 5,743,960 A中所述的那些，获得斑点。

例如，通过将至少一滴含有确定量的至少一种耐受性对照标记物和至少一种感兴趣的化合物的溶液沉积在固体支持体的区划的表面上的特殊位置中，获得斑点。

当斑点包含至少一种聚合物(例如至少一种水凝胶)时，可以通过将至少一滴含有确定量的至少一种耐受性对照标记物和至少一种感兴趣的化合物的溶液沉积在其上已经预先沉积了所述聚合物的区划的表面上的特殊位置中，获得所述斑点。

区划的表面也称作“固相”。

感兴趣的化合物通常是捕捉配体，尤其是被分析物的捕捉配体。区划的一个或多个斑点可以充当对照斑点，并且因此包含不意在检测样品的被分析物的捕捉配体，或包含其他感兴趣的化合物，或不包含任何感兴趣的化合物。

本发明特别涉及用于检测在样品中的至少一种被分析物的固体支持体，其特征在于所述固体支持体包含至少两个区划，所述区划包含至少一个斑点，所述斑点包含至少一种耐受性对照标记物和至少一种捕捉配体。

在一个特别的实施方案中，固体支持体的一些或全部区划具有相同的斑点组成。

在另一个特别的实施方案中，固体支持体或固体支持体的区划的一些或全部包含若干(例如两)组(或类型)有区别的斑点或区划或由它们组成，每个单独的组具有不同的斑点组成(由于在每个组的斑点的数量和/或斑点中一种或多种耐受性对照标记物和/或一种或多种捕捉配体和/或一种或多种感兴趣的化合物导致)。

包含耐受性对照标记物的分析支持体的制备

本发明也涉及用于制备用于检测在至少一个样品中的至少一种被分析物的固体支持体的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在固体支持体的至少一个区划(优选至少两个区划)的表面上沉积包含至少一种耐受性对照标记物和至少一种捕捉配体的混合物，以获得斑点，

b)将步骤a)重复n-1次，n是大于或等于1的整数，以获得n个意在检测在一个或多个所述区划的所述表面上的被分析物的斑点，

c)任选地，将一个或多个所述区划的所述表面饱和，以及

d)任选地，将一个或多个所述区划的所述表面干燥。

固体支持体，一种或多种耐受性对照标记物和一种或多种捕捉配体尤其是如上文定义的。

在步骤a)中，将包含至少一种耐受性对照标记物和至少一种捕捉配体的混合物沉积在固体支持体的至少一个区划、优选至固体支持体的至少两个区划的表面上，以获得斑点。

在步骤a)中，一种或多种所述耐受性对照标记物是在用于检测至少一种被分析物的方法的实施期间保持至少部分地被固定于固体支持体的表面上的所述斑点处从而在检测方法结束时产生可检测的信号的标记物。

耐受性对照标记物尤其是如在本申请中定义的。

一种或多种所述耐受性对照标记物优选为荧光团，例如荧光团的混合物。一种或多种荧光团可以是荧光化学分子或荧光蛋白质。

一种或多种所述捕捉配体优选选自由以下各项组成的组：抗体、抗原、核酸以及它们的组合。

在另一个优选的实施方案中，一种或多种所述捕捉配体不是核酸。

例如，一种或多种所述捕捉配体选自由以下各项组成的组：抗体和抗原。

混合物优选为溶液。

耐受性对照标记物以不干扰一种或多种捕捉配体向区划的表面的固定并且允许在分析方法结束时检测由所述耐受性对照标记物产生的信号的量，存在于混合物中。

作为实例，混合物包含0.1至100μg/ml的捕捉配体和0.01至100μg/ml的对照标记物，优选在缓冲溶液中，例如TBS(Tris Buffered Saline，三羟甲基氨基甲烷盐水缓冲液)溶液。

可以例如使用包括以下步骤的方法，确定在混合物中耐受性对照标记物的浓度：

-在固体支持体的表面上沉积至少两种溶液，每种溶液包含所述耐受性对照标记物和捕捉配体，耐受性对照标记物的浓度从一种溶液向另一种增加，并且耐受性对照标记物的最低浓度大于或等于预定的最小浓度，

-任选地，将固体支持体的表面饱和，即，在使得可以避免向固体支持体的非特异性结合的试剂的存在下，安放固体支持体的表面，

-任选地，将固体支持体的表面干燥，

-在斑点的存在下安放样品，安放包括具有特异性捕捉配体的被分析物的样品，

-在斑点的存在下安放所述被分析物的特异性检测配体，所述检测配体与直接或间接检测标记物偶联，

-当所述检测配体与间接检测标记物偶联时，添加所述间接检测标记物的报道物(也称作第一报道物)，并且当所述(第一)报道物与间接检测标记物偶联时，添加与检测配体的间接检测方法的所述(第一)报道物偶联的间接检测标记物的第二报道物，

-检测由耐受性对照标记物产生的信号，

-检测由检测配体的检测标记物产生的信号，

-选择使得可以检测由耐受性对照标记物产生的信号和由检测配体的检测标记物产生的信号两者的耐受性对照标记物的浓度。

耐受性对照标记物的浓度优选使得可以检测由耐受性对照标记物产生的信号和由检测配体的检测标记物产生的信号两者，而相对于不包含耐受性对照标记物的斑点的没有显著的灵敏度损失，即，对于使用者来说，分析方法的功能性不受耐久性标记物的存在的影响，尤其是灵敏度的降低小于40％，优选小于35％，更优选小于30％，再更优选小于25％。

根据一个特别的实施方案，耐受性对照标记物的浓度使得可以检测由耐受性对照标记物产生的信号和由检测配体的检测标记物产生的信号两者，而特异性没有劣化。

表述“特异性没有劣化”意指阈值的增加小于或等于40％，优选小于或等于35％，更优选小于或等于30％，且再更优选小于或等于25％。

阈值是在分析方法结束时对阴性样品获得的信号的平均加上12倍这些样品的信号的标准差。

当检测配体与间接检测标记物偶联时，因此添加所述间接检测标记物的报道物。当所述报道物(称为第一报道物)它自己与间接检测标记物(例如酶)偶联时，添加与所述第一报道物偶联的间接检测标记物的第二报道物，例如底物。

可以例如使用以下方法确定耐受性对照标记物的预定的最小浓度：

-在固体支持体的表面上沉积至少两种溶液，每种溶液包含耐受性对照标记物且不包含捕捉配体，耐受性对照标记物的浓度从一种溶液向另一种增加，以形成至少两个斑点，

-任选地，将固体支持体的表面饱和，即，在使得可以避免向固体支持体的非特异性结合的试剂的存在下，安放固体支持体的表面，

-任选地，将固体支持体的表面干燥，

-任选地，进行以下步骤中的至少一个：

(i)进行一个以上洗涤步骤，

(ii)在检测配体的存在下安放一个或多个斑点，

(iii)在报道物的存在下安放一个或多个斑点，

(iv)在底物的存在下安放一个或多个斑点，

-检测由耐受性对照标记物产生的信号，和

-选择允许信号的检测的耐受性对照标记物的最小的浓度。

可以人工地将混合物(或溶液)沉积在固体支持体或固体支持体的区划的表面上，但优选通过适合的装置自动地完成。

因此，如前文指出的，耐受性对照标记物与存在于混合物(或溶液)中的一种或多种捕捉配体同时固定在分析支持体的固相上。

在本发明的一个特别的实施方案中，意在检测至少一种被分析物的固体支持体的区划的各个斑点包含至少一种不同的捕捉配体，优选意在通过斑点检测被分析物。然而，区划的若干个斑点可以包含至少一种相同的捕捉配体。

在本发明的一个特别的实施方案中，同一斑点可以包含若干不同的捕捉配体(例如，若干抗体和/或抗原)，它们通常特异性针对相同的待检测的病理、传染或疾病(尤其特异性针对相同的病毒、相同的细菌、相同的真菌或相同的寄生虫)、传染或疾病的进展、受试者的病况(病理性的或不是病理性的)、发展病况(病理性的或不是病理性的)的风险或对治疗的耐性的标记物。

区划的若干斑点或全部斑点可以包含意在检测相同被分析物的捕捉配体；这例如包括相同被分析物的不同的特异性捕捉配体或甚至在斑点中以不同浓度存在的相同的捕捉配体。

在一个特别的实施方案中，耐受性对照标记物或耐受性对照标记物的混合物在所有斑点中是相同的，并且在各个斑点可以或可以不以相同的浓度添加它。

备选地，可以在区划的不同斑点中使用不同的耐受性对照标记物(至少两种)和/或耐受性对照标记物的不同的混合物。

区划也可以包含没有耐受性对照标记物的一个或若干个斑点。然而，优选所述区划的全部斑点包含耐受性对照标记物。

区划也可以包含没有捕捉配体但优选包含其他感兴趣的化合物的一个或若干个斑点。

当区划包含没有捕捉配体的一个或若干个斑点时，所述一个或多个斑点优选包含耐受性对照标记物。

在本发明的一个特别的实施方案中，支持体的全部区划具有相同的斑点组成。

在本发明的另一个特别的实施方案中，固体支持体的一些或全部区划包含若干个(例如两)组有区别的区划或由它们组成，有区别的组的每一个具有不同的斑点组成。

在固体支持体的一些或全部区划中，优选在固体支持体的全部区划中，进行步骤a)和b)。

将在固体支持体的至少一个区划的表面上沉积的混合物例如在被4℃至40℃包含的温度下温育若干秒到若干小时。

该方法包含可能的步骤c)，用于将固体支持体的一个或多个所述区划的表面饱和，即，在可以使得避免向固体支持体的非特异性结合的试剂的存在下安放固体支持体的表面的测试。饱和步骤尤其意在避免在分析方法的实施期间化合物的非特异性固定。

使得可以避免向固体支持体的非特异性结合的试剂例如是本领域技术人员熟知的饱和溶液。

在可能的步骤d)中，将一个或多个区划的表面干燥。

干燥例如在56℃或37℃或在环境温度下完成。

在一个特别的实施方案中，一个或若干个洗涤步骤跟随在步骤a)、步骤b)和/或步骤c)之后。

本发明也涉及用于制备如上所定义的固体支持体的方法，包括接下去的步骤e)，其包括检查斑点的品质。

如果斑点的品质的检查是阳性的，所述斑点可以用作分析方法的一部分。

如果斑点的品质的检查是阴性的，所述斑点不可以用作分析方法的一部分，可能含有所述斑点的区划也是如此。

本发明还涉及试剂盒，其特征在于它包含以下各项或由以下各项组成：根据本发明的或者使用根据本发明的制备方法获得的至少一种固体支持体，和，如果可用，用于进行根据本发明的分析方法的至少一种组合物或溶液，和/或用户说明书(instructions)。

用于改善的检测的装置(用于双重检测的装置)

本发明另外的目的在于提供一种用于检测在样品中的至少一种被分析物的装置，所述装置包含：

-用于检测在固体支持体处产生的第一信号和第二信号的工具，和

-用于从所述第一信号的位置限定读取栅格并且用于在所述读取栅格处读取所述第二信号的工具。

根据一个特别的实施方案，此读取对应于在感兴趣的区域处的第二信号的量化。

第一信号的检测可以在第二信号的检测之前、之后或同时完成。

固体支持体是尤其如上文定义的。

第一信号可以是荧光或发光信号，例如通过化学发光。

第二信号可以是荧光或发光信号，例如通过化学发光。

在一个优选的实施方案中，第一信号是荧光信号且第二信号是发光信号，优选通过化学发光(或反之亦然)。

用于检测在固体支持体处产生的第一信号和第二信号的工具称为光具座(optical bench)。

光具座可以例如包含以下部件或由以下部件组成：

-照明系统，

-远心物镜，

-滤光轮，所述远心物镜优选在它的输出透镜上与所述滤光轮连接，和

-照相机。

照明系统优选是可操纵的照明系统。

照明系统使得可以用或多或少的强度照亮固体支持体，例如，以显示荧光或所用的固体支持体的几何形状。

远心物镜优选是大的。尤其是，远心物镜覆盖整个固体支持体。

远心物镜使得可以将整个待测量的表面成像，而不使图像变形，以消除标准物镜固有的视差，并保证在整个观看的表面上的信号均一性。

远心物镜优选在它的输出透镜上与滤光轮连接。

滤光轮使得可以在远心物镜和照相机(也称作图像获取照相机)之间存在不同的滤光器。在一个优选的实施方案中，因此可以选择到达照相机的传感器的波长，以能够，在一种情况下，通过滤光器的存在，将照明的激发信号与由至少一种耐受性对照标记物(尤其是至少一种荧光团)产生的那些分开，并且在另一种情况下，通过不将信号滤光但保证维持组装体的光学性质的中性窗的存在，收集最大量的由被分析物的检测配体的至少一种检测标记物产生的信号。

照相机使得可以获得具有变动的曝光时间的图像。

这样限定的光具座使得可以取得相同支持体的一系列图像，具有不同的照明、滤光和/或图像获得参数，如：

-在可见范畴的图像(也称作定位图像)，例如，通过使用来自照明系统的照明但不使用专门的滤光器而得到，

-荧光图像(也称作检测图像)，通过使用来自照明系统的照明和用于寻求的荧光的专门滤光器而得到，

-不用照明和专门滤光器得到的图像(也称作分析图像)，例如，显示化学发光信号。

用于从所述第一信号的位置限定读取栅格并且用于在所述读取栅格处读取第二信号的工具可以包含成像系统或由成像系统组成。

在一种有利的实施方案中，光具座因此与成像系统联合，使得可以进行包括若干步骤的分析方法，其尤其保证进行的分析的精确性和鲁棒性，所述步骤包括：

1.选择固体支持体和固体支持体的一个或多个区划并将其定位，尤其是根据定位图像；此过程的目的是减少固体支持体的任何机械定位错误并且使得可以使用不具有高定位精度的机械；

2.从在步骤1中确定的一个或多个区划的位置，在每个区划中，将表示每个斑点的理论位置的理论栅格定位；此定位可以从参考栅格例如在分析系统中描述的栅格来完成，所述参考栅格指示了每个斑点相对于区划的参考点的坐标；区划的参考点例如是区划的中心：

3.使用利用照明和荧光滤光器完成的检测图像，对在固体支持体的一个或多个区划中存在的所有荧光情况进行搜索，并且任选地，使用通过它们的大小和形状进行的情况选择来排除某些情况，从而消除完全在预期的规则之外的那些情况；

4.在以下两项之间比较：

○先前检测的并认为有效的情况的位置，

○如在步骤2中限定的预期的斑点的理论位置；

5.对于每个预期的斑点，与最近的检测到的情况关联，并且和理论斑点的表面相交，从而形成“理论斑点”/“荧光情况”对，使得可以检测遗漏的斑点。对于每个理论斑点，一定存在有区别的和独特的荧光情况；

6.使用直径、形状、距理论位置距离判据表征每个检测到的斑点，使得可以保证检测到的斑点的完整性；

7.对于每个检测到的斑点，限定相应的感兴趣的区域，称为读取栅格，尤其是通过检测到的斑点的表面和坐标限定；和

8.在步骤7中限定的读取栅格上读取第二信号，尤其是量化在此感兴趣的区域即读取栅格处的分析图像上的第二信号。

具有对斑点的品质检查的分析方法

根据本发明的分析方法允许检测在至少一个样品中的至少一种被分析物。

本发明尤其涉及用于检测在至少一个样品中的至少一种被分析物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在固体支持体的区划的一个或多个斑点的存在下安放待分析的样品，所述斑点或所述多个斑点的至少一个包含至少一种耐受性对照标记物以及被分析物的至少一种捕捉配体，

b)在所述区划的一个或多个斑点的存在下安放被分析物的至少一种检测配体，被分析物的所述检测配体与直接或间接检测标记物偶联，

c)当被分析物的至少一种检测配体与间接检测标记物偶联时，在所述区划的一个或多个斑点的存在下安放所述间接检测标记物的报道物，

d)当在步骤c)中使用的所述报道物与间接检测标记物偶联时，在所述区划的一个或多个斑点的存在下安放与在步骤c)中使用的所述报道物偶联的所述间接检测标记物的报道物，

e)检测由在所述区划中的至少一种耐受性对照标记物产生的信号，

f)由在步骤e)检测到信号的位置限定读取栅格，

g)任选地，检测由被分析物的检测配体的至少一种检测标记物产生的信号，以及

h)任选地，在步骤f)中限定的所述读取栅格上读取在步骤g)中检测的信号。

如上限定的，该或所述耐受性对照标记物能够在分析方法结束时产生可检测的信号，即，当分析方法已在没有所述斑点的劣化的情况下进行时在斑点处产生可检测的信号。尤其是，该或所述耐受性对照标记物能够在上述方法的步骤e)期间产生可检测的信号。

本发明尤其涉及用于检测在至少一个样品中的至少一种被分析物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在固体支持体的区划的一个或多个斑点的存在下安放待分析的样品，所述斑点或所述多个斑点的至少一个包含至少一种耐受性对照标记物以及被分析物的至少一种捕捉配体，

b)在所述区划的一个或多个斑点的存在下安放被分析物的至少一种检测配体，被分析物的所述检测配体与直接或间接检测标记物偶联，

c)当被分析物的至少一种检测配体与间接检测标记物偶联时，在所述区划的一个或多个斑点的存在下安放所述间接检测标记物的报道物，

d)当在步骤c)中使用的所述报道物与间接检测标记物偶联时，在所述区划的一个或多个斑点的存在下安放与在步骤c)中使用的所述报道物偶联的所述间接检测标记物的报道物，

e)检测由在所述区划中的至少一种耐受性对照标记物产生的信号，

f)由在步骤e)检测到信号的位置限定读取栅格，

g)任选地，检测由被分析物的检测配体的至少一种检测标记物产生的信号，以及

h)任选地，在步骤f)中限定的所述读取栅格上读取在步骤g)中检测的信号，

一种或多种所述耐受性对照标记物是在用于检测至少一种被分析物的方法的实施期间保持至少部分地被固定于固体支持体的表面上的斑点处从而在步骤e)期间产生可检测的信号的标记物。

还在步骤e)至h)之前，完成步骤a)至d)。

步骤g)可以在步骤e)之前、之后或同时进行。在一个特别的实施方案中，步骤g)在步骤e)之前或之后进行。

步骤f)还在步骤e)之后进行。

步骤f)还在步骤e)之后且在步骤h)之前进行，并且可以在步骤g)之前、之后或同时进行。

步骤h)还在步骤e)至g)之后进行。

对于固体支持体的每个区划，完成步骤a)至f)，和如果可用，步骤g)和/或步骤h)，所述区划包含至少一个斑点，所述斑点包含至少一种耐受性对照标记物和被分析物的至少一种捕捉配体，在所述区划中分析样品。

如果在步骤f)中限定的读取栅格不指示用于读取在步骤g)中被检测的信号的任何区域，可以不完成步骤g)和/或h)。

如果进行步骤h)，也进行步骤g)。

该方法可以有利地包括一个或若干个洗涤步骤，例如在步骤a)至d)的各个或一些之间。

对意在分析样品的各区划的洗涤包括至少一个循环，优选3至6个循环，用于将一定体积(例如400μL)的洗涤溶液(例如，Tris NaCl 0.01M缓冲溶液，pH 7.4，掺杂有0.1％的Tween 20)分配和抽吸。

根据本发明的一个特别的实施方案，在步骤e)和g)之间没有操作，尤其是没有移液、分配、搅动、抽吸或洗涤步骤，不管步骤e)、f)和g)以何种顺序。

表述“在区划的斑点的存在下安放化合物X”意味着将化合物X添加到包含所述斑点的区划，所述区划意在分析样品。

当在相同的步骤期间在区划的一个或多个斑点的存在下安放至少两种化合物时和/或当至少两个步骤a)至d)同时进行时，可以在一个或多个所述斑点的存在下分别安放所述化合物，即，以分开的组合物的形式分配所述化合物；备选地，可以在区划的一个或多个斑点的存在下以一种或若干种混合物的形式安放所述化合物或化合物中的一些。

尤其使用如上文定义的固体支持体或通过如上文定义的制备方法获得的固体支持体来进行检测方法。

一种或多种耐受性对照标记物、一个或多个斑点、被分析物的一种或多种捕捉配体尤其是如上文定义的。

尤其是，一种或多种耐受性对照标记物是在所述用于检测至少一种被分析物的方法的实施期间保持至少部分地被固定于固体支持体的表面上的所述斑点处从而在步骤e)期间，即当分析方法已在没有斑点的劣化的情况下进行时，产生可检测的信号的标记物。

本发明特别涉及如上定义的方法，其特征在于所述多种耐受性对照标记物或所述多种耐受性对照标记物中的一种是一种(或若干种)荧光团，例如，一种或若干种荧光化学分子或一种或若干种荧光蛋白质，例如荧光团的混合物。

本发明特别涉及如上定义的方法，其特征在于所述多种耐受性对照标记物或所述多种耐受性对照标记物中的一种是耐受性对照标记物，尤其是荧光团，其激发光谱与由被分析物的一种或多种所述检测配体的检测标记物发射的信号或对应于被分析物的一种或多种所述检测配体的检测标记物的信号的发射光谱不交叠，并且其发射光谱与被分析物的所述一种或多种检测配体的检测标记物的发射光谱或对应于被分析物的所述一种或多种检测配体的检测标记物的发射光谱不交叠，或部分交叠。

本发明例如涉及如上定义的方法，其特征在于所述多种耐受性对照标记物或所述多种耐受性对照标记物中的一种是耐受性对照标记物，尤其是荧光团，其激发光谱与通过鲁米诺和/或类似物和/或鲁米诺或鲁米诺的类似物的衍生物与过氧物酶的反应获得的发光化合物发射的信号的发射光谱不交叠，并且其发射光谱与通过鲁米诺和/或类似物和/或鲁米诺或鲁米诺的类似物的衍生物与过氧物酶的反应获得的发光化合物的发射光谱不交叠，或部分交叠。

在一个优选的实施方案中，如上定义的检测方法包括以下步骤：

a)在固体支持体的区划的一个或多个斑点的存在下安放待分析的样品，所述斑点或所述多个斑点的至少一个包含至少一种耐受性对照标记物以及被分析物的至少一种捕捉配体，

b)在所述区划的一个或多个斑点的存在下安放被分析物的至少一种检测配体，被分析物的所述检测配体与间接检测标记物偶联，

c)在所述区划的一个或多个斑点的存在下安放所述间接检测标记物的报道物，

d)当在步骤c)中使用的所述报道物与间接检测标记物偶联时，在所述区划的一个或多个斑点的存在下安放与在步骤c)中使用的所述报道物偶联的所述间接检测标记物的报道物，

e)检测由在所述区划中的至少一种耐受性对照标记物产生的至少一种信号，

f)由在步骤e)检测到信号的位置限定至少一个读取栅格，

g)任选地，检测由被分析物的检测配体的至少一种检测标记物产生的信号，以及

h)任选地，在步骤f)中限定的所述读取栅格上读取在步骤g)中检测的信号。

本发明特别涉及如上定义的方法，其特征在于：

-由被分析物的检测配体的至少一种检测标记物产生的信号是由通过过氧物酶与鲁米诺、鲁米诺的类似物和/或鲁米诺或鲁米诺的类似物的衍生物的反应获得的化学发光化合物发射的光，并且

-由耐受性对照标记物或多种所述耐受性对照标记物产生的信号是在375至550nm、375至580nm或350至580nm(含)的波长之外发射的光。

优先地，一种或多种耐受性对照标记物具有激发光谱，和优选地发射光谱，在375至550nm、375至580nm或350至580nm(含)的波长之外。

分析方法例如是免疫测定，且尤其是免疫-酶测定，如ELISA(酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay))试验。分析方法也可以用于检测核酸。

在步骤a)中，在固体支持体的区划的一个或多个斑点的存在下安放待分析的样品。

当分析若干种样品且固体支持体包含若干个区划时，步骤a)包括在固体支持体的至少一个区划的一个或多个斑点的存在下安放样品，所述固体支持体包含至少和待检测的样品的数量那么多的区划，所述区划包含至少一个包含至少一种耐受性对照标记物和被分析物的至少一种捕捉配体的斑点，或使用若干个固体支持体。

当分析若干种样品且固体支持体包单一区划时，步骤a)包括向固体支持体的区划中加入样品(或者，当所述区划与固体支持体本身可比时，在所述固体支持体上添加样品)，并且人们使用和待分析的样品的数量那么多的固体支持体，所述固体支持体包含区划，所述区划包含至少一个包含至少一种耐受性对照标记物和被分析物的至少一种捕捉配体的斑点。

当分析若干种样品时，对每种样品使用不同的区划。可以使用一个或若干个固体支持体的若干个区划来分析相同的样品，尤其是如果所述区划具有不同的斑点组成。

可以步骤a)和b)同时、步骤a)在步骤b)之前、或步骤b)在步骤a)之前完成。当步骤b)在步骤a)之前完成时，方法在这两个步骤a)和b)之间不包括洗涤步骤。

步骤c)和d)，当它们存在时，优选在步骤a)和b)之后完成，并且在步骤a)和b)与步骤c)和d)之间优选至少有一个洗涤步骤。

步骤c)和d)，当它们存在时，可以同时完成，或步骤c)在步骤d)之前完成。当步骤d)在步骤c)之前完成时，方法在这两个步骤d)和c)之间不包括洗涤步骤。

步骤d)，当它存在时，优选在步骤c)之后完成，并且在步骤c)和d)之间有至少一个洗涤步骤。

在步骤b)中，在所述区划的一个或多个斑点的存在下安放被分析物的的至少一种检测配体。

步骤b)尤其在各个意在分析样品的区划中完成。

被分析物的一种或多种检测配体尤其是如上文定义的。

优选地，步骤b)包括添加每种待检测的被分析物的至少一种检测配体。当使用被分析物的不同的检测配体时，可以将它们同时或相继添加，全部或部分配体能够以分开的组合物的形式或一种或多种混合物的形式被提供。被分析物的检测配体中的一些可以与步骤a)同时添加，优选在洗涤步骤之后，在添加其余的被分析物的检测配体之前。

当在步骤b)期间相继添加被分析物的检测配体时，在至少一种被分析物检测配体的各自添加之后可以跟随意在分析样品的区划的洗涤步骤。

步骤c)和d)的性能取决于检测配体的检测标记物，并且如果可用，取决于检测配体的检测标记物的报道物的检测标记物。

因此，当被分析物的至少一种检测配体与间接检测标记物偶联时，进行步骤c)。

优选地，被分析物的一种或多种检测配体与相同的检测标记物偶联。如果被分析物的至少两种检测配体偶联到不同的间接检测标记物，对每种间接检测标记物进行步骤c)，以检测各种标记物的信号。

当在步骤c)中使用至少一种报道物(也称作第一报道物)偶联到间接检测标记物时，进行步骤d)。在步骤d)中使用的报道物称为第二报道物。

当进行步骤d)时，因此也进行步骤c)。

在步骤e)中，在所述区划中检测由至少一种耐受性对照标记物产生的信号。

如果使用至少两种耐受性对照标记物，步骤e)优选包括检测由所述耐受性对照标记物的每种产生的信号。

由至少一种耐受性对照标记物产生的信号的检测尤其使得可以将在固体支持体中的每个区划中包含至少一种耐受性对照标记物的斑点局域化。

由至少一种耐受性对照标记物产生的信号优选为通过荧光发射的信号。

在步骤f)中，从在步骤e)中检测的信号的位置限定读取栅格。

读取栅格精确指明在区划的必须在哪个或那些区域读取(或“分析”或“考虑”或“解释”)第二信号。尤其是，在读取栅格中限定的所述多个区域或所述多个区域之一以外的地方在步骤g)中检测的第二信号在步骤h)期间的第二信号的读取(或“分析”或“解释”)中不被考虑。

特别有利的是根据每个斑点的轮廓精确限定所述区域。

因此，用于限定读取栅格的步骤f)尤其包括从在步骤e)中检测的对应于至少一种耐受性对照标记物的信号校验斑点的品质。

“斑点的品质”指的是一个或多个斑点的存在、位置和/或完整性。

斑点的完整性包括斑点的大小和形状。

如果斑点在与预期位置一致的位置存在于区划中，如果它具有界限清楚的轮廓，如果它的形状与可接受性判据一致(例如，如果它具有平圆形，大约平圆形例如卵形，或具有大于80％的圆形度)，和如果它不与区划的其他斑点相交，则斑点的品质检测尤其是阳性的。

“大于80％的圆形度”意指检测到的斑点具有足够的圆形度，以保证它尚未被在分析方法中完成的所有处理所损坏。

例如，如果在步骤e)中检测到信号，此信号具有界限清楚的轮廓、平圆形、大约平圆形例如卵形或具有大于80％的圆形度，并且如果它不与由区划的其他斑点产生的信号相交，则斑点的品质检查是阳性的。

如果在斑点处在步骤e)中没有检测到信号，或如果斑点由于与上述原因的至少一个不同而不满足品质对照，则当在步骤h)中读取第二信号时，不考虑在所述斑点处任选地检测的第二信号，可能也不考虑在对应于所述斑点的区划的每个斑点处检测的第二信号。

在步骤e)和g)中，信号的检测优选包括信号的获得。

根据本发明的一种或若干种耐受性对照标记物的使用因此使得可以在斑点所处的精确位置进行第二信号的读取，使得可以改善分析的灵敏度，同时确保得到的结果，尤其是使得可以消除与斑点缺陷有关的假阳性或假阴性。

本发明尤其涉及如上定义的方法，其特征在于由被分析物的检测配体的至少一种检测标记物产生的信号是发光信号，尤其是化学发光信号，例如通过鲁米诺和/或类似物和/或鲁米诺的衍生物或鲁米诺的类似物的衍生物与过氧物酶的反应发射的光。

本发明更具体地涉及如上定义的方法，其特征在于由至少一种耐受性对照标记物产生的信号是通过荧光被检测的，且由被分析物的检测配体的至少一种检测标记物产生的信号是通过发光尤其是化学发光被检测的。

在一个优选的实施方案中，至少步骤e)至h)是使用同一装置进行的，例如在“用于改善的检测的装置”段落中描述的装置。

在另一个优选的实施方案中，方法的全部步骤是使用同一装置进行的，例如在“用于改善的检测的装置”段落中描述的装置。

用于选择耐受性对照标记物的方法

本发明也涉及一种用于选择耐受性对照标记物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在固体支持体的表面上沉积待测试的标记物，以形成至少一个斑点，

b)任选地，将所述固体支持体的所述表面饱和，

c)任选地，将所述固体支持体的所述表面干燥，

d)进行以下步骤中的至少一个：

(i)进行一个或多个洗涤步骤，

(ii)在检测配体的存在下安放一个或多个斑点，

(iii)在报道物的存在下安放一个或多个斑点，

(iv)在底物的存在下安放一个或多个斑点，

e)选择在步骤d)结束时产生信号的标记物。

待测试的标记物是产生(例如，发射)能够被检测的信号的化合物。例如，待测试的标记物是荧光团或发光化合物。

固体支持体尤其是如上定义的。

步骤a)包括将待测试的标记物沉积在固体支持体的表面上以形成至少一个斑点，或由其组成。

可以使用适合的装置人工或自动地沉积标记物。

待测试的标记物通常以包含所述标记物的溶液的形式被沉积。

步骤a)可以包括将相同的待测试的标记物沉积在若干个斑点中，以及增加浓度。

在步骤a)中沉积的溶液可以或可以不包含捕捉配体。

方法包括可能的步骤b)，其用于将固体支持体的表面饱和。饱和步骤尤其意在防止在分析方法的实施期间化合物的非特异固定。

在步骤c)中，任选地将固体支持体的表面干燥。

通常，在步骤a)和/或步骤b)后跟随一个或若干个洗涤步骤a’)和/或b’)。

步骤d)包括(或由以下各项组成)进行以下步骤的至少一种，优选以下步骤的至少两种，更优选以下步骤的至少三种：

(i)进行一个或多个洗涤步骤，

(ii)在至少一种检测配体的存在下安放一个或多个斑点，

(iii)在至少一种报道物的存在下安放一个或多个斑点，和/或

(iv)在至少一种底物的存在下安放一个或多个斑点。

在一个优选的实施方案中，步骤d)包括(或由以下各项组成)步骤(iii)和/或步骤(iv)，优选步骤(iii)和步骤(iv)。

在另一个优选的实施方案中，步骤d)包括(或由以下各项组成)步骤(i)、步骤(iii)和/或步骤(iv)，优选步骤(i)、步骤(iii)和步骤(iv)。

在一个优选的实施方案中，步骤d)至少包括步骤(i)、步骤(ii)、步骤(iii)和步骤(iv)。

步骤(i)至(iv)可以以任何适宜的顺序完成。

然而，在一个优选的实施方案中，步骤d)包括按以下顺序的以下步骤：步骤(ii)、步骤(i)、步骤(iii)、步骤(i)、步骤(iv)和步骤(i)。

在另一个优选的实施方案中，步骤d)包括按以下顺序的以下步骤：步骤(ii)、步骤(i)、步骤(iii)、步骤(i)和步骤(iv)。

在另一个优选的实施方案中，当这些步骤存在时，步骤(ii)在步骤(iii)之前和/或在步骤(iv)之前进行，且步骤(iii)在步骤(iv)之前进行。步骤(i)可以在步骤(ii)与(iii)、(ii)与(iv)(尤其是当不存在步骤(iii)时)和/或(iii)与(iv)之间进行。

优选地，步骤(iii)的多种报道物或多种报道物中的一种是与步骤(ii)的至少一种检测配体偶联的检测标记物的报道物，和/或步骤(iv)的多种底物或多种底物中的一种是与报道物偶联的检测标记物的报道物。

例如，步骤(ii)的一种或多种检测配体或一种或多种检测配体中的一种与生物素型的检测标记物偶联，步骤(iii)的多种报道物或多种报道物中的一种是与酶(例如过氧物酶)偶联的链霉抗生物素蛋白型的报道物，和/或步骤(iv)中的多种底物或多种底物中的一种是所述酶的底物，例如鲁米诺、鲁米诺的类似物、和/或鲁米诺或鲁米诺的类似物的衍生物。

选择方法包括步骤e)，其用于选择在步骤d)结束时产生信号的标记物。尤其是，在步骤e)中选择的标记物在步骤d)结束时产生信号。“可检测的信号”尤其是如上定义的。

优选地，步骤e)还包括选择不干扰或很小干扰由检测配体的检测标记物所产生的信号的检测。

根据本发明的选择方法还可以包括：

-任选地，首先：

○上述步骤a)至c)，其中在步骤a)中形成的一个或多个斑点不包含捕捉配体，

○任选地，第一预选步骤，其包括选择在步骤c)结束时产生可检测的信号的标记物，

○任选地，在同一支持体上的步骤d)至e)，优选所述步骤仅用在第一预选步骤中选择的所述标记物进行，其后跟随第二预选步骤，其包括选择在步骤c)结束时产生可检测的信号的标记物，

-其次，以上步骤a)至e)，其中步骤a)中形成的一个或多个斑点包含捕捉配体，步骤d)至e)优选用在第一预选步骤中选择的标记物和/或在第二预选步骤中选择的标记物进行。

耐受性对照标记物的用途

本发明也涉及至少一种耐受性对照标记物在意在检测被分析物的至少一个斑点中用于确保用于检测在样品或至少一个样品中的至少一种被分析物的方法的用途。

“用于确保用于检测在样品或至少一个样品中的至少一种被分析物的方法”在此意指保证在所述检测方法结束时获得的结果的可靠性，尤其是避免“假阴性”或“假阳性”的存在。

“假阴性”是反映在样品中不存在一种或若干种待检测的被分析物的阴性结果，而一种或多种所述被分析物存在于样品中且应当被检测到。

“假阳性”是反映在样品中存在一种或若干种待检测的被分析物的阳性结果，而一种或多种所述被分析物不存在于样品中。

尤其通过以下方式获得对用于检测在样品中的至少一种被分析物的方法的确保：在检测方法结束时检查一个或多个意在检测被分析物的斑点的品质，和/或使用至少一种耐受性对照标记物改善被分析物的检测的灵敏度。

本发明因此涉及至少一种耐受性对照标记物在意在检测被分析物的至少一个斑点中用于确保用于检测在样品或至少一个样品中的至少一种被分析物的方法的用途，其特征在于它包括：

-当在样品和待检测的被分析物的至少一种检测配体的存在下安放了所述斑点之后，尤其是在分析方法结束时，检查所述斑点的品质，和/或

-读取信号，所述信号由待检测的被分析物的检测配体的至少一种检测标记物在读取栅格上产生，所述读取栅格由一种或多种所述耐受性对照标记物产生的信号的位置限定。

由待检测的被分析物的检测配体的至少一种检测标记物产生的信号因此在读取栅格上完成并且在分析方法结束时被检测到，所述读取栅格由一种或多种所述耐受性对照标记物产生的信号的位置限定。

本发明尤其涉及至少一种耐受性对照标记物在意在检测被分析物的至少一个斑点中用于确保用于检测在样品或至少一个样品中的至少一种被分析物的方法的用途，其特征在于它包括：

-当在以下物质的存在下安放了所述斑点之后，检查斑点的品质：样品和与间接检测标记物偶联的待检测的被分析物的至少一种检测配体、所述间接检测标记物的报道物(也称作第一报道物)、任选地，与所述第一报道物偶联的间接检测标记物的第二报道物，和/或

-读取信号，所述信号由待检测的被分析物的检测配体的至少一种检测标记物在读取栅格上产生，所述读取栅格由一种或多种所述耐受性对照标记物产生的信号的位置限定。

本发明特别涉及如上定义的用途，其特征在于斑点的品质对照包括(或由以下各项组成)检查斑点存在、位置和/或完整性。

读取栅格指示了区划的一个或多个区域，其中由被分析物的检测配体的一种或多种检测标记物产生的信号必须被读取。

本发明的其他特征和优点将通过以下作为说明且非限制性地提供的实施例更好地显现。

图

图1：在实施例1中描述的规程的不同步骤中的不同荧光团的使用和所得的荧光图像。

图2：在根据本发明的分析方法结束时包含9个斑点的12个孔的荧光信号的获得。

图3：荧光图像：理论读取栅格(白色实线圆)相对于通过基于由耐受性对照标记物产生的信号的荧光得到的斑点的实际位置(白色点线圆)的比较。

图4：化学发光图像：利用在通过耐受性对照标记物检测的斑点的实际位置上限定读取栅格(点线)导致的分析方法的精确度的改善，相对于理论位置栅格(实线)。

图5：化学发光图像：在认可结果之前利用对检测到的斑点的完整性进行校验导致的分析方法的精确度的改善。

图6：光具座的图，所述光具座包含照明系统、远心物镜、滤光轮和照相机，所述远心物镜在它的输出透镜上与滤光轮连接。

实施例

实施例1：用于选择耐受性对照标记物的实例方法

材料和方法

在聚苯乙烯微量培养板(Greiner，Germany)的每个孔内，逐孔地沉积在传统上用于制作抗原或抗体斑点的缓冲液中的500nl的荧光团溶液的液滴。在此实施例中，使用以下荧光团：Atto 633-甲酸(即，Atto 633-COOH或Atto 633)(供应商：ATTO-TEC；Germany)、Atto 633-胺(即，得自Atto 633的Sérivé胺)(供应商：ATTO-TEC；Germany)、Dye 634-甲酸(即，Dye 634-COOH或Dye 634)(供应商：Dyomics，Germany)、Dye 634-胺(即，得自Dye 634的Sérivé胺)(供应商：Dyomics，Germany)、Dye 630-胺(即，得自Dye 630的Sérivé胺)(供应商：Dyomics，Germany)、APC(Allophycocyanin)(提供商Febico；Taiwan)、B-藻红蛋白(Febico；Taiwan)。这些微量培养板的每个孔的底部具有本领域技术人员本身已知的分子吸附能力。将每个这样获得的孔的表面用本领域技术人员本身已知的饱和溶液饱和；用饱和溶液填充孔，将饱和溶液移除并且接着将孔干燥；在这些孔的再水化步骤之后，随后将含有鲁米诺(ELISTAR ETA C Ultra ELISA(Cyanagen，Italy)的底物溶液(见实施例2)以50μL/孔的比率添加。使用用于荧光团的具有合适的滤光器的Chemidoc^TMMP System(Bio-Rad)，在上述规程的不同步骤(即，在沉积液滴、饱和、干燥、再水化的步骤之后，以及添加含有鲁米诺的底物溶液之后)，完成荧光图像。

结果

图1描述了在上述规程的不同步骤中的不同荧光团的使用和所得的荧光图像。

用4种荧光团获得的荧光在液滴在板上的沉积结束时完全可见。在饱和溶液消失之后(参见饱和后的斑点)，对于Atto 633-胺、别藻蓝蛋白(allophycocyanin)和B-藻红蛋白，此荧光仍然留存。在加入含有鲁米诺的底物溶液之后，对于Atto 633-胺和对于B-藻红蛋白，它仍然留存，对于别藻蓝蛋白，非常微弱。用Dye 634-胺和Dye 630-胺得到类似的结果(结果未示出)。相反，在Dye 634-甲酸的情况下，在洗涤步骤结束时看不到残留的荧光，且在添加底物溶液之后更是如此，对Atto 633-甲酸也是一样(结果未示出)。

因此，Atto 633-胺、Dye 634-胺、Dye 630-胺和B-藻红蛋白是根据本发明的耐受性对照标记物。

此外，如以下在实施例2中说明的，与BSA偶联的Dye 634也是根据本发明的耐受性对照标记物。

实施例2：耐受性对照荧光团的存在对感兴趣的被分析物的检测不存在影响

材料和方法

(i)微量培养板的准备

在聚苯乙烯微量培养板(Greiner，Germany)的每个孔内，使用制造斑点机器人，成行沉积50nL含有一种或多种捕捉配体以及使用申请中所述方法选出的荧光团的溶液的液滴。

捕捉配体溶液可以是：

-作为抗体检测试验的一部分，是抗原或者抗原的混合物，其能够由与一种以上合成肽相联系的重组蛋白组成；

-或者在抗原检测试验的情况下，是针对寻求的标记物的抗体或抗体的混合物。

这些捕捉配体溶液含有选出的荧光团，例如Atto 633-胺(Atto-tec，Germany)或使用本领域技术人员知道的规程从与BSA偶联的处于NHS-酯(N-羟基琥珀酰亚胺酯)形式的Dye 634(Dyomics，Germany)获得的Dye 634-BSA配合物；以针对每种决定的适合的剂量添加这些荧光团；对于Dye 634-BSA，指示的剂量对应于Dye 634-BSA配合物的浓度。这些微量培养板的每个孔的底部具有本领域技术人员本身已知的吸附能力。

将这样获得的斑点用本领域技术人员本身已知的饱和溶液饱和。随后将板干燥。

(i)分析方法的实施

对于在分析方法的实施期间使用的各种要素的描述：

报道物

Streptavidin-POD(S-POD)报道物是根据本领域技术人员本身知道的由Nakane和Kawaoi[J Histochem Cytochem(1974)Vol.22，No.12.pp.1084-1091]描述的方法与过氧物酶(Roche Germany)偶联的链霉抗生物素蛋白(Roche，Germany)。

洗涤溶液

三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液10mM，pH 7.4，含有：NaCl 218mM、0.1％的Tween 20^TM(Sigma公司的商标)，0.002％的Proclin 300^TM(Supelco公司的商标)。

显影底物

ELISTAR ETA C Ultra ELISA显影底物(Cyanagen，Italy)由两种溶液组成：XLSE024LLuminol增强剂溶液(A)和XLSE024P过氧化物溶液(B)。

进行的不同步骤的描述：

试验规程包括以下步骤：

步骤1：

1.在微量培养板的每个孔中(包含斑点)分配：

-40μl的样品：样品可以例如是血清或对照样品

-40ul的稀释剂

2.将混合物在37℃伴随搅动温育40分钟。

3.用至少300μl的洗涤溶液完成至少三次相继洗涤。

4.接着，在检测配体的存在下完成温育步骤，随后在如第3点同样的条件下洗涤。

5.随后，报道物的温育步骤，随后洗涤。

6.最后，最终显影步骤，包括添加25μl的显影底物溶液B和A中的每一种。

7.将混合物在37℃伴随搅动温育1分钟。

8.用Chemidoc^TM读取仪完成读取，以测量荧光，并且用Qview^TM读取仪完成读取，以测量化学发光。用图像分析仪系统直接处理读取的结果，并以相对光单位(RLU)以及相对荧光强度(RFI)记录。

结果

各数据对应于三次的平均值；荧光值对应于在扣除背景噪声之后的荧光信号水平。

用向待检测的感兴趣的标记物的特异件抗体溶液中添加的Atto 633-胺荧光团所获得的结果；

表1：对于不同荧光团含量，Atto 633-胺荧光团的存在对于被分析物的检测的影响。E1、E2和E3是阳性样品，含有待检测的抗原，处于不同的阳性水平。

在表1中所示的结果显示，对于0.35μg/ml以下的剂量，Atto 633-胺荧光团的存在对于被分析物的检测没有影响。对被分析物的检测极限的计算显示，高达1.2μg/ml的剂量的荧光团的存在没有影响。捕捉配体的存在仅仅非常微弱地改变荧光(参见表2)，荧光在分析结束时保持非常显著且完全可检测。

表2：捕捉配体的存在对荧光信号的影响(Atto 633-胺荧光闭的情况)。E1和E3是阳性样品，含有待检测的抗原，处于不同的阳性水平。N1是阴性样品，不含有待检测的抗原。“Fluo”代表荧光团。

用向待检测的感兴趣的标记物的特异性抗体溶液中添加的Dye634-BSA荧光团所获得的结果：

对于6μg/ml以下的荧光团剂量，表3中的结果显示Atto 634-BSA对被分析物的检测没有影响，此剂量与在分析结束时荧光的检测和如在本申请中所述的数据处理方法的实施相容。

表3：对于不同的荧光团剂量，Atto Dye 634-BSA荧光团的存在对被分析物的检测的影响。E1、E2和E3是阳性样品，含有待检测的抗原，处于不同的阳性水平。“Fluo”代表荧光团。

用向对应于待检测的抗体的抗体溶液中添加的Atto 633-胺荧光闭所获得的结果：

表4中所示的结果显示，对于0.1μg/ml以下的荧光团剂量，Atto 633-胺荧光团的存在对被分析物的检测没有影响。捕捉配体的存在改变荧光(参见表5)，但是信号在分析结束时保持非常显著、完全可检测，并且可用于实施如在本申请中所述的数据分析方法。

表4：对于不同的荧光团剂量，Atto 633-胺荧光团的存在对被分析物的检测的影响。样品S1和S2是阳性样品，含有与在混合物中所用的2种抗原(重组蛋白质或合成肽)选择性反应并分别关于它们的抗体。“Fluo”代表荧光团。

表5：捕捉配体的存在对荧光信号的影响(Atto 633-胺荧光团的情况)。样品S1和S2是阳性样品，含有与所用的2种抗原(重组蛋白质或合成肽)选择性反应并分别关于它们的抗体。N2是阴性样品，不含有识别待检测的抗原的抗体。“Fluo”代表荧光团。

用向对应于待检测的抗体的抗体溶剂添加的Dye 634-BSA荧光团所获得的结果：

表6：对于不同的荧光团剂量，Atto Dye 634-BSA荧光团的存在对被分析物的检测的影响。样品S1是含有与所用的重组蛋白质反应的抗体的样品。“Fluo”代表荧光团。

表6中所示的结果显示，Dye 634-BSA荧光团的存在对被分析物的检测没有影响，与荧光团剂量无关。在分析结束时获得的荧光信号完全可检测，并且可用于实施如在本申请中描述的数据处理方法。

实施例3：耐受性对照标记物用于确保用于检测在样品中的至少一种被分析物的方法的用途

材料和方法

(i)微量培养板的准备

在聚苯乙烯微量培养板(Greiner，Germany)的每个孔内，使用制造斑点机器人，成行沉积50nL含有一种或多种捕捉配体以及使用申请中所述方法选出的荧光团的溶液的液滴。

捕捉配体溶液可以是：

-作为抗体检测试验的一部分，是抗原或者抗原的混合物，其能够由与一种以上合成肽相联系的重组蛋白组成；

-或者在抗原检测试验的情况下，是针对寻求的标记物的抗体或抗体的混合物。

这些捕捉配体溶液含有被包括在0.1至0.5μg/mL之间的适合的剂量的选出的Atto 633-胺荧光团(Atto-tec，Germany)。这些微量培养板的每个孔的底部具有本领域技术人员本身已知的吸附能力。

将这样获得的斑点用本领域技术人员本身已知的饱和溶液饱和。随后将板干燥。

(i)分析方法的实施

对于在分析方法的实施期间使用的各种要素的描述：

I.报道物

Streptavidin-POD(S-POD)报道物是根据本领域技术人员公知的P.Nakane和A.Kawaoi[J Histochem Cytochem(1974)第22卷，第12号.第1084-1091页]所述的方法与过氧物酶(Roche Germany)偶联的链霉抗生物素蛋白(Roche，Germany)。

II.稀释剂

a)稀释剂步骤1

三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液50mM，pH 7.5，含有：NaCl 150mM、EDTA 20mM、500μg/mL的小鼠IgG(Meridian)、15％的奶牛乳(100％脱脂)、10％的绵羊血清、0.095％的NaN3。

b)共轭物1的稀释剂

三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液50mM，pH 7.5，含有：NaCl 150mM；EDTA 20mM、Chaps 0.1％、甘油10％、0.095％的NaN3。

c)共轭物2的稀释剂

柠檬酸盐缓冲溶液50mM，pH 6.7，含有：NaCl 150mM、EDTA 5.6mM、2％的Triton、10％的绵羊血清、500μg/mL的小鼠IgG、0.5％的Proclin 300^TM(Supelco公司的商标)、15％的奶牛乳(100％脱脂)、甘油10％、0.095％的NaN3。

d)Streptavidin-POD报道物的稀释剂

柠檬酸盐缓冲溶液50mM，pH 6.7，含有：NaCl 2053mM、0.5％的Tween 20^TM(Sigma公司的商标)、0.5％的Proclin 300^TM(Supelco公司的商标)、7％的奶牛乳(100％脱脂)、甘油20％。

e)洗涤溶液

三羟甲基氨基甲烷10mM缓冲溶液，pH 7.4，含有：NaCl 218mM、0.1％的Tween 20^TM(Sigma公司的商标)、0.002％的Proclin 300^TM(Supelco公司的商标)。

f)显影底物

ELISTAR ETA C Ultra ELISA显影底物(Cyanagen，Italy)由两种溶液组成：XLSE024L鲁米诺增强剂溶液(A)和XLSE024P过氧化物溶液(B)。

III.反应皿

免疫学反应在96孔微量培养板(Greiner，Germany)的孔中进行，所述微量培养板由聚苯乙烯制成，最大容量为392μL/孔。

IV.样品

使用的阴性样品(血清或血浆)来自里尔的法国血液机构。

V.光具座

所用的光具座由以下元件组成：

-照明系统，其发射集中在620nm的波长上的红色光，并且组装成使得它均匀照亮微量培养板的下面，

-远心物镜，其制成为使得可以将微量培养板的整个表面成像，

-滤光轮，其插入在远心物镜的输出透镜和照相机之间，

-照相机，其具有用被包括在0.001秒和250秒之间的曝光时间产生图像的能力，

-支持底盘，其支持全部元件(包括微量培养板)并使它们定位。

研究并组装光具座，使得它取得来自从微量培养板的下面的图像。进行物镜的调节，使得微量培养板孔的内面清晰。

滤光轮能够具有两种不同的滤光器：

-集中在680nm的波长的滤光器，使得可以仅允许对应于由荧光团发射的光的信号通过，

-使得可以允许被包括在400nm和700nm之间的所有波长通过的滤光器。

进行不同步骤的描述：

试验规程包括以下步骤：

步骤1：

1.在微量培养板的每个孔(包含斑点)中相继分配：

+20μl的稀释剂步骤1

+20μl的共轭物1稀释剂，其包含：来自第一步骤的待化验的被分析物的检测配体

+40μl的样品

2.将混合物在37℃伴随搅拌温育40分钟。

3.完成三次用至少400μl的洗涤溶液的相继洗涤。

步骤2：

4.将50μl的共轭物2的稀释剂分配到每个反应孔中，其含有来自第二步骤的待化验的被分析物的检测配体。

5.将混合物在37℃伴随搅拌温育15分钟。

6.进行洗涤步骤(同上第3点)。

步骤3：

7.将50μL的S-POD报道物分配到每个反应孔中。

8.将混合物在37℃伴随搅拌温育15分钟。

步骤4：

9.将25μL的显影溶液“B″分配到每个反应孔中。

10.将25μL的显影溶液“A″分配到每个反应孔中。

10.将混合物在37℃伴随搅拌温育1分钟。

11.进行荧光信号的获得10秒。

12.进行发光信号的获得180秒。

结果

A)在分析方法之后耐受性对照标记物的留存

在图2中的分析方法结束时，在12个孔中存在的9个斑点的每一个的耐受性对照标记物的荧光信号都是清楚地可识别的并且完全可测量的。

B)在分析方法结束时重新限定读取栅格的重要性：关于以下两种情况下由荧光获得的感兴趣的区域进行比较：相对于理论位置限定的读取栅格；和由由耐受性对照标记物的荧光发射的信号限定的读取栅格。

在图3中，实心白色圆显示斑点的理论位置，点线白色圆显示检测到的真实位置。斑点清楚地相对于它们的预期理论位置发生了移位。

此图像说明该方法的重要性，其总是使得可以通过耐受性对照标记物对准检测的真实斑点的位置，并且不导致由被分析物的检测配体的检测标记物发射的信号的读取中的错误。

C)在分析方法结束时重新限定读取栅格的重要性：关于以下两种情况下通过化学发光获得的感兴趣的区域的比较：相对于理论位置限定的读取栅格；和由耐受性对照标记物的荧光发射的信号限定的读取栅格。

基于由耐受性对照标记物产生的信号获得真实斑点的位置(点线)，并将所述位置用在通过化学发光的被分析物的配体的检测标记物的信号的图像获得中，在此示于图4中。斑点的理论位置用实线指明，并且清楚地显示相对于真实位置的移位。

在表7中，示出了位于预期的理论位置(实线)下和通过荧光真实检测的位置(点线)下的像素的化学发光的中值之间的比较。

表7：从斑点的理论存在区域的分析所测量的信号对比从该同一斑点的真实位置区域的分析所测量的信号

对含有产生信号的斑点的区域的分析提供了比相同斑点的理论存在区域明显更高的结果。信号的量化和获得的结果的准确性因此通过以下方式得以改善：使它自己基于检测到的源于耐受性对照标记物的真实定位栅格。

D)在分析方法之后劣化的斑点的实例，且它在没有校验斑点的完整性的情况下可能产生假结果。

基于由耐受性对照标记物产生的信号获得真实斑点的位置(点线)，并将所述位置用在通过化学发光的被分析物的配体的检测标记物的信号的图像获得中，在此显示(参见图5)。斑点的理论定位用实线指明。

在图像中(参见图5)，位于孔中央的斑点变形。围绕它的破碎的白线显示：软件检测到了斑点的真实形状，其使得可以在认可结果产生之前，分析它的完整性。在这种情况下，斑点的真实形状的圆形周缘使得可以消除此斑点并且不产生假分析值。