本发明有关于一种检测工具，特别指一种无酵素葡萄糖检测晶片。
背景技术：
糖尿病为目前全球最严重的健康问题。截至2015年，国际糖尿病联合会指出全球将近3.87亿人面临糖尿病的威胁，其中90％的人为第二型糖尿病病患。而第二型糖尿病指身体无法充分利用由胰腺所制造的胰岛素，导致其血糖不稳定，因此，对于第二型糖尿病患者来说，定期检测血糖对于维持血糖水平十分重要。
目前许多技术以被用于连续血糖监测，整体来说，电化学及光学方法为常被使用的技术。基于电化学感测器具有成本低、实用性高、简单操作等优点，因此，电化学感测器为目前商业上接受度最高的工具。更进一步来说，现有电化学感测器利用酵素法来达到检测葡萄糖浓度的目的。在酵素法中，葡萄糖通过葡萄糖特异性葡萄糖氧化酶催化而被氧化为葡萄糖酸内酯，其优点在于对于葡萄糖具有高反应，并且对于葡萄糖检测具有高特异性，但是，使用葡萄糖氧化酶具有以下缺点：需要复杂且多的固定步骤、对于热及化学的稳定性不佳、容易降解。
基于酵素法的缺点，使得目前如血糖试纸等检测血糖所需耗材，不仅制造成本高，并且保存不易，倘若葡萄糖氧化酶因为环境因素而降解，则会导致检测结果偏差。换言之，目前以酵素法所发展的血糖检测技术仍具有许多缺失需要改进。
技术实现要素：
本发明的主要目的在于提供一种无酵素葡萄糖检测晶片，其能在无葡萄糖氧化酶的环境下直接且准确地检测样本中葡萄糖浓度，而能减少传统血糖检测因为试纸酵素变质所造成的误差。
本发明的另一目的在于提供一种大量制备无酵素葡萄糖检测晶片的方法，其能够达到稳定品质、简化制造流程及降低成本的功效。
为能达成上述目的，本发明所揭一种无酵素葡萄糖检测晶片，其包含有：一基板，一检测部，设于该基板的一端面，复数凸部，设于该检测部，一导电层，设于该基板具有该等凸部的一面，复数金纳米颗粒，散设于各该凸部表面。
较佳地，各该凸部呈半球形。
较佳地，各该凸部呈柱状。
较佳地，各该凸部为微米等级大小。
较佳地，各该凸部的直径为1～20微米，举例来说，各该凸部的直径为1、2、5、10、12、15或20微米
较佳地，各该金纳米颗粒的直径为2～100纳米，举例来说，各该金纳米颗粒的直径为2、4、6、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100纳米。
再者，本发明揭露一种大量制备上述无酵素葡萄糖检测晶片的方法，其包含下列步骤：
步骤a：取一基材，在其一面涂布光刻胶涂层。
步骤b：以光微影蚀刻技术处理该基材，使该基材上含有复数个检测部，并且，各该检测部具有一光刻胶阵列。
步骤c：将一金薄膜溅镀于该基材具有该光刻胶阵列的表面。
步骤d：将该基材裁切为复数个基板，而各该基板上包含一检测部。
步骤e：使金纳米颗粒均匀地被散设于各该光刻胶阵列表面。
步骤f：获得大量无酵素葡萄糖检测晶片。
较佳地，更包含一热熔融步骤，设于该步骤b及c之间，通过高于光刻胶的玻璃转化温度的温度，使该光刻胶阵列变形。
较佳地，更包含一封装步骤，设于该步骤e及f之间，使一封装层盖设于该基板上除该检测部外的区域。
较佳地，更包含一封装步骤，设于步骤f及g之间，使一封装层盖设于该基板上除该检测部外的区域。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的无酵素葡萄糖检测晶片及其制备方法，能在无葡萄糖氧化酶的环境下直接且准确地检测样本中葡萄糖浓度，而能减少传统血糖检测因为试纸酵素变质所造成的误差，并且制作过程简单、成本低、容易保存。
附图说明
图1a为清洁硅晶片及光刻胶涂层的示意图。
图1b为曝光与显影的示意图。
图1c为热熔融步骤的示意图。
图1d为金薄膜溅射及设置金纳米颗粒。
图2a为一大型基板上刻蚀复数检测部的示意图。
图2b为本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片封装的示意图。
图2c显示本发明所揭各该凸部为微米/纳米杂合的结构。
图3a为在45度的视角观察金溅射步骤后的半球状阵列。
图3b为单个凸部的高度放大图像。
图3c为在设置金纳米颗粒步骤后，观察该凸部阵列的结果。
图3d为在设置金纳米颗粒步骤后，观察单个凸部的结果。
图4a为本发明所揭凸部与普通金电极的循环伏安图，其中，红线代表普通金电极，蓝线代表本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片。
图4b为根据图4a所得本发明所揭凸部与普通金电极的电流-时间曲线图，其中，红线代表普通金电极，蓝线代表本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片。
图4c为通过循环伏安法在不同扫描速率下分析本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片所得的循环伏安图。
图4d为显示扫描速率的平方根与电流间的线性关系，其中，红线代表普通金电极，蓝线代表本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片。
图5a为本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片通过循环伏安法在葡萄糖浓度下检测所得到的循环伏安图。
图5b为本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片以电流分析法所得到结果，其中，方框内代表相关标准曲线。
图6为本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片依序注入葡萄糖、抗坏血酸及葡萄糖的检测结果。
图7为检测本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片稳定性的结果。
具体实施方式
本发明揭无酵素葡萄糖检测晶片包含一基板，一检测部，设于该基板一端面，复数凸部，均匀布设于该检测部，一导电层，设于该基板具有该等凸部的一面；复数金纳米颗粒，均匀布设于各该凸部表面。本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片以具有金纳米粒子的凸部作为电极，其为微米与纳米所组成的结构，能够直接地与葡萄糖反应，而不须有任何葡萄糖氧化酶或/及任何介质。
本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片由光微影蚀刻术、光阻热熔法及金薄膜溅射步骤所制备。首先，通过光微影蚀刻术，使该基板上具有光刻胶阵列后，进行光阻热熔法，通过加热软化该光刻胶阵列，再进行金薄膜溅射步骤，使该基板上具有金纳米薄膜，而后使金纳米粒子设置于各该具有金薄膜的凸部表面，而可获得本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片。
而将上述制备方法应用于大尺寸的基材上时，可同时在该基材上制作出多个无酵素葡萄糖检测晶片，也即该基材可裁切成为复数个适当大小的基板，并且，使各该基板上具有一个检测部。
请参阅图1，本发明的实施例中揭露一连续制造出本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片10，所包含步骤如下所述。
(一)清洁硅晶片及光刻胶涂层
取一由预定大小的硅晶片所组成的基板20，依序在丙酮、酒精及去离子水中分别以超音波清洗，再以氮气吹该基板20，并且以热板去除残留的水分。
首先，在该基板20上涂布六甲基二硅氮烷(hmds)，用以增加基板表面与光刻胶(photoresist)涂层间的粘合度，再将光刻胶旋涂方式涂于该基板20表面，形成一光刻胶层30。
以本发明的一实施例来说，光刻胶为az1518正光刻胶，其所使用的旋涂参数如下：第一级的旋转速度为500rpm，旋转时间为10秒；第二级的旋转速度为1500rpm，旋转时间为40秒，而光刻胶层的涂布厚度约为1～10μm，又以3μm为佳。
最后，将该已具有光刻胶层的基板进行以如烘烤等方式进行干燥。
(二)曝光与显影
使用光罩对准机将所需图案转移至该基板20上的光刻胶层30。而后以2.38％tham显影液处理，结果如图1b所示，得到一含有具有柱状光刻胶阵列40的硅晶片。
在本发明的一实施例中，光罩对准机的型号为evg620，光源强度为约22mw/cm2(i-line)，曝光时间约为7.5秒，而在显影时间为约50秒。
显影状况得以光学显微镜确认。
(三)热熔融步骤
通过逐步增加环境温度而高于光刻胶的玻璃转化温度，基于表面张力的影响，使该柱状光刻胶阵列40在热熔融过程中逐渐形成一半球状光刻胶阵列50，具有复数个凸部51，如图1c所示。
在本发明的一实施例中，az1518正光刻胶的玻璃转化温度为130℃，并且，在5分钟内使环境温度逐渐增加至150℃。
再者，在制作本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片的过程中，热熔融步骤在于使柱状光刻胶阵列变为半球形光刻胶阵列，但是，热熔融步骤非制作无酵素葡萄糖晶片的必要步骤，也即若所要使用的光刻胶阵列为非半球形时，可省略 此步骤。
(四)金薄膜溅射及沉积金纳米颗粒
热熔融步骤后，先以直流溅镀法溅射金薄膜60在该基板20具有该半球形光刻胶阵列50的表面后，再将该等金纳米颗粒61均匀接设于各该半球形光刻胶阵列表面，以能获得本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片，如图1d所示。
在本发明的一实施例中，以直流溅镀机在基板上溅镀金薄膜层，溅镀条件如下：压力为0.08毫巴，电流为30毫安，处理时间为135秒。为能确保溅射金薄膜的均匀性，样品通常会以5℃/分钟的加热速率加热至120℃，并且保持该温度约80分钟，最后再将样品冷却至室温。
更进一步来说，为能确保感测区域的一致性，也得增加一封装步骤，而该封装步骤能在金纳米颗粒沉积前或后进行。
在本发明的一实施例中，通过网版印刷技术进行封装。详言之，取一基材，依据前述实施例的光微影蚀刻术、光阻热熔法及金薄膜溅射等步骤加以处理后，再将该基材进行裁切，裁切成为复数块基板，而各该基板上具有一检测部。将裁切好的该基材以一胶带固定，而后以特定图案的网印版对准该基材，涂上油墨后，使油墨覆盖除感测部外的区域，移除网印版，待油墨干燥后，再自该胶带上逐一移除已裁切的各该基板，再进行后续金纳米颗粒沉积等步骤。
在本发明的一实施例中，先将导电银线设于一载玻片上作为导线，再以一预定大小且具有一孔的封口膜与该无酵素葡萄糖检测晶片相粘合，使该封口膜上的孔对应该检测部，并且该封口膜用于覆盖住该无酵素葡萄糖检测晶片上的非检测部的区块及该载玻片。
在本发明的一实施例中，在溅镀完金薄膜层后，以分子层修饰各该凸部表面，例如以aptms分子溶液修饰各该凸部表面。
本发明所揭金纳米颗粒以本发明所属本领域技术人员的公知技术加以制备，详细技术内容可参考i.-c.ni,s.-c.yang,c.-w.jiang,c.-s.luo,w.kuo,k.-j.lin,etal.,formationmechanism,patterning,andphysicalpropertiesofgold-nanoparticlefilmsassembledbyaninteraction-controlledcentrifugalmethod,thejournalofphysicalchemistryc,116(2012)8095-101，在此不加以赘述。
请参阅图2a和图2b，其为本发明所揭另一较佳实施例的制备流程：该基材90’为8吋硅晶片(厚度约700μm；升阳半导体国际，台湾)，在其上设有约80个呈圆形的检测部22’，其直径约为8毫米。以光微影刻蚀技术在各该检测部上刻蚀出超过2百万个以六角紧密排列的柱状光刻胶阵列，而后以热熔融技 术该柱状光刻胶阵列形成半球状的光刻胶阵列50’，具有复数个凸部51’，其中，各该凸部51’的直径及彼此间的间距皆为3μm。将该基材90’具有检测部22’的表面先溅镀金薄膜及其修饰，再裁切为复数各基板20’，而各该基板20’上含有一检测部22’。将裁切好的该基材90’以网版印刷技术进行封装，使各该基板20’上除该检测部22’的区域上覆盖一封装层70’，完成封装后，使金纳米颗粒61’沉积于各该凸部51’上，完成复数个本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片10’。更请参阅图2c，该无酵素葡萄糖检测晶片10’能通过各该凸部51’上的金纳米颗粒61’与葡萄糖80’反应，达到以无酵素的方式检测葡萄糖汁效果。
而在本发明的一实施例中，该凸部的排列方式非六角排列，也可达成本发明的功效。
此外，在本发明所揭实施例中，该基材的尺寸及该检测部的尺寸可依据制造需求而改变，举例来说，该基材可使用6吋硅晶片，并且，在该6吋晶片上以设置40个检测部为佳。
以下将通过若干实例并搭配图式，说明本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片的结构及其效能，其中，以下实例以sp-150恒电位仪(bio-logic,usa)作为电化学检测仪器。
实例一：观察无酵素葡萄糖检测晶片的制作过程
请参阅图3，其使用场发射电子显微镜(fieldemissiongunscanningelectronmicroscopy；jsm-6700f,jeol,japan)观察本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片的半球状阵列凸部的外观。
图3a为显示成功热熔融后，将光微影技术所形成的柱状凸部阵列转换成为半球状凸部阵列。各该半球状凸部的高度约为2微米，如图3a中的方框所示，并且各等半球状凸部均匀排列。
图3b为显示各该凸部的直径约为4微米。由于表面张力及书水性，在热熔融步骤后，该正光刻胶层的图案区域有些许扩张。
请再参图3c及图3d，其指出金纳米颗粒均匀地沉积于各该凸部表面，并且，使各该半球形凸部的外型仍维持完整性。而金纳米颗粒的尺寸约为20nm(如图4d的方框所示)。
实例二：循环伏安法分析本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片
在本实例中以循环伏安法在0.1m磷酸盐缓冲液(ph值为7.0)中，以扫描速率50mv·s-1，估算本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片的凸部实际感测区域，结果如图4a及b所示。
请参图4b，在水平线下的区域为0电流，代表电极进行完全还原所需的总电荷，因此，图4b为显示对于本发明所揭凸部来说，水平线下的区域面积为1120.6μc。基于1平方公分金电极需要390μc的总电荷以形成氧化金，是以，本发明所揭凸部的有效感测区预估计为2.873平方公分(1120.6μc/390μc)普通金电极的循环伏安图。而本发明所揭凸部的水平线下的几何区域大约为普通金电极的10.2倍。
再者，以不同扫描速率：25、50、75、100、150、200、250、300、350、400mv·s-1在含有5.56mm葡萄糖电解质的0.1m氢氧化钠溶液中，通过循环伏安法观察本发明所揭凸部，结果如图4c所示。由图4c的结果可知，随着扫描速率的增加，峰电流及峰电位也增加。典型扩散反应可以通过下列randles–sevcik方程式进行确认：
其中，
本发明所揭凸部的该峰电流与扫描速率的线性关系如图4d所示。由图4d的结果可知峰电流与扫描速率的平方根具有高度且线性的关联性。因此，本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片表现出典型扩散控制的电化学行为，而能够适合于含有实际定量分析的应用。再者，以randles–sevcik线的斜率来说，本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片约为普通金电极的2.7倍，也即本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片具有更佳的质量传递效率。
实例三：分析本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片的灵敏度
通过循环伏安法，以扫描速率50mv·s-1，在0.1m氢氧化钠溶液中含有不同浓度的葡萄糖：0、0.06、0.28、0.56、1.39、2.78、4.16、5.56、6.94、8.32、9.71、11.10及13.89mm的条件下，得到如图5a所示循环伏安图，其中每次测量皆重复5次。
再者，连续加入1mm葡萄糖至本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片，并且以电流分析法进行分析，结果如图5b所示。详言之，将本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片浸泡于持续搅拌的0.1m氢氧化钠溶液，并且提供0.1v的恒定电位。而后，将1mm葡萄糖定期加入氢氧化钠溶液中，并且随着处理时间纪录轨迹。安培电流随着每次加入葡萄糖而快速增加。此外，在本分析中，重新排列每一 步骤所测得的电流与其相关葡萄糖浓度，描绘出如图5b的方框所示标准曲线。
由图5a的结果可知，线性检测的范围为55.56μm至13.89mm，高r2值为0.9985。由此结果可计算出本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片的敏感度为749.2μa·mm-1·cm-2，检测极限为9μm。而由图5b的结果可知，标准曲线是线性正比于葡萄糖浓度范围在1～13mm，具有0.9976的相关系数，并且，灵敏度为222.3μa·mm-1·cm-2。
根据上述结果可知，本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片的高灵敏度来自于其具有较大的有效感测面积，能够使相当量葡萄糖氧化。
实例四：分析本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片的选择性
人体血液中如抗坏血酸等其他物质会干扰葡萄糖检测仪器的效能，此原因在于正常人体内的葡萄糖浓度(3-8mm)较干扰物质浓度(～0.1mm)高很多，因此，将葡萄糖与抗坏血酸的浓度比降为10可用于检测本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片的选择性。
将本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片在可操作电位0.1v的条件下，依序注入1mm葡萄糖、0.1mm抗坏血酸及含有1mm葡萄糖的0.1m氢氧化钠溶液，进行检测，结果如图6所示。由图6的结果显示本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片几乎不受到抗坏血酸的干扰。
实例五：分析本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片的稳定性
以含有5.56mm葡萄糖的0.1m氢氧化钠溶作为电解质，通过20次循环伏安循环检测本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片的稳定性，结果如图7所示。
因为电解质未被搅拌，葡萄糖氧化反应在第一次扫描时会是最强及最迅速，是以，第一次循环伏安扫描的波峰高于后续的扫描。第一次扫描后，在电极(即该凸部)表面附近的葡萄糖被反应而消耗，导致后续扫描所得观察的反应减少。惟，第二次扫描后，波峰电流变化很小，此乃因为葡萄糖持续扩散至电极表面，并且扩散及反应速度几乎相同，使得反应于后续扫描产生些微变化。由此结果显示，本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片具有高稳定性。
此外，本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片在室温下储存于空气中两个月后，其检测性能仍保持不便。换言之，本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片保存容易，不受外界环境因素影响而变质或变性，完全解决习知葡萄糖检测试纸会受到环境因子而变质的缺失。
实例六：功效比较结果
由文献中找到其他无酵素葡萄糖感测器，如下表一所示：
表一：不同无酵素葡萄糖感测器
而比较上述标号1-7的无酵素葡萄糖检测器与本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片的灵敏度、检测最低极限(lod)、线性范围，结果如下表二所示。
表二：比较各该无酵素葡萄糖检测工具的灵敏度、检测最低极限、线性范围
由上表二的结果可知，本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片不论是稳定度、灵敏度、检测最低极限或线性范围皆显著优于目前已知无酵素葡萄糖检测工具。
通过上述说明可知，本发明所揭无酵素葡萄糖检测晶片具有制作过程简单、成本低、容易保存的优点。
以上仅是通过各该实例详细说明本发明，熟知该技术领域的人员在不脱离本发明精神下，而对于说明书中的实施例所做的任何简单修改或是变化，均应为本案权利要求所涵盖。