一种定量判断材料抗菌率的方法及其应用与流程

本发明涉及一种定量判断材料抗菌率的方法及其应用。

背景技术：

TTC法是定性判定细菌活性的常用方法，可间接测量药品的抑菌性能。TTC显色的效果代表被测物质抗菌力的强弱。显色越明显抑菌性能越差。此方法是将显色完成的菌液用有机溶剂提出色素，测量吸光度，用吸光度定量表示抗菌能力的强弱。然后绘制吸光度曲线。通过吸光度曲线预测药品的抑菌趋势。

TTC法可以间接定性的评估抗菌剂对细菌的抑菌活性，应用较为广泛，但是这种方法无法实施定量实验。例如，显色后的菌液浑浊，影响吸光度无法测量，且将浊液离心后，色素也被分离无法准确测量，其他操作更会影响实验准确性。该方法无法提供定量结果。

为了克服上述弊端，实施一种适用性广的抗菌剂定量测试抑菌性的方法，并加以应用，这也是本发明的创新之处。

技术实现要素：

本发明是要解决TTC法在定量试验中不可操作性，而提供的一种定量判断材料抗菌率的方法及其应用。

本发明一种定量判断材料抗菌率的方法具体步骤为：

①0.1mol/L的葡萄糖溶液、pH=8.4的Tris-HCL缓冲液、1 mg/L的TTC溶液、丙酮石油醚混合溶液（2:3）、几个不同浓度的药品溶液；

②将2mL菌液和各浓度药品溶液1mL分装于比色管内，放置于恒温水浴振荡器，37℃，振荡频率视情况而定。20min-30min后分别按顺序加入pH=8.4的Tris-HCL缓冲液2mL、1mol/L的葡萄糖溶液2mL、1mg/L的TTC溶液2mL，继续恒温20min-30min；

③向显色好的菌液中分别加入10mL丙酮石油醚混合溶液，充分震荡，使色素全部提取出来；

④测量各色素层的吸光度并以浓度和吸光度绘制曲线，对材料抑菌性进行定量判定。

本发明的优点：便于操作，定性容易，得到的对比图易分析，数据可靠。适用对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌等常见菌种的抑菌测试。

附图说明

以下结合附图和具体实施方式对本发明加以详细说明。

图1为抗菌剂的IR图

图2为抗菌剂的UV图

图3为抗菌剂的TG图

图4为抗菌剂的XRD图

图5为未加萃取剂显色完全的蜡样芽胞杆菌菌液

图6为加入萃取剂萃取完成的蜡样芽胞杆菌菌液

图7药品浓度对吸光度的曲线

具体实施方式

实施例1：自制抗菌剂杂多酸盐β₂-SiW₁₁Ti，取Na₂SiO₃2.881g 于50mL烧杯中，加入25mL蒸馏水，超生溶解，称取Na₂WO₄54.575g于250mL烧杯中，加入50mL蒸馏水超声溶解，在Na₂WO₄溶液磁力搅拌条件下，向溶液中逐滴滴加4mol/L的HCl溶液，调节溶液pH=5~6，剧烈搅拌是局部产生的钨酸钠沉淀全部溶解，之后迅速倒入Na₂SiO₃水溶液，再用4mol/L的HCl溶液，调节溶液pH=5~6，保持100min，抽滤，滤除不溶物，向滤液中加入23.217g KCl(s)，磁力搅拌25min，产生白色沉淀，抽滤，所得产品用1mol/L 的KCl溶液淋洗数次，得到白色粉末，置于空气中干燥，称重，装瓶并贴好标签，记β₂- SiW₁₁。取8.028gβ₂-SiW₁₁于250mL烧杯中，加入80mL蒸馏水，超生溶解，在100℃恒温磁力搅拌30min，逐滴加入1.6mL的TiCl₄溶液（2mol/L），投入6.291gKCl(s) 固体，抽滤，所得产品用1mol/L 的KCl溶液淋洗数次，得到淡绿色粉末，置于空气中干燥，称重，装瓶平贴好标签，记β₂-SiW₁₁Ti。

实施例2：附图1是抗菌剂的IR图，从图中可以看出，在700～1100 cm^-1指纹区范围内出现了Keggin结构的杂多酸盐的四个特征吸收峰。其中，786.99cm^-1处的吸收峰是W-O_c-W键的反对称伸缩振动，917.62cm^-1处的吸收峰是W-O_b-W键的反对称伸缩振动，969.90cm^-1处的特征峰属于W=O_d键的反对称伸缩振动，1009.58cm^-1处的特征峰属于Si-O_a键的反对称的代伸缩振动655.76cm^-1的峰位说明钛原子成功取代。这表明β₂-SiW₁₁Ti符合Keggin结构的基本特征。除此之外， 1620^-1附近处的吸收峰是水分子的H-O-H键的弯曲振动，3415.09cm^-1处的吸收峰是水分子中O-H键的对称伸缩振动，从中可以看出，所合成的杂多酸盐含有结晶水。

实施例3：附图2是抗菌剂的UV图，在210nm和230nm处出现了两个吸收谱带，分别对应于O_d→W间的荷移跃迁和O_b/O_c→W间的荷移跃迁。其中，210nm处是高能量吸收峰，230nm处是低能量吸收峰，也就是210nm处的电子跃迁能更大。β₂-SiW₁₁Ti具有Keggin结构。

实施例4：附图3是抗菌剂的TG图，TG曲线是研究杂多酸化合物热稳定性的有力工具。从曲线上可以看出，β₂-SiW₁₁Ti有三个失重过程，从20ºC开始失重，至526ºC左右基本恒重，这说明β₂-SiW₁₁Ti的热稳定性较好。第一步失重范围是20ºC～110ºC，这部分失去的是吸附水，第二步失重范围是110ºC～450ºC，失去的是结晶水，第三步在450ºC～526ºC失重，失去的也是结晶水，但后两步失去的结晶水是有差别的，结晶水是以氢键的形式与杂多酸盐结合的，结晶水一般有两种存在形态，一种可能是结晶水与极氧形成氢键，另一种可能是结晶水与赤道氧形成氢键。526ºC～700ºC的范围内，曲线上是一条直线，杂多酸盐不再失重，在整个过程中，杂多酸盐没有分解，有较好的热稳定性。

实施例5：附图4是抗菌剂的XRD，Keggin结构的多酸特征2θ度数为8.28°、8.9°、9.1°、27.9°、28.9°。由图可以看出在9.12°、11.06°、26.88°、27.8°有峰，说明产物为Keggin结构，而几个衍射峰发生偏移，且有几个衍射峰没有出现说明由于钛原子的取代使得晶型发生畸变。

实施例6称取1.938 g葡萄糖再加入100 mL去离子水，配置成0.1 mol/L的葡萄糖溶液；称取3.019g三（羟甲基）氨基甲烷加水溶解，再加入10 mL1mol/L的HCl溶液定容至500 mL，配置成pH=8.4的Tris-HCl缓冲液备用，称取0.050 g TTC放于棕色瓶中，加入50 mL的去离子水配置成1mg/L的TTC溶液备用。取β₂-SiW₁₁Ti五个浓度的溶液（0.00125g/mL、0.0025 g/mL、0.00375 g/mL、0.005 g/mL、0.0075 g/mL）各1mL加入到比色管中，再向每个管中加入2mL蜡样芽胞杆菌菌液，放置在37℃环境中20min-30min。取出后依次向试管中加入2 mL Tris-HCl缓冲溶液，2 mL葡萄糖溶液，2 mL TTC溶液。在37 ℃的环境下放置20 min。加入丙酮石油醚溶液（丙酮:石油醚=2:3）。充分摇匀，提取出色素。测量色素层的吸光度。色素层测量最大吸收波长（420nm-600nm）。得到最大吸收波长后，在最大吸收波长下对五个浓度下的色素层进行吸光度测量。

实施例7：图5是未加为未加萃取剂显色完全的蜡样芽胞杆菌菌液，从图中看到，经过培养后，菌液已经不同程度的显色；图6是为加入萃取剂萃取完成的蜡样芽胞杆菌菌液，从图中看到，经过萃取剂萃取后，菌液几乎褪色，色素层不同程度程度的显色。

实施例8：图7是药品浓度对吸光度的曲线，由曲线可看出最佳抑菌浓度为0.0025g/mL。0.005g/mL后随着浓度升高吸光度又逐渐降低，这说明随着浓度升高抑菌性能也逐渐提升。可能为浓度过大改变细菌内外渗透压，使细菌脱水而死亡。抑菌趋势可明显直观的显示在图上，更利于分析。