采用多菌灵特异性抗体检测食用菌中多菌灵含量的方法与流程

技术领域

本发明属于农药小分子化合物免疫化学和残留分析领域；涉及半抗原的合成，人工抗原和多克隆抗体的制备及直接竞争ELISA法的建立。具体的说是一种多菌灵抗体及其在食用菌残留检测中的应用。

背景技术：

多菌灵属于苯并咪唑类杀真菌剂，由于其高效、低毒、内吸的特点而广泛地应用于农业生产中。虽然，其属于低毒类农药，但考虑到其较长（20多天）的残留期及生物富集作用对人体健康的危害，对其用量及残留的限定和监测是必要的。而且，一些国家也分别建立了标准的多菌灵检测方法，并且制定了相应的残留限量。例如，美国环境保护局(EPA) 已建立起橙汁残渣里多菌灵的含量标准，为80ug/kg；欧盟的标准是200ug/kg；而澳大利亚要求不超过10ug/kg。 欧盟规定多菌灵在新鲜菇类中的MRLS为0.1mg/kg；韩国、英国以及我国规定多菌灵在食用菌中的MRLS为1mg/kg；日本为3mg/kg。

目前，定量食品中多菌灵的方法主要为仪器法，例如，液相色谱（Singh，2004）、气相色谱（Farber，1993）、以及液质联用（Zamorn，2004）等。虽然随着仪器设备改进以及实验条件的优化，这些仪器方法准确度及检出限（由mg/kg到ug/kg）越来越好，但还存在很多问题，如前处理复杂，仪器成本高，自动化程度低，因此，需要熟练的技术型人才，且步骤多耗时，不适合运用于大量样本的监测。 而近年来，一些新型的免疫化学分析方法，由于其简单的前处理过程和快速、易学的检测步骤，逐步被建立和广泛应用。但关于食用菌中的多菌灵ELISA检测尚未见有文献报道。本发明就是利用多菌灵的特异性抗体建立的一种快速、灵敏、简单的免疫分析方法。

技术实现要素：

本发明的目的是通过在2-氨基苯并咪唑的氨基处连接丁二酸酐获得半抗原，利用活化酯法制备人工抗原，最终免疫获得多菌灵的多克隆抗体，并以此建立多菌灵的免疫分析方法。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

一种采用多菌灵特异性抗体检测食用菌中多菌灵含量的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）包被：将抗体用pH=9.6,0.01M碳酸缓冲液配制成5ug/mL的包被液，酶标板每孔加100uL包被液，4℃下孵育12h，甩干，用PBST洗3次；

（2）加样：空白孔加100uLPBS；控制（control）孔加50uLPBS和50uL使用浓度的酶标抗原（用PBS稀释150倍）；其它实验孔每孔加50uL标品或样品，再加50uL酶标抗原（PBS稀释150倍），在酶标板振荡器上孵育0.5h，甩干，用PBST洗5次；

（3）显色：显色使用14.6mL底物A和0.45mL底物B，二者在使用时混合，每孔加150uL，避光静置15min后，每孔加50uL1.25M硫酸终止反应，酶标仪读取OD值；其中底物A为:乙酸钠8.2g；β-糊精2.5g；过氧化氢脲0.4290g；柠檬酸3.16g，双蒸水定容至1000mL，4℃备用；底物B:四甲基联苯胺250mg ，DMSO 定容至25mL，室温避光保存。其中PBS为：磷酸氢二钠 13.76g；氯化钠 9g；磷酸二氢钠 1.38g，双蒸水定容至1000mL，4℃备用；PBST为：PBS+0.05%吐温-20。

本发明进一步公开了监测方法在用于食用菌中多菌灵含量检测方面的应用。其中所述的食用菌多菌灵含量检测是指：首先，利用该抗体通过直接竞争ELISA法建立多菌灵标准品的标准曲线，然后，利用该标准曲线定量经前处理后的样品待测液中的多菌灵，即建立多菌灵直接竞争ELISA检测方法。本发明所述的食用菌包括：香菇、平菇、杏鲍菇、双孢菇。

本发明更加详细的描述如下：

（1）多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

免疫动物为日本大白兔（月龄3个月，雄性，体重1.5 kg，天津生物医学工程研究所养殖场）经背部皮下多点注射免疫原，每只兔子首次的免疫剂量为2 mg，以后减半，隔两周免疫一次，从第三次免疫开始，每次免疫一周后，从耳背动脉采血，血液先室温下凝固15 min，然后3500 r/min离心10 min，取上清即抗血清，加0.1%的叠氮化钠，4℃储存，测定抗血清效价，从第五次免疫后，抗血清效价达到较高值1:90000，用Protein A－Sepharose 4B纯化抗血清，洗脱液经PBS透析72 h，加0.1%叠氮化钠，测定抗体浓度，4℃备用。

（2）所述的抗体应用于食用菌中多菌灵含量的免疫检测是指：首先，利用该抗体通过直接竞争ELISA法建立多菌灵标准品的标准曲线，然后，利用该标准曲线定量经前处理后的样品待测液中的多菌灵，即建立多菌灵的直接竞争ELISA检测方法。

（3）样品（食用菌）前处理方法，包括以下步骤：称取2 g经匀浆预冷的食用菌（香菇、平菇、杏鲍菇、双孢菇）样品于15mL离心管中，加入2mL乙腈，大力震荡2 min，离心（6000r/min，4℃）3min，取上清液1mL于棕色小瓶中﹣20℃备用，用1*PBS缓冲液稀释40倍即可进行ELISA检测。

（4）直接竞争ELISA法，包括以下步骤：

1）包被：将抗体用0.01M碳酸缓冲液（pH=9.6）配制成5ug/mL的包被液，酶标板每孔加100uL包被液，4℃下孵育12h，甩干，用PBST洗3次；

2）加样：空白孔加100uLPBS；control孔加50uLPBS和50uL最佳使用浓度的酶标抗原（用PBS稀释150倍）；其它实验孔每孔加50uL标品或样品，再加50uL酶标抗原（PBS稀释150倍）。在酶标板振荡器上孵育30min，甩干，用PBST洗5次；

3）显色：显色使用底物A和底物B，二者在使用时混合（14.6mL底物A+0.45mL底物B），每孔加150uL，避光静置15min后，每孔加50uL1.25M硫酸终止反应，酶标仪读取OD值。

本发明公开的多菌灵抗体及其在食用菌残留检测中的应用与现有技术相比所具有的积极效果在于：

（1）本发明经过一步简单的缩合反应合成多菌灵的结构类似物作为半抗原， 该半抗原突出了多菌灵的抗原决定簇，因此，经偶联载体蛋白获得的免疫原诱导产生高亲和性的抗体，并由其他结构类似物的交叉反应结果来看，抗体有很高的特异性。

（2）本发明基于多菌灵的高特异性抗体，可以建立其免疫分析方法，比如酶联免疫吸附试验，放射免疫法等。而本发明建立了多菌灵的直接竞争ELISA检测方法。该方法通过酶标抗原和标品竞争结合抗体反应，建立了多菌灵的标准曲线。

（3）本发明半抗原合成反应简单，合成原料易获取，副产物少，产率高。获得的抗体有很好的灵敏度、特异性和稳定性，可以很好的应用于免疫分析方法及试剂盒的建立与研发。利用其建立的直接竞争ELISA方法简便、快速、灵敏，且样品前处理步骤简单，整个检测时间在1.5h以内完成，准确高效，反应时间为30min。因此，灵敏快速是本方法的突出特点。因此，适用于大量样品的现场初步筛查。总之，该抗体及方法都有很好的应用前景。

附图说明：

图1为多菌灵标准曲线图；

图2为半抗原结构表征--质谱图；

图3为多菌灵类似物结构式；

图4为添加回收实验结果曲线。

具体实施方式：

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用到的原料、试剂均有市售。

实施例1

（1）多菌灵半抗原的合成

在250mL烧杯中将0.5g2-氨基苯并咪唑搅拌溶解于100mL乙腈中，再加入0.564g丁二酸酐，40℃搅拌反应4h后， 有大量白色的沉淀物析出，过滤反应溶液得到滤渣，将滤渣用40℃的乙腈冲洗两次，除去残留在滤渣中未反应的原料，得到粗产物。粗产物进一步经柱层析（流动相为乙酸乙酯：正己烷=1:3，v/v）纯化，经薄层色谱及质谱鉴定得出，获得产物为2-琥珀酰苯并咪唑（白色粉末），其结构分析见图2。

（2）多菌灵免疫原的制备

在4mL的棕色小瓶中将18.6 mg半抗原搅拌溶解于0.9 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，再逐滴加入用100uLDMF溶解的13.8 mgNHS和24.7 mgDCC的混合溶液，室温搅拌反应过夜，4℃静置2h，离心除去白色沉淀，吸取上清液（活化酯液）4℃保存备用。在10mL的棕色小瓶中，称取45 mgKLH溶于9 mL 0.066mol磷酸氢二钾（pH=9.0）溶液中，在0℃下，缓慢加入80uL活化酯液，4℃下搅拌反应过夜，用pH=7.4的PBS透析3天，每天换3次透析液，测定体积，加入0.1%叠氮钠，-20℃备用。

（3）多菌灵酶标抗原的制备

在4mL的棕色小瓶中将18.6 mg半抗原搅拌溶解于0.9 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，再逐滴加入用100uLDMF溶解的13.8 mgNHS和24.7 mgDCC的混合溶液，室温搅拌反应过夜，4℃静置2h，离心除去白色沉淀，吸取上清液（活化酯液）4℃保存备用。在10mL的棕色小瓶中，称取10 mgHRP 溶于2 mL 0.066mol磷酸氢二钾（pH=9.0）溶液中，在0℃下，缓慢加入45 uL 活化酯液，4℃下搅拌反应过夜，用pH=7.4的PBS透析3天，每天换3次透析液，测定体积，加入等体积的丙三醇，-20℃备用。

（4）多菌灵抗体的制备

免疫动物为日本大白兔（月龄3个月，雄性，体重1.5 kg，天津生物医学工程研究所养殖场）经背部皮下多点注射免疫原，每只兔子首次的免疫剂量为2 mg，以后减半，隔两周免疫一次，从第三次免疫开始，每次免疫一周后，从耳背动脉采血，血液先室温下凝固15 min，然后3500 r/min离心10 min，取上清即抗血清，加0.1%的叠氮化钠，4℃储存，测定抗血清效价，直至其效价较高时，取全血。用Protein A－Sepharose 4B纯化抗血清，洗脱液经PBS透析72 h，加0.1%叠氮化钠，测定抗体浓度，4℃备用。

实施例2

1、利用直接竞争ELISA法建立多菌灵的标准曲线：

利用方阵滴定法优化得出，抗体最佳包被量为5ug/mL，酶标抗原最佳稀释倍数为150倍，较适宜的离子浓度和PH值是pH=7.4的0.01MPBS。采用优化的实验条件，以标品浓度（ug/kg）为横坐标，抑制率（%）为纵坐标，建立标准曲线，结果见图1，具体步骤如下：

（1）包被：将抗体用0.01M碳酸缓冲液（pH=9.6）配制成5ug/mL的包被液，酶标板每孔加100uL包被液，4℃下孵育12h，甩干，用PBST洗3次；

（2）加样：空白孔加100uLPBS；control孔加50uLPBS和50uL稀释150倍的酶标抗原；其它实验孔每孔分别加50uL不同浓度的标品，再加50uL稀释150倍的酶标抗原。在酶标板振荡器上孵育30min，甩干，用PBST洗5次；

（3）显色：显色使用底物A和底物B，二者在使用时混合（14.6mL底物A+0.45mL底物B），每孔加150uL，避光静置15min后，每孔加50uL1.25M硫酸终止反应，酶标仪读取OD值。

其中，多菌灵标准溶液：用PBS液将购买的浓度为0.5g/kg 的多菌灵标准溶液（溶于甲醇）稀释成浓度为0.042、0.128、0.64、1.6、3.2、6.4ug/kg的溶液。

PBS（0.01M，pH=7.4）:Na₂HPO₄·12H₂O 13.76g；Nacl 9g；NaH₂PO₄·2H₂O 1.38g，双蒸水定容至1000mL。

底物A:乙酸钠8.2g；β-糊精2.5g；过氧化氢脲0.4290g；柠檬酸3.16g，双蒸水定容至1000mL，4℃备用。

底物B:四甲基联苯胺250mg ，DMSO 定容至25mL，室温避光保存；

抑制率：

式中：ODcontrol—标品浓度为零时的OD值；

ODx—标品浓度为x时的OD值；

OD空白—空白孔的OD值。

2、抗体特异性

选择与多菌灵同属于苯并咪唑类的苯菌类、硫菌灵、甲基硫菌灵、噻菌灵以及它们的代谢物2-氨基苯并咪唑，测定这些结构类似物的IC₅₀值及交叉反应率（CR）。

该抗体除了与苯菌灵有一定的交叉反应之外（那是因为苯菌灵的有效成分就是目标物多菌灵），与其他结构类似物几乎没有交叉反应，这很好的说明抗体对目标物多菌灵有很高的特异性；

式中:IC50—标品的抑制率为50%时所对应的标品浓度

3、样品检测：

（1）样品前处理

称取2 g经匀浆预冷的食用菌（香菇、平菇、杏鲍菇）样品于15mL离心管中，加入2mL乙腈，大力震荡2 min，离心（6000r/min，4℃）3min，取上清液1mL于棕色小瓶中﹣20℃备用，用1*PBS缓冲液稀释40倍即可进行ELISA检测。

（2）直接竞争ELISA法检测样品

a，包被：将抗体用0.01M碳酸缓冲液（pH=9.6）配制成5ug/mL的包被液，酶标板每孔加100uL包被液，4℃下孵育12h，甩干，用PBST洗3次；

b，加样：空白孔加100uLPBS；control孔加50uLPBS和50uL稀释150倍的酶标抗原；其它实验孔每孔分别加50uL稀释40倍的样品提取液，再加50uL稀释150倍的酶标抗原。每个样品做2个平行，在酶标板振荡器上孵育30min，甩干，用PBST洗5次；

c，显色：显色使用底物A和底物B，二者在使用时混合（14.6mL底物A+0.45mL底物B），每孔加150uL，避光静置15min后，每孔加50uL1.25M硫酸终止反应，酶标仪读取OD值。

计算每个样品的抑制率，并根据多菌灵标准曲线得出每个样品的多菌灵含量：

4、添加回收实验结果

选用了2种不同样品，每种样品分别添加3个不同浓度（0.5ppm、1ppm、2ppm）的多菌灵，然后经一定的提取方法（Bin Guo等人，2010）处理得到样品提取液，得到的样品提取液分别用HPLC法和直接竞争ELISA法检测，其中，直接竞争ELISA法中样品提取液需先用PBS液稀释1000倍再进行检测，同一基质的两种方法检测结果进行线性回归。

结果表明，两种方法检测结果的一致性很高（线性相关系数R²值为0.9822）。充分说明了建立的食用菌中多菌灵直接竞争ELISA检测方法结果的准确性，近一步说明该方法可进行食品中多菌灵的定量监测，有很大实用价值。