呼吸道合胞病毒IgA抗体检测试纸条及其检测方法与流程

本发明属于医学检验领域，具体地公开了一种呼吸道合胞病毒IgA抗体检测试纸条及其检测方法。

背景技术：

呼吸道合胞病毒(RSV，简称合胞病毒，也属副粘病毒科)是引起小儿病毒性肺炎最常见的病原，可引起间质性肺炎，及毛细支气管炎。呼吸道合胞病毒根据分子生物学可化分为2种亚型，A型和B型。呼吸道合胞病毒经空气飞沫和密切接触传播，潜伏期3～7日。婴幼儿症状较重，可有高热、鼻炎、咽炎及喉炎，以后表现为细支气管炎及肺炎。少数病儿可并发中耳炎、胸膜炎及心肌炎等。本病多见于婴幼儿，其中半数以上为1岁以内婴儿，男多于女，其比例约为1.5～2：1。初期可见咳嗽、鼻堵塞，多数病例有高热，最高可至41℃，高热时间多数为1～4天，少数为5～8天。轻症病例呼吸困难及神经症状不著，中、重症有较明显的呼吸困难、喘憋、口唇青紫、鼻扇及三凹征，少数重症病例也可并发心力衰竭。近十年来合胞病毒肺炎及毛细支气管炎占我国婴幼儿病毒性肺炎第一位，其症状与副流感病毒肺炎、轻症流感病毒肺炎及轻症腺病毒肺炎临床上几乎无法区别，但是呼吸道合胞病毒与副流感病毒、流感病毒、腺病毒的治疗方法有较大的不同。呼吸道合胞病毒的特异性用药是利巴韦林和帕利珠单抗。一般可用利巴韦林(三氮唑核苷)雾化治疗，短期大剂量雾化治疗合胞病毒感染有效。早期对呼吸道合胞病毒的诊断对治疗有很大的价值，可以降低患者的住院时间和费用，降低社会的医疗负担。

呼吸道合胞病毒的早期诊断方法较多，主要有组织细胞培养技术、血清学、分子生物学三个领域技术。传统方法比较常用的包括细胞分离培养、血清IgM抗体ELISA检测、血清IgM抗体免疫荧光检测、PCR核酸检测。细胞分离培养是呼吸道合胞病毒感染确定的金标准方法，但是由于时间长(超过5天)、实验条件要求高、操作人员技术要求高等缺点限制了其在临床诊断应用。血清学IgM抗体ELISA检测和血清IgM抗体免疫荧光检测是临床应用较广的方法，通过检测血清中呼吸道合胞病毒IgM抗体了解患者近期感染病毒的情况，对临床诊治有一定的帮助。但是很多呼吸道合胞病毒患者是小于3岁的儿童，较多幼童的血管较细，而且对抽血有恐惧感，因此给临床医护人员操作带来一定的难度。另抗体免疫荧光检测需要专业的人员和专门的荧光显微镜，这限制了其在临床的推广能力。PCR核酸检测是呼吸道合胞病毒早期检测方法中灵敏度最高的方法，通过检测患者咽喉部细胞中的呼吸道合胞病毒判断感染情况。该技术需要专业的技术人员和专门荧光PCR扩增仪，基层医疗部门比较难开展该诊断方 法。荧光PCR技术需要采集患者咽喉部细胞，较容易引起患者不适造成反呕或者呕吐发生。呼吸道合胞病毒是属于下呼吸道感染，因此采集咽喉拭子有时采集不到病毒感染的细胞，造成漏检现象。

当呼吸道合胞病毒通过呼吸道系统侵入人体，人体免疫系统开始启动第一道防线，是通过粘膜免疫进行防疫阻止呼吸道合胞病毒在人体的定植。粘膜免疫主要是通过唾液产生病毒特异性的IgA抗体抵抗病毒侵染，因此病毒IgA抗体产生可以预示病毒感染情况发生。本发明是检测患者唾液中呼吸道合胞病毒IgA抗体，是一种无创的检测技术，容易被患儿接受。而且采用的是快速层析法，检测时间小于30分钟，可以方便基层医疗部门和现场检测，提高医护人员的工作效率，尽早对症治疗，缩短患者康复进程。

技术实现要素：

为了克服现有技术存在的问题，本发明提供一种呼吸道合胞病毒IgA抗体检测试纸条及其检测方法。

本发明首先提供了一种呼吸道合胞病毒IgA抗体检测试纸条，包括样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜、吸水纸、背板，所述的纤维素膜包括喷涂有呼吸道合胞病毒融合蛋白抗原多肽片段的检测线和人IgA抗体的对照线。

进一步地，所述呼吸道合胞病毒融合蛋白抗原多肽片段的氨基酸序列如序列表Seq ID NO.1所述。

进一步地，所述样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜、吸水纸均粘附在背板上。

进一步地，所述的标记垫含有抗人IgA抗体标记上胶体金，所述抗人IgA抗体包括羊抗人IgA多克隆抗体、鼠抗人IgA单克隆抗体、兔抗人IgA单克隆抗体、兔抗人IgA多克隆抗体。

进一步地，所述试纸条检测人的唾液标本。

进一步地，所述唾液标本通过将无菌脱脂棉放置于待测对象舌下，吸附唾液后再用注射器挤压出的方法获得。

本发明还提供了利用所述试纸条检测呼吸道合胞病毒IgA抗体方法：采集待测对象唾液标本，并利用该唾液标本与所述试纸条接触进行检测。

进一步地，所述唾液标本的采集方法为：将无菌脱脂棉放置于待测对象舌下，吸附唾液后再用注射器挤压出唾液标本。

进一步地，所述无菌脱脂棉用棉线捆绑。

本发明的内容还包括一种人唾液标本的采集方法：将棉线捆绑的无菌脱脂棉放置于待测 对象舌下，吸附唾液后再用注射器挤压出检测标本。

本发明的有益效果为：

本发明通过无菌脱脂棉采集唾液标本，再将唾液标本用注射器挤出，通过呼吸道合胞病毒IgA抗体快速层析纸条检测唾液中的IgA抗体，实现快速诊断患者感染呼吸道合胞病毒的目的。本方法操作简单，结果快速，适合各级医疗机构快速诊断呼吸道合胞病毒感染。采集标本无侵入性，避免传统的采血和采集鼻咽拭子给病人带来不适，也提高医护人员的工作效率，提高呼吸道合胞病毒诊断在临床上推广率。

为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。

附图说明

图1为本发明检测唾液中呼吸道合胞病毒IgA抗体的试纸条结构示意图。

图2为注射器挤压唾液示意图。

图3为胶体金纸条测试示意图。

图4为本发明试纸条检测呼吸道合胞病毒IgA抗体的阳性示意图。

图5为本发明试纸条检测呼吸道合胞病毒IgA抗体的阴性示意图。

图6为本发明试纸条检测呼吸道合胞病毒IgA抗体的无效示意图。

具体实施方式

【实施例1】呼吸道合胞病毒IgA抗体诊断试剂条制备

1、原料来源：羊抗人IgA抗体购自Sigma公司，人IgA抗体购自广州市诺思生物科技有限公司。呼吸道合胞病毒融合蛋白抗原多肽片段的序列为Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val(Seq ID NO.1)，总共43个氨基酸，委托上海吉尔生化公司负责合成，纯度大于98％，冻干保存。

2、羊抗人IgA抗体胶体金标记垫制备

在pH值6.8-7.0溶液内，羊抗人IgA抗体与胶体金颗粒标记形成羊抗人IgA抗体胶体金标记物(标记量为25ug/ml)，封闭液成分为PEG20000和BSA蛋白。将胶体金标记物喷涂到玻璃纤维膜上，稀释参数为30cm²/ml，并在湿度15％，温度30℃条件下干燥12小时以上，制备的胶体金标记垫密封备用。

3、硝酸纤维素膜包被

用包被液稀释人IgA抗体、呼吸道合胞病毒F蛋白抗原多肽片段，其中人IgA抗体的浓度为1.5mg/ml，呼吸道合胞病毒F蛋白抗原多肽片段浓度为1mg/ml。如附图1，将两者均匀喷涂到NC膜上，其中人IgA抗体喷到NC膜上C位置，呼吸道合胞病毒F蛋白抗原多肽片段喷到NC膜上T位置。将喷涂好的NC膜放置在湿度10-30％，温度20-35℃条件下烘干处理12小时以上，烘干好的NC膜密封备用。

4、组装、切条

结合附图1示意图，将吸水纸4、硝酸纤维素膜3、胶体金标记垫2、玻璃纤维膜1按顺序黏贴在pvc背板5上，然后调整切条机参数进行切条，切成4mm宽度的试纸条。

【实施例2】无菌脱脂棉制备

采购直径为2cm的医用脱脂棉球，捆绑上长度为8-10cm的棉线。将处理好的棉球放置高压锅中，压力条件121℃30分钟，高压后放置烤箱中干燥，温度100℃，时间4小时，干燥后的棉球铝箔袋真空密封。

【实施例3】唾液标本采集

本发明是将无菌脱脂棉放置到幼儿的舌下，棉线暴露在口外，口含3-5分钟。如附图2，将棉球22，放置到注射器21中，然后装上注射器推动杆，轻缓推动，获得唾液标本23，用2ml小管保存。

【实施例4】标本测试

结合附图3说明，将呼吸道合胞病毒IgA纸条放置到装有唾液标本的小管中，样品垫端接触唾液标本，放置15-30分钟，然后肉眼观察结果。

如果唾液标本中含有呼吸道合胞病毒IgA抗体，会与标记垫中的羊抗人IgA抗体胶体金标记物(C线)结合，上行到NC膜上的呼吸道合胞病毒F蛋白抗原多肽片段检测线(T线)特异结合，形成红色条带(附图4)。如果标本中没有含有相应的呼吸道合胞病毒IgA抗体，羊抗人IgA抗体胶体金标记物会越过检测线(T线)，继续上行到对照线与人IgA抗体(C线)结合，在对照线上形成红色条带(附图5)。如果对照线(C线)没有形成红色条带，说明试纸条失效，结果不可靠(附图6)。

【实施例5】本发明呼吸道合胞病毒IgA胶体金诊断方法与荧光PCR方法结果对比

选取临床标本60例，分别采集患者的唾液标本和咽拭子标本，分别用呼吸道合胞病毒IgA抗体检测试纸条诊断方法与荧光PCR方法进行测试，结果如表1：

表1本发明的呼吸道合胞病毒IgA抗体检测试纸条诊断方法与荧光PCR方法比较结果

本发明呼吸道合胞病毒IgA胶体金诊断方法与荧光PCR方法比较，灵敏度达到95.00％，特异性95.00％，可以符合临床检测的条件。

本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变形。