本发明涉及中药领域，尤其涉及一种柴辛感冒注射液的检测方法。
背景技术：
：柴辛感冒注射液收载于国家中成药标准汇编内科肺系(一)分册，它是由柴胡和细辛两味药材制成的，具有解表退热的功效，用于感冒引起的鼻塞流涕，喷嚏、咳嗽、头痛，恶寒发热，全身不适等症。柴辛感冒注射液现行标准(WS-11114(ZD-1114)-2002)中鉴别(1)为对细辛药材的鉴别，规定：柴辛感冒注射液供试品色谱中，与细辛对照药材色谱相应的位置上，应显相同颜色的主斑点。申请人在对多批次产品的检验过程中发现，供试品色谱与对照药材色谱相比较，经常出现少一个斑点或者斑点很不明显的情况，对产品质量的判断造成困扰。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种柴辛感冒注射液的检测方法，该方法有助于提高柴辛感冒注射液的安全可控性。本发明中所述的柴辛感冒注射液是由柴胡和细辛两味药材经提取加工制成的灭菌水溶液。本发明提供的柴辛感冒注射液的检测方法，包括对黄樟醚的薄层色谱检查和/或含量限度检测，薄层色谱检查：按所含细辛药材量计，当供试品点样量不高于100倍细辛对照药材点样量时，供试品色谱中如显黄樟醚斑点，与细辛对照药材色谱中所显的黄樟醚斑点比较，不得更深；含量限度检测：每1ml注射液含黄樟醚不得超过8μg，优选不超过3μg。黄樟醚薄层色谱检查方法优选：取柴辛感冒注射液20ml，用乙醚振摇提取2次，每次15ml，分取乙醚液，挥至近干，残渣立即加石油醚0.5ml使溶解，作为供试品溶液；另取细辛对照药材1g，置圆底烧瓶中，连接挥发油测定器，自测定器上端加水，至溢流入烧瓶中为止，再加入石油醚1ml，连接回流冷凝器，加热至沸，并保持微沸2小时，放冷，取石油醚液作为对照药材溶液；照《中国药典》2015年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10μl、对照药材溶液1μl～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为15∶1的正己烷—醋酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，热风吹至斑点显色清晰；供试品色谱中如显黄樟醚斑点，与细辛对照药材色谱中所显的黄樟醚斑点比较，不得更深。黄樟醚含量限度检测可以采用高效液相色谱法、气相色谱法等检测方法。当采用高效液相色谱法测定黄樟醚含量时，可以采用梯度洗脱也可以采用等度洗脱，采用梯度洗脱的色谱条件优选：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，梯度洗脱，洗脱过程流动相A和B的比例变化为：0～20min，A相40％，B相60％；20～30min，A相40％-45％，B相60％-55％；30～35min，A相45％-47％，B相55％-53％；柱温：25-35℃；检测波长为230nm～240nm；采用等度洗脱的色谱条件优选：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为40:60～44:56的乙腈-水为流动相；柱温：25-35℃；检测波长为230nm～240nm。当采用气相色谱法测定黄樟醚含量时，优选色谱条件为：非极性或中等极性毛细管柱，程序升温：初始温度100℃，保持12分钟，以每分钟5℃的速率升温至130℃，再以每分钟25℃的速率升温至290℃，保持3分钟，进样口温度150℃～300℃，检测器温度200℃～300℃。本发明的创新之处在于：本发明针对原标准中鉴别(1)存在的供试品色谱中经常比对照药材色谱少一个斑点或是斑点不明显的问题，通过制备薄层色谱和硅胶柱色谱方法进行分离纯化，并采用气质联用分析，确定该斑点对应的化学成分为黄樟醚，并建立了黄樟醚的薄层检查方法和含量限度检测方法，对柴辛感冒注射液中黄樟醚的含量进行了控制，提高了产品的安全可控性。下面将通过实验例对本发明作进一步说明。实验例1化学成分归属研究1、利用薄层色谱收集目标成分将细辛挥发油点于制备硅胶G薄层板上，以正己烷—醋酸乙酯(15∶1)为展开剂，上行法展开，晾干，刮板，洗脱，得目标成分粗产物。2、对目标成分粗产物进行纯化目标成分粗产物，经硅胶柱色谱，正己烷—醋酸乙酯(30∶1)洗脱，薄层色谱检查，合并相同流分，得目标成分。3、目标成分化学成分归属目标成分经GC-MS分析，目标成分的分子量与文献报道的黄樟醚一致，再经薄层色谱、气相色谱和液相色谱检测验证，目标成分确定为黄樟醚。实验例2液相色谱法测定黄樟醚含量一、样品与试剂黄樟醚对照品；柴辛感冒注射液(批号：20150826-1、20150826-2、20150826-3，江西天施康中药股份有限公司提供)；甲醇(分析纯)二、对照品溶液及样品的配制1.对照品溶液配制：精密称取黄樟醚对照品11.15mg置于10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得1.115mg/ml储备液Ⅰ；精密量取储备液Ⅰ1ml于50ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得22.3μg/ml储备液Ⅱ；精密量取储备液Ⅱ1ml于10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得2.23μg/ml对照品溶液。2.样品的配制：取样品过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得。三、色谱条件仪器：岛津HPLC(LC-20A)色谱柱：依利特HypersilODSC18柱(4.6mm×250mm，5μm)柱温：30℃流速：1ml/min检测波长：235nm进样量：20μl流动相：乙腈(A)-水(B)时间/minA％B％04060204060304555354753四、方法学考察1.系统适用性按上述色谱条件测定，阴性对照无干扰。2.色谱条件的考察2.1流动相的考察仪器：岛津HPLC(LC-20A)色谱柱：依利特HypersilODSC18柱(4.6mm×250mm，5μm)柱温：30℃流速：1ml/min检测波长：235nm进样量：20μl流动相如下：选用流动相6时，分离度最好，所以选择流动相6作为测定黄樟醚含量的流动相。2.2检测波长的选择由于黄樟醚在287nm和235nm处有最大吸收，样品在287nm处黄樟醚的峰有干扰，而在235nm处没有干扰，所以选择检测波长为235nm。3.线性范围分别取对照品储备液Ⅱ2ml,1ml,1ml,2ml,5ml,1ml至5ml，5ml,10ml,25ml,100ml,25ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，定容，摇匀，即将对照品储备液Ⅱ分别稀释2.5,5,10.12.5,20,25倍，按照色谱条件进行检测，记录色谱图。以峰面积(A)为纵坐标(Y)，黄樟醚浓度(X,μg/mL)为横坐标绘制标准曲线，得回归方程Y＝28175X-4643，r＝0.99985。黄樟醚在0.89μg/ml～8.92μg/ml浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。4.精密度试验取同一对照品溶液，按照色谱条件连续进样6针，测定黄樟醚的保留时间和峰面积，结果见表1.表1精密度试验测定结果小结：精密度试验结果RSD<2％(RSD＝1.30％，n＝6)，表明仪器精密度较好。5..供试品溶液稳定性试验按色谱条件测定供试品溶液一份，分别于0、2、4、8、12、24小时后进样，结果见表2.表2溶液稳定性试验结果小结：供试品溶液在24小时内稳定性不是很好，但是在12小时内稳定性较好，RSD＝1.76％，n＝5。6.加样回收率试验分别精密量取0.6、0.8、0.9ml浓度为2.23μg/ml对照品溶液置2ml量瓶中(共6份，每个浓度2份)，再精密加入柴辛感冒注射液1ml，加甲醇定容至刻度，摇匀，按照上述色谱条件进行检测，结果见表3.表3加样回收率试验结果小结：加样回收率试验结果，平均加样回收率为110.70％，RSD＝3.42％。7.耐用性考察本实验考察了三根不同品牌色谱柱及三种不同品牌液相色谱仪的耐用性，结果见表4.表4色谱柱与仪器耐用性考察结果同一仪器，三根不同色谱柱测出的结果RSD值为3.7％，三台仪器同一色谱柱测出的结果的RSD值为4.5％。五、样品测定取3个不同批次注射液各2份按上述方法进行测定，结果见表5.表5含量测定结果实验例3气相色谱法测定黄樟醚含量一、样品与试剂黄樟醚对照品；柴辛感冒注射液(江西天施康中药股份有限公司提供)；正己烷(分析纯)；正十四烷(分析纯)；石油醚(分析纯)；乙醚(分析纯)二、样品及对照品溶液的配制1.样品溶液的制备：精密量取10ml柴辛感冒注射液，用石油醚(30-60°)萃取3次，每次10ml，取上层液，在20℃水浴挥干，正己烷溶解并加入1ml的内标溶液定容至5ml得样品溶液。2.内标溶液的制备：精密称取正十四烷0.05876g，用正己烷定容至10ml，再精密量取1ml用正己烷定容至100ml，得内标溶液。3.对照品溶液的制备：黄樟醚对照品取样量0.01038g，用正己烷溶解并定容至10ml，再精密量取1ml用正己烷定容至10ml得黄樟醚对照品溶液；将黄樟醚对照品溶液与内标溶液两者分别取1ml于5ml容量瓶，混匀，用正己烷定容至刻度，得对照品溶液。三、色谱条件仪器：Agilent6890N气相色谱仪色谱柱：HP-1毛细管柱0.25um320um*30m进样口温度：270℃检测器温度：300℃载气流速：1.0ml/min分流比：对照品、样品(2：1)进样量：1ul程序升温：初始温度100℃，保持12分钟，以每分钟5℃的速率升温至130℃，再以每分钟25℃的速率升温至290℃，保持3分钟。四、方法学考察4.1色谱柱的考察本实验考察了HP-1和DB-WAX两种毛细管柱实验结果表明HP-1和DB-WAX都能用于测定黄樟醚含量。4.2系统适用性试验按上述色谱条件测定，阴性对照无干扰。4.3考察萃取溶剂精密量取10ml柴辛感冒注射液，分别用石油醚(30-60°)、正己烷、乙醚萃取3次，每次10ml，取上层液，在20℃水浴挥干，正己烷复溶并加入1ml的内标溶液定容至5ml得石油醚(30-60°)萃取样品溶液、正己烷萃取样品溶液、乙醚萃取样品溶液；按上述色谱条件测定，结果见表6.表6萃取溶剂考察结果小结：通过比较石油醚(30-60°)、正己烷、乙醚三者萃取效果，选择毒性小、沸点低的石油醚(30-60)作为萃取溶剂。4.4考察萃取次数精密量取10ml柴辛感冒注射液，分别用石油醚(30-60°)萃取2次、3次、4次，每次10ml；取上层液，在20℃水浴挥近干，正己烷复溶并加入1ml的内标溶液定容至5ml得石油醚(30-60°)萃取2次样品溶液、萃取3次样品溶液、萃取4次样品溶液，按上述色谱条件测定，结果见表7。表7萃取次数考察结果小结：通过比较2次萃取、3次萃取、4次萃取三者，选择萃取3次制备样品溶液。4.5考察挥干温度精密量取10ml柴辛感冒注射液，用石油醚(30-60°)萃取3次，每次10ml，取上层液，分别在20℃、30℃、40℃水浴挥干，正己烷复溶并加入1ml的内标溶液定容至5ml得20℃挥干样品溶液、30℃挥干样品溶液、40℃挥干样品溶液，按上述色谱条件测定，结果见表8.表8挥干温度考察结果小结：通过比较20℃、30℃、40℃三者挥干温度，选择20℃挥干制备样品溶液4.6线性范围对照品溶液的制备：精密称取黄樟醚对照品0.01038g，正己烷定容于10ml，再精密量取1ml用正己烷定容至10ml作为贮备液Ⅰ(浓度为103.8μg/ml)；精密量取对照品贮备液Ⅰ1ml置10ml量瓶中，加正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液Ⅱ(浓度为10.38μg/ml)；内标溶液的制备：精密称取正十四烷0.05876g，用正己烷定容至10ml，再精密量取1ml用正己烷定容至100ml，得内标溶液；精密量取对照品储备液Ⅱ1ml置5ml量瓶中，加1ml内标溶液，正己烷稀释至刻度，摇匀，作为溶液1(浓度为2.076μg/ml)；精密量取对照品储备液Ⅱ2ml置5ml量瓶中，加1ml内标溶液，正己烷稀释至刻度，摇匀，作为溶液2(浓度为4.152μg/ml)精密量取1ml内标溶液置5ml量瓶中，加对照品储备液Ⅱ至刻度，摇匀，作为溶液3(浓度为8.304μg/ml)；精密量取对照品储备液Ⅰ1ml置5ml量瓶中，加1ml内标溶液，正己烷稀释至刻度，摇匀，作为溶液4(浓度为20.76μg/ml)精密量取对照品储备液Ⅰ2ml置5ml量瓶中，加1ml内标溶液，正己烷稀释至刻度，摇匀，作为溶液5(浓度为41.52μg/ml)精密量取1ml内标溶液置5ml量瓶中，加对照品储备液Ⅰ至刻度，摇匀，作为溶液6(浓度为83.04μg/ml)；按照色谱条件进行检测，记录色谱图，以黄樟醚峰面积与内标峰面积比值为纵坐标(Y)，黄樟醚浓度(X,μg/mL)为横坐标绘制标准曲线，得回归方程Y＝0.05571X-0.08767(R2＝0.99981)。黄樟醚在2.076μg/ml～83.040μg/ml浓度范围内与峰面积比值呈良好的线性关系。4.7精密度试验4.7.1.内标溶液的制备：精密称取正十四烷0.05876g，用正己烷定容至10ml，再精密量取1ml用正己烷定容至100ml，得内标溶液；4.7.2.对照品溶液的制备：黄樟醚对照品取样量0.01038g，用正己烷并溶解定容至10ml，再精密量取1ml用正己烷定容至10ml得黄樟醚对照品溶液；将黄樟醚对照品溶液与内标溶液两者分别取1ml于5ml容量瓶，混匀，用正己烷定容至刻度，得对照品溶液。取对照品溶液，按照色谱条件连续进样6针，测定内标物、黄樟醚的保留时间和黄樟醚峰面积/内标峰面积的值，结果见表9表9精密度试验测定结果小结：精密度试验结果RSD<2％(RSD＝0.678％，n＝6)，表明仪器精密度较好。4.8重复性试验精密量取10ml柴辛感冒注射液，用石油醚(30-60°)萃取3次，每次10ml，取上层液，在20℃水浴挥近干，正己烷复溶并加入1ml的内标溶液定容至5ml得样品溶液1，重复上述操作，共制备六份样品溶液，按照色谱条件测定，结果见表10.表10重复性试验结果小结：重复性试验结果RSD<3％(内标法RSD＝2.58％，外标法RSD＝2.84％，n＝6)，表明内标法测定黄樟醚方法重复性良好。4.9样品溶液稳定性试验精密量取10ml柴辛感冒注射液，用石油醚(30-60°)萃取3次，每次10ml，取上层液，在20℃水浴挥近干，正己烷复溶并加入1ml的内标溶液定容至5ml得样品溶液，按照色谱条件测定，结果见表11.表11稳定性试验结果小结：稳定性试验结果RSD<2％(内标法RSD＝0.273％，外标法RSD＝1.91％，n＝6)，说明供试品溶液在24小时内稳定性良好。5.0加样回收率试验精密量取10ml柴辛感冒注射液，加入1ml黄樟醚对照品溶液(相当于加入黄樟醚的量约为样品的100％)，用石油醚(30-60°)萃取3次，每次10ml，取上层液，在20℃水浴挥近干，正己烷复溶并加入1ml的内标溶液定容至5ml得样品溶液，重复上述操作制备六份样品溶液，按照色谱条件测定，结果见表12、13.表12加样回收率试验结果(内标法计算总量)表13加样回收率试验结果(外标法计算总量)小结：加样回收率试验结果，按内标法计算黄樟醚总量，平均加样回收率为98.84％，RSD＝2.82％(<3％)，说明内标法含量测定方法对黄樟醚回收率较好。五、样品测定分别精密量取五个批次20160104、20151010、20150826-1、20150826-2、20150826-3柴辛感冒注射液10ml，用石油醚(30-60°)萃取3次，每次10ml，取上层液，在20℃水浴挥近干，正己烷复溶并加入1ml的内标溶液定容至5ml得样品溶液，每个批次制备两份样品溶液，按照色谱条件测定，结果见表14。表14柴辛感冒注射液黄樟醚含量测定结果上表中，批号为20160104柴辛感冒注射液中黄樟醚含量明显高于其它批次产品，经研究分析发现，主要是由于用于制备该批次样品的细辛药材中黄樟醚的含量高造成的。具体实施方式下述实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1柴胡2500g细辛250g上述原料按如下方法制成1000ml：方法1：以上二味药材，加水进行蒸馏，收集蒸馏液约5500ml，馏液重蒸馏，收集重蒸馏液约950ml，加30ml丙二醇，振摇使油完全溶解，再加8g氯化钠，用10％氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，加注射用水至规定量，继加0.5％的活性炭，充分搅拌，滤过，灌封，灭菌，即得样品Ⅰ。方法2：以上二味药材，加水进行蒸馏，先循环30min，再收集蒸馏液约5500ml，馏液重蒸馏，收集重蒸馏液约950ml，加30ml丙二醇，振摇使油完全溶解，再加8g氯化钠，用10％氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，加注射用水至规定量，继加0.5％的活性炭，充分搅拌，滤过，灌封，灭菌，即得样品Ⅱ。方法3：以上二味药材，加水进行蒸馏，先循环60min，再收集蒸馏液约5500ml，馏液重蒸馏，收集重蒸馏液约950ml，加30ml丙二醇，振摇使油完全溶解，再加8g氯化钠，用10％氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，加注射用水至规定量，继加0.5％的活性炭，充分搅拌，滤过，灌封，灭菌，即得样品Ⅲ。【鉴别】取样Ⅰ20ml，用乙醚振摇提取2次，每次15ml，分取乙醚液，挥至近干，残渣立即加石油醚0.5ml使溶解，作为供试品溶液；另取细辛对照药材1g，置圆底烧瓶中，连接挥发油测定器，自测定器上端加水，至溢流入烧瓶中为止，再加入石油醚1ml，连接回流冷凝器，加热至沸，并保持微沸2小时，放冷，取石油醚液作为对照药材溶液；照《中国药典》2015年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10μl、对照药材溶液1μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为15∶1的正己烷—醋酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，热风吹至斑点显色清晰；结果：供试品色谱中黄樟醚斑点颜色比细辛对照药材色谱中黄樟醚斑点颜色浅。【限量检测】照高效液相色谱法(中国药典2015年版一部附录ⅥD)测定。色谱条件与系统实用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(42:58)为流动相；检测波长为235nm；柱温：30℃；理论塔板数按黄樟醚峰计算应不低于2000。对照品溶液的制备取黄樟醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含黄樟醚2μg的对照品溶液，即得。供试品溶液的制备取样品Ⅰ-Ⅲ，分别用微孔滤膜(0.22μm)滤过，取续滤液，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪，测定，即得。结果样品Ⅰ每1ml注射液含黄樟醚6.93μg；样品Ⅱ每1ml注射液含黄樟醚2.76μg；样品Ⅲ每1ml注射液含黄樟醚1.07μg。当前第1页1 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