基于双通道正交探测的双色受激拉曼散射成像系统的制作方法

本发明属于非线性光学成像领域，具体为一种可同时探测两个拉曼振动频率的受激拉曼成像系统。

背景技术：

受激拉曼成像技术是近年来迅猛发展的一种非性线光学成像手段，它是拉曼散射与受激辐射技术的有机结合。因此，受激拉曼散射技术具备以上两种技术的优点：1，受激拉曼散射的强度与被测物浓度成线性关系；2，信号强度高，信噪比高，图像质量好；3，无非共振背景干扰，不存在光谱失真现象。

但是，受激拉曼成像系统的每单次扫描只能针对一个拉曼振动频率进行成像，即单色成像。这也是受激拉曼成像系统一直以来饱受困扰的一个不足之处。近年来，世界上多个研究小组也设计出了几个可以实现多色受激拉曼成像系统。但在些方案之中，有的大量增加了实验设备的数量；有的使系统光路变的非常复杂，难以操作；还有的使数据处理变得非常复杂。相比较而言，高光谱受激拉曼成像系统易于实现，且成本低廉。

首先用高折射率的介质对泵浦光和斯托克斯光进行啁啾，把两束脉冲激光的每个波包在时间进行展宽。然后在其中一束光的光路中加上一个光学延迟线，对两束光的相对时间延迟进行调节。这样就可以在一定范围内（一般为200cm^-1左右）连续改变泵浦光和斯托克斯光之间的频率差，如此就可以实现多色受激拉曼成像了。但它的主要缺点是，光学延迟线位置的调整需要一定的时间，并不能做到实时探测两种或更多的拉曼振动频率。这对于需要双色成像而又快速移动的被测物来说，势必还是会引入误差。

本发明正是一种基于高光谱受激拉曼成像系统的双色受激拉曼成像系统，可实时对两个拉曼振动频率进行成像，不仅成功避免了由于被测物的移动带来的成像误差，而且大大提高了成像速度。该系统的可靠性也得到了验证。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种成像速度快、可靠性高的可以实时探测两个拉曼振动频率的受激拉曼成像系统。

本发明提出的可实时探测两个拉曼振动频率的受激拉曼成像系统，是基于光谱聚焦和锁相放大器双通道正交探测的，是经过改进的高光谱受激拉曼成像系统。如图1所示，系统包括：线偏振的两束飞秒脉冲激光（斯托克斯光和泵浦光），电光调制器，信号发生器，2个光学延迟线，偏振光束分光器，半波片，二相色镜，显微镜，短通滤色片，光电二极管，锁相放大器，计算机；其中，线偏振的两束飞秒激光作为系统的光源，由高折射率的介质分别将它们啁啾；斯托克斯光被电光调制器调制，调制频率为激光脉冲重复频率的四分之一；该频率同步过程通过信号发生器完成，信号发生器把在斯托克斯光路中采集到的激光脉冲重复频率作为参考频率；调制后的斯托克斯光经过第一光学延迟线后进入偏振光束分光器，一部分斯托克斯光被直接反射，另一部分斯托克斯光则透过偏振光束分光器后，经过含有第二光学延迟线的光回路，再次经过偏振光束分光器，与被直接反射的那部分斯托克斯光重新合并在一起；斯托克斯光经过半波片，然后由二相色镜把它和泵浦光重合并一起导入显微镜；用受激拉曼光损失的方式采集信号，在显微镜载物平台下放置一个聚光镜用于收集透射光，收集到的光经过短通滤色片后由光电二极管将其转化为电信号，再输入到锁相放大器中；信号经锁相放大器解析后经由其两个正交输出通道输送给计算机。

本发明系统中，确定双色成像的限制条件为：在时间维度上，测量出斯托克斯光的的干涉特性以及泵浦光和斯托克斯光之间的相互作用特性，以确保在成像时泵浦光和斯托克斯光之间的时间延迟不超过它们之间的相互作用的时间范围，并且，两个输出通道的信号没有相互干扰。

本发明系统中，实现双色受激拉曼成像的过程为：使用同一台计算机来控制显微镜扫描单元和接收锁相放大器的信号，恰当设置信号的积分时间和显微镜的扫描幅度和速度，就可以实现对样品的成像。

和高光谱受激拉曼成像系统一样，本发明的双色受激拉曼成像系统可以通过调节系统中光学延迟线的位置来定位想要探测的拉曼振动频率。在所确定双色成像的限制条件下，配合调节图1中所示的两个光学延迟线的位置就可以成功实现对两个不同拉曼振动频率的检测，也就是能对不同的分子各类进行成像，即双色成像。

本发明巧妙地把光谱聚焦法和锁相放大器的双通道正交输出结合起来，光路设计简单，改进成本低，一旦优化完成后无需再调节任何光电子器件，因此系统非常稳定。它可以实现：

（1）对脂质和蛋白质进行实时双光谱成像，有望为病理检测提供实时图像信息；

（2）消除样品移动所带来的光谱误差，为活体和动态检测提供技术支持；

（3）在对多种成分的样品进行光谱成像,或者对大面积样品进行成像时，将成像速度提高到原来的2倍以上。本发明将对受激拉曼成像技术的临床应用起到极大的推动作用。

附图说明

图1为双色受激拉曼成像系统示意图。

图2为斯托克斯光干涉特性以及斯托克斯光与泵浦光互相关特性曲线。

图3为油酸的自发拉曼光谱和双通道受激拉曼光谱。

图4为油酸和牛血清白蛋白的受激拉曼光谱以及不同扫描模式下的海拉细胞图像。

图5为小鼠脑组织切片整体与局部放大图。

具体实施方式

搭建与测试双色受激拉曼成像系统的步骤如下：

（1）改造斯托克斯光。

如图1所示，本发明所搭建的双色受激拉曼成像系统建立在高光谱受激拉曼成像系统的基础上。将均为线偏振光的泵浦光和斯托克斯光的脉冲分别用啁啾介质在时间上展宽。在斯托克斯光路中采集激光脉冲的重复频率被用作信号发生器的参考频率来产生光电调制器的调制频率和锁相放大器的解析参考频率（激光重复频率为80MHz，电光调制和锁相放大器的解调频率均为20MHz）。电光调制器可以周期性地改变斯托克斯光的偏振特性。这样，斯托克斯光在经过第一光学延迟线后遇到偏振光束分光器时，被反射部分的光强就会随电光调制器的调制周期而变化；透射部分的光强亦然。由于反射和透过偏振光束分光器的斯托克斯光是此消彼长的关系，所以它们在时间上会存在1/2个调制周期延迟，也就是在电光调制相位上相差了180度。接下来，让透射部分的斯托克斯光经过第二光学延迟线，再次经过偏振光束分光器，让它与反射部分的斯托克斯光重合。只要适当设定第二光学延迟线的位置，就能使两部分斯托克斯光再次相遇时的调制相位差为90度或270度。也就是说，被开关调制后的斯托克斯光在经过一个偏振光束分光器和一个包含第二光学延迟线的光回路后被改造成了含有两分量的斯托克斯光，且这两个分量在调制相位上是正交的。然而，它们的偏振方向也是互相垂直的，此时就需要在光路中加入一个半波片来调整它们的偏振方向，使其各自在泵浦光偏振方向上的线偏振分量相等。这样改造后的斯托克斯光通过一个二向色镜与啁啾后的泵浦光合并后导入显微镜，经过物镜打到样品就会产生两个正交的受激拉曼信号。将发生受激拉曼过程后的光用一个聚光镜收集，再经过一个短通滤色片把斯托克斯光去除掉，采用受激拉曼光损失的方式利用光电二极管检测泵浦光的强度。光电二极管的电信号被输入到锁相放大器，它的两个正交输出通道（X和Y）就可以解析出两个正交的受激拉曼信号了。最终将这两个信号输入到控制显微镜的计算机可以实现实时双通道受激拉曼成像了。

（2）测量斯托克斯光的干涉特性，实现双色成像。

上步骤中，如果斯托克斯光的两个分量在调制相位上是严格正交的，那么它们的单个激光脉冲在时间上是严格重合的，必然产生干涉现象。如图2（A）所示，当两束斯托克斯光间的延迟时间达到800飞秒以上时，它们之间就几乎没有干涉了。也就是说，可以通过微调第二光学延迟线的位置来避免斯托克斯光两个分量间的干涉，以此来避免锁输出通道X和Y输出通道的干扰。从图2（B）可以看出，泵浦光和斯托克斯光之间的延迟在4皮秒左右时依然可以发生相互作用，这个延迟时长远大于800飞秒，这就保证了系统的可行性。

另外，在高光谱受激拉曼成像系统中，光学延迟线的位置会决定系统时所探测的拉曼振动频率。在本系统中也是一样的：第一光学延迟线的位置决定了被偏振光束分光器直接反射的那部分斯托克斯光所产生的受激拉曼信号所探测的拉曼振动频率；第二光学延迟线的位置可以决定透过偏振光束分光器的斯托克斯光探测的拉曼振动频率。综上所述，第二光学延迟线主要有三个功能：1，产生90度的调制相位差；2，避免两部分斯托克斯光之间的干涉；3，选择与反射部分的斯托克斯光不同的所要探测的拉曼振动频率。

（3）检测两输出通道间的串扰。

在上一步骤中，为了避免两个信号间的干扰和探测两个不同的拉曼振动频率需要调整第二光学延迟线的位置，这样一来，两个通道的信号就不能保持严格的相位正交的关系。不过，四分之一个调制周期（对应90度相位延迟）约为12.5纳秒，远远大于为避免干扰和选择不同的拉曼振动频率所需引入的光学延迟（最多不过几皮秒）。也就是说，选择拉曼振动频率和避免干涉发生的同时，两通道信号的相位正交特性只受到了极小的影响。如图3所示，图3（A）是油酸的自发拉曼谱，图3（B）是双色受激拉曼系统的两个通道同时测得的油酸的受激拉曼光谱，从图中可以看出，两个受激拉曼光谱几乎完全一样，并且都与自发拉曼光谱基本相同。这说明了X和Y通道的信号几乎不存在串扰。

（4）用不同样品验证测试系统性能。

分别用单一成分样品，活细胞样品和小鼠脑切片样品测试系统性能。

图4（A）给出了X通道的油酸（代表脂类）和牛血清白蛋白（代表蛋白类）的受激拉曼散射光谱，以及Y通道的油酸的受激拉曼散射光谱。图中的两个灰色柱状条纹标出了对细胞成像所要探测的拉曼峰位。第一光学延迟线（图1）的位置在8.78（d1）和9.11（d2）毫米处时分别对应自发拉曼光谱的2850和2930cm^-1峰位，在这两具位置分别可以得出脂类的信号和脂类与蛋白类叠加的信号。也就是说，可以在2850cm^-1处得到脂类的信号，用2930cm^-1处的信号减去脂类的信号就可以得到蛋白的信号，然后再将脂与蛋白的信号合成在一张图中就可以得到样品中脂类与蛋白的分布情况了。图4（B）给出了用本发明高光谱受激拉曼成像系统在逐帧扫描的模式下拍到的细胞图像，此模式需要通过移动光学延迟线，使其固定在d1的d2两个位置才能得到两种成分的分布图。由于活体样品内部有不确定各种成分的运动，这种逐帧扫描的模式下得到的图像在后期处理里势必引入人为的误差。图4（B）中的箭头就标出了由于脂滴的漂移而引入的误差。然而在对应的图4（C）中，采用本发明双色受激拉曼成像系统，只需要把第一光学延迟线的位置固定在d2一个位置上就可以拍到的细胞图像，这就避免了由于活细胞内各种成分的运动带来的图像误差。

图5是小鼠脑切片的受激拉曼图像，其中图5(A)是脑切片的整体图像，图5(B)到5（F）分别是脑皮层，尾壳核，丘脑下体，海马区和胼胝体的局部放大图像。本发明用双色模式成功地对小鼠的离体脑组织进行了成像，并把成像速度提高到了高光谱受激拉曼成像系统的逐帧扫描模式的两倍以上。