一种H‑HCG快速免疫诊断层析试纸及其制备方法与流程

本发明涉及医学检测技术领域，具体地说是一种H-HCG快速免疫诊断层析试纸及其制备方法。

背景技术：

人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin简称HCG)，是由胎盘滋养层细胞分泌的、分子量为36700的糖蛋白激素，它是由α和β二亚基组成。HCG是临床妊娠及妊娠相关疾病检查中最常用的标记物，其生物免疫学特征主要由β亚基决定，为避免抗HCG抗体与其他多肽激素如FSH、LH和TSH等发生交叉反应，尽管完整的HCG在妊娠期间被发现是最常见的形式，但是HCG在血、尿中以不同的形式存在，HCG的其它亚型或片段也呈现在孕妇的血液、尿液和唾液中，这些亚型或片段包括高糖基化人绒毛膜促性腺激素(H-HCG)、游离的HCG-α单位、游离的HCG-β单位、HCG-β核心片段和缺口HCG，它们分别具有不同的生物功能。但是，目前广泛使用的检测人HCG的检测工具为HCG胶体金免疫层析检测试纸，以及使用抗HCG的α和β链或β—HCG单克隆抗体检测孕妇血清总HCG浓度的方法，所测得的HCG值均小于各种HCG组分的实际总和，并且不能完全和所有类型或亚型或片段的HCG结合，也不能提供各种亚型的信息，特别是它们的生物学功能和相关的临床意义。

早期妊娠可分为正常妊娠和不正常妊娠，不正常妊娠包括异位妊娠和自然流产，发病率在我国分别为1％和10-15％左右，而且呈逐年上升趋势，是孕产妇的主要死亡原因之一，已经成为育龄女性重要的健康问题。为了确定异位妊娠和自然流产，尽管我们对孕妇进行孕酮和HCG水平的定量检测，但是至今还没有一种筛选方法能够快速、准确地即时诊断。也没有单独的快速、准确地即时诊断方法来区分早期正常妊和不正常妊娠。当前临床上通用的方法是，一是超声检查，二是HCG倍增试验来确定异位妊娠的存在。通过经阴道超声，看是否存在胚胎囊来判断胚胎存在，通过腹部超声则是看有无异位的妊娠存在。但是采用超声在早期检查胚胎、胚胎囊的方法适合于5-8周妊娠(约停经后1-4周)，当有异位妊娠症状的孕妇就诊时往往已经错过了超声检查的时机，另依赖HCG倍增试验来分析，如二天内孕妇血中HCG水平没有倍增，则表明异位妊娠。相反自然流产者就不能采用上述二种分析方法了。测量每二天HCG的倍增率已成为标准的妇产科检查方法，在二天内下降的HCG的水平和不倍增常常表明妊娠失败。然而该方法有其不足之处，其一孕妇需要就诊二次，其二需要抽血二次检测HCG水平二次以上，其三检测结果受限制，大量不同的文献报道检测的敏感性为62-78％，假阳性率高达26-40％。

检测高糖基化人绒毛膜促性腺激素(H-HCG)水平，能够很好的监测或区分早期妊娠的为正常妊娠和不正常妊娠，因为H-HCG是妊娠早期正常分泌的一种激素，其功能为完成胎盘向子宫内膜的植入，因此对于正常妊娠而言，H-HCG分泌的不足会使胎盘植入和生长障碍，引起胎盘发育不良而导致流产。研究显示，妊娠4～7周时(据末次月经)血清H-HCG预测流产的效率高于常规HCG检查。Sasaki等检测妊娠7天左右时(据LH峰)的H-HCG和总HCG的比值来预测流产，获得了100％的阳性预测值和75％的阴性预测值。另一项对体外受精(IVF)妊娠妇女的研究表明，胚胎植入3周后的H-HCG检测预测IVF后妊娠结局效果优于常规HCG检查，并能区分流产原因是胚胎植入失败还是临床自然流产，Strom等对IVF术后第6天的血清和子宫组织的检测也发现，H-HCG对成功妊娠的诊断有100％的敏感度和特异度。并能鉴别生化妊娠。Cole在最近的研究中发现，成功妊娠和自然流产者的血清HCG浓度并没有太大差异，但自然流产妊娠妇女血清H-HCG浓度明显低于成功妊娠者，而生化妊娠的血清H-HCG水平则更低。H-HCG的检测在早孕、异位妊娠、早期流产、肿瘤监测等方面具有其优异性以及重要的临床意义。因此，研究H-HCG，如何将其应用于产品中，来制备一种检测速度快、且方便的产品迫在眉睫。

技术实现要素：

本发明为了解决上述技术缺陷，提供一种H-HCG快速免疫诊断层析试纸及其制备方法，此方法方便、快捷、准确性高，且此试纸适合于早期正常妊娠和不正常妊娠的诊断和鉴别诊断，在早孕、异位妊娠、早期流产、肿瘤监测等方面具有重要的临床意义。

本发明一方面，提供一种H-HCG快速免疫诊断试纸，包括：依次连接的样本垫、包被有检测T线与质控C线的硝酸纤维素膜、吸样垫，且所述样本垫、所述硝酸纤维素膜、所述吸样垫依次搭接、粘贴在一支撑板上；

优选地，H-HCG快速免疫诊断试纸还包括一结合垫，且所述结合垫设置在所述样本垫与所述硝酸纤维素膜之间，使得所述样本垫与所述结合垫、所述硝酸纤维素膜、所述吸样垫构成单通道试纸；

或者

H-HCG快速免疫诊断试纸还包括一纤维隔离薄膜、一结合垫和一加液垫，且所述纤维隔离薄膜两端分别搭接在所述样本垫、所述硝酸纤维素膜上方，所述结合垫两端分别搭接在所述纤维隔离薄膜、所述硝酸纤维素膜上方，所述加液垫两端分别搭接在所述纤维隔离薄膜、所述结合垫上方，使得所述样本垫与所述纤维隔离薄膜、所述结合垫、所述加液垫、所述硝酸纤维素膜、所述吸样垫构成双通道试纸。

进一步地，

所述结合垫上设置有H-HCG异性抗体B207或B152，所述硝酸纤维素膜上的所述检测T线包被有H-HCG特异性抗体B152或B207，所述质控C线含有羊抗鼠多克隆抗体；

或者，

所述结合垫上设置有抗α-HCG或β-HCG的抗体，或者抗完整HCG抗体，或者设置有H-HCG特异性抗体B207或B152；检测T线由检测线T1、检测线T2组成，且所述检测线T1包被有抗α-HCG或β-HCG的抗体，或者抗完整HCG抗体、检测线T2上包被有H-HCG特异性抗体B152或B207，或者检测线T1上包被有H-HCG特异性抗体B152或B207，检测线T2上包被有抗α-HCG或β-HCG的抗体，或者抗完整HCG抗体；适合于免疫竞争法，所述硝酸纤维素膜(3)T线上包被有H-HCG抗原或相反，结合垫(2)上设置有H-HCG抗原，T线上包被有H-HCG特异性抗体。

本发明第二方面，提供第一方面所述一种H-HCG快速免疫诊断层析试纸的制备方法，包括如下步骤：

①、样本垫的制备：配制样本垫处理液，再将经剪裁后的玻璃纤维膜或无纺布置于样本垫处理液中室温浸泡、烘干、备用；

②、结合垫的制备：配制结合垫处理液、金标抗体，将结合垫原料置于结合垫处理液中室温浸泡、烘干，再用划膜喷金机将金标抗体喷于经浸泡后的结合垫原料、烘干备用；

③、硝酸纤维素膜包被：配制包被缓冲液，用包被缓冲液分别稀释羊抗鼠多克隆抗体、抗α-HCG或β-HCG的抗体，或者抗完整HCG抗体(或者它们可以是单克隆抗体、多克隆抗体或抗体的多种片段)、H-HCG单克隆抗体B207或B152至0.1-20mg/ml，获得质控C线、检测线T1、检测线T2或者质控C线、检测线T2、检测线T1、或者质控C线、检测T线；

④、试纸的制备：

单通道试纸：在常温的干燥室内，取所述支撑板，先将上述包被的所述硝酸纤维素膜贴合于所述支撑板的中部，再在硝酸纤维素膜两侧分别粘贴所述结合垫、所述吸样垫，且在所述结合垫与所述硝酸纤维素膜相对的一侧粘贴所述样本垫，最后采用裁剪机剪切所述支撑板；

双通道试纸：所述硝酸纤维素膜一侧粘贴所述吸样垫，且所述吸样垫一侧与所述硝酸纤维素膜搭接，另一侧边缘与所述支撑板平齐，所述硝酸纤维素膜另一侧与所述样本垫搭接，使得待测样本依次通过所述样本垫、所述硝酸纤维素膜、所述吸样垫形成第一水平流动通道；

将所述纤维隔离薄膜两端分别搭接在所述样本垫、所述硝酸纤维素膜上方，所述结合垫两端分别搭接在所述纤维隔离薄膜、所述硝酸纤维素膜上方，所述加液垫两端分别搭接在纤维隔离薄膜、所述结合垫上方，使得检测过程中缓冲液依次通过所述加液垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素膜、所述吸样垫形成第二水平流动通道，最后采用裁剪机剪切所述支撑板。

优选地，所述步骤①中，样本处理液的制备方法为：称取0.5g±0.05gBSA于烧杯中，加入70ml 10mM pH8.4硼酸盐缓冲液溶解，加入吐温-20，混匀，定容、滤膜过滤后备用。

优选地，步骤②中，结合垫处理液的制备方法为：称取0.1g±0.05gBSA，0.5g±0.05g海藻糖于烧杯中，加入70ml 10mM pH8.0硼酸盐缓冲液溶解，加入吐温-20，混匀、滤膜过滤后备用；所述金标抗体中含抗α-HCG或β-HCG的抗体，或者抗完整HCG抗体，或者H-HCG异性抗体B207或B152。

所述步骤③中，包被缓冲液的制备方法为：取海藻糖于烧杯中，加入PBS溶解后再加入甲醇，混匀、定容、滤膜过滤后备用。

进一步地，所述样本垫材料为玻璃纤维膜或无纺布；所述吸样垫由吸水滤纸构成。

进一步地，所述结合垫(2)由5-100nm胶体金或5-800nm纳米材料或乳胶颗粒或碳颗粒或其它发光染料或酶结合抗HCG抗体或H-HCG抗体组成，或引用或结合亲和素、生物素；所述结合垫(2)中标记有特异性抗体的胶体金或纤维素纳米颗粒，或者标记有特异性抗体的胶体金—纤维素纳米颗粒，或二者中添加有亲和素或生物素。

本发明一种H-HCG快速免疫诊断层析试纸及其制备方法，其优点是：

①、结合垫、硝酸纤维素膜上包被H-HCG异性抗体B207或B152、或者抗α-HCG或β-HCG的抗体，或者抗完整HCG抗体的设计，可通过人体H-HCG含量的体现如血液、尿液、唾液等样本的检测来获知被检测者是否怀孕、或者孕妇的胎盘功能是否良好以及预测流产等；且此H-HCG试纸适用于妊娠早期，特别是同房后5-7天或月经过期当天的前1-2天即可开始检测，可供各级医疗机构对早孕妇女进行初步诊断及妇女在家中自我检测；

②、这种利用免疫层析试纸法快速检测的诊断试剂，特别适合于早期正常妊娠和不正常妊娠的诊断和鉴别诊断，具有特异性强、敏感性高，具有安全、易保存、稳定性好和应用方便等优点，在医学快速诊断、健康体检、普查以及家庭诊断方面、女性的医学健康和优生优育方面有着较大的适用价值和临床意义。

附图说明

图1、图2为一种H-HCG快速免疫诊断层析试纸单通道结构示意图；

图3、图4为一种H-HCG快速免疫诊断层析试纸双通道结构示意图；

图5为双通道外套壳体结构示意图；

其中：

1、样本垫，2、结合垫，21、加液垫，3、硝酸纤维素膜，31、检测T线、32、检测线T1，33、检测线T2，34、质控C线，4、吸样垫，5、支撑板，6、纤维隔离薄膜，7、加样孔，8、加液孔，9、硝酸纤维素膜视窗，10、吸样垫视窗。

具体实施方式

一种H-HCG快速免疫诊断层析试纸，包括依次连接的样本垫1、包被有检测T线31与质控C线34的硝酸纤维素膜3、吸样垫4，且所述样本垫1、所述硝酸纤维素膜3、所述吸样垫4依次搭接、粘贴在一支撑板5上。

优选地，H-HCG快速免疫诊断层析试纸：还包括一结合垫2，且所述结合垫2设置在所述样本垫1与所述硝酸纤维素膜3之间，使得所述样本垫1与所述结合垫2、所述硝酸纤维素膜3、所述吸样垫4构成单通道试纸(如图1、图2所示)。

优选地，H-HCG快速免疫诊断层析试纸：还包括一纤维隔离薄膜6、一结合垫2和一加液垫21，且所述纤维隔离薄膜6两端分别搭接在所述样本垫1、所述硝酸纤维素膜3上方，所述结合垫2两端分别搭接在所述纤维隔离薄膜6、所述硝酸纤维素膜3上方，所述加液垫21两端分别搭接在纤维隔离薄膜6、所述结合垫2上方，使得所述样本垫1与所述纤维隔离薄膜6，所述结合垫2、与所述加液垫21、所述硝酸纤维素膜3、所述吸样垫4构成双通道试纸(如图3、图4所示)；

进一步地，

所述结合垫2上设置有H-HCG异性抗体B207或B152，所述硝酸纤维素膜3上包被有H-HCG特异性抗体B152或B207，所述质控C线34含有羊抗鼠多克隆抗体；

或者，

所述结合垫2上设置有抗α-HCG或β-HCG的抗体，或者抗完整HCG抗体，，或者设置有H-HCG特异性抗体B207或B152；检测T线31由检测线T1 32、检测线T2 33组成，且所述检测线T1 32包被有抗α-HCG或β-HCG的抗体，或者抗完整HCG抗体、检测线T2 33上包被有H-HCG特异性抗体B152或B207，或者检测线T1 32上包被有H-HCG特异性抗体B152或B207，检测线T2 33上包被有抗α-HCG或β-HCG的抗体，或者抗完整HCG抗体；

或者，

适合于免疫竞争法，所述硝酸纤维素膜3T线上包被有H-HCG抗原或相反，结合垫2上设置有H-HCG抗原，T线上包被有H-HCG特异性抗体。

优选地，所述样本垫1材料为玻璃纤维膜或无纺布；所述吸样垫4由吸水滤纸构成。

优选地，所述结合垫2由5-100nm胶体金或5-800nm纳米材料或乳胶颗粒或碳颗粒或其它发光染料或酶结合抗HCG抗体或H-HCG抗体组成，或引用或结合亲和素、生物素；所述结合垫2中标记有特异性抗体的胶体金或纤维素纳米颗粒，或者标记有特异性抗体的胶体金—纤维素纳米颗粒，或二者中添加有亲和素或生物素。

所述检测T线31具有固定抗体或者H-HCG抗原或加有生物素或亲和素。

上述所述中，H-HCG特异性抗体B207和B152的用量在0.01-100mg/ml，抗α-HCG或β-HCG的抗体，或者抗完整HCG抗体的用量在0.01-100mg/ml。

本发明一种H-HCG快速免疫诊断层析试纸，具体有如下形式：

一、结合垫2含有H—HCG特异性抗体B207，检测T线31为硝酸纤维素膜3上包被有H—HCG特异性抗体B152，质控C线34为包被在硝酸纤维素膜3上的羊抗鼠多克隆抗体；

二、结合垫2含有H—HCG特异性抗体B207，检测T线31为硝酸纤维素膜3上包被有H—HCG特异性抗体B207，质控C线34为包被在硝酸纤维素膜3上的羊抗鼠多克隆抗体；

三、结合垫2含有H—HCG特异性抗体B152，检测T线31为硝酸纤维素膜3上包被有H—HCG特异性抗体B207，质控C线34为包被在硝酸纤维素膜3上的羊抗鼠多克隆抗体；

四、结合垫2含有H—HCG特异性抗体B152，检测T线31为硝酸纤维素膜3上包被有H—HCG特异性抗体B152，质控C线34为包被在硝酸纤维素膜3上的羊抗鼠多克隆抗体；

五、结合垫2含有H—HCG特异性抗体B207，检测线T1 32为硝酸纤维素膜3上包被有抗α-HCG抗体，检测线T2 33为硝酸纤维素膜3上包被有H—HCG特异性抗体B152，质控C线34为包被在硝酸纤维素膜3上的羊抗鼠多克隆抗体；

六、结合垫2含有H—HCG特异性抗体B207，检测线T1 32为硝酸纤维素膜3上包被有抗β-HCG抗体，检测线T2 33为硝酸纤维素膜3上包被有H—HCG特异性抗体B152，质控C线34为包被在硝酸纤维素膜3上的羊抗鼠多克隆抗体；

七、结合垫2含有H—HCG特异性抗体B207，检测线T1 32为硝酸纤维素膜3上包被有H—HCG特异性抗体B152，检测线T2 33为硝酸纤维素膜3上包被有抗β-HCG抗体，质控C线34为包被在硝酸纤维素膜3上的羊抗鼠多克隆抗体；

八、结合垫2含有H—HCG特异性抗体B207，检测线T1 32为硝酸纤维素膜3上包被有H—HCG特异性抗体B152，检测线T2 33为硝酸纤维素膜3上包被有抗α-HCG抗体，质控C线34为包被在硝酸纤维素膜3上的羊抗鼠多克隆抗体；

九、结合垫2含有H—HCG特异性抗体B207,检测线T1 32为硝酸纤维素膜3上包被有抗α-HCG抗体，检测线T2 33为硝酸纤维素膜3上包被有抗β-HCG抗体,质控C线34为包被在硝酸纤维素膜3上的羊抗鼠多克隆抗体；

十、结合垫2含有H—HCG特异性抗体B207,检测线T1 32为硝酸纤维素膜3上包被有抗β-HCG抗体，检测线T2 33为硝酸纤维素膜3上包被有抗α-HCG抗体，质控C线34为包被在硝酸纤维素膜3上的羊抗鼠多克隆抗体；

十一、结合垫2含有H—HCG特异性抗体B152，检测线T1 32为硝酸纤维素膜3上包被有H—HCG特异性抗体B207，检测线T2 33为硝酸纤维素膜3上包被有抗β-HCG抗体，质控C线34为包被在硝酸纤维素膜3上的羊抗鼠多克隆抗体；

十二、结合垫2含有H—HCG特异性抗体B152，检测线T1 32为硝酸纤维素膜3上包被有抗β-HCG抗体，检测线T2 33为硝酸纤维素膜3上包被有h-HCG特异性抗体B207，质控C线34为包被在硝酸纤维素膜3上的羊抗鼠多克隆抗体；

十三、结合垫2有H-HCG特异性抗体B152，检测线T1 32为硝酸纤维素膜3上包被有抗α-HCG抗体,检测线T2 33为硝酸纤维素膜3上包被有HCG特异性抗体B207，质控C线34为包被在硝酸纤维素膜3上抗鼠多克隆的羊抗体；

十四、结合垫2有H-HCG特异性抗体B152，检测线T1 32为硝酸纤维素膜3上包被有H—HCG特异性抗体B207，检测线T2 33为硝酸纤维素膜3上包被有抗α-HCG抗体，质控C线34为包被在硝酸纤维素膜3上抗鼠多克隆的羊抗体；

十五、结合垫2有H-HCG特异性抗体B152，检测线T1 32为硝酸纤维素膜3上包被有抗α-HCG抗体,检测线T2 33为硝酸纤维素膜3上包被有抗β-HCG抗体，质控C线34为包被在硝酸纤维素膜3上抗鼠多克隆的羊抗体；

十六、结合垫2有H-HCG特异性抗体B152,检测线T1 32为硝酸纤维素膜3上包被有抗β-HCG抗体,检测线T2 33为硝酸纤维素膜3上包被有抗α-HCG抗体,，质控C线34为包被在硝酸纤维素膜3上抗鼠多克隆的羊抗体；

十七、结合垫2有抗α-HCG抗体，检测线T1 32为硝酸纤维素膜3上包被有H-HCG特异性抗体B207，检测线T2 33为硝酸纤维素膜3上包被有H—HCG特异性抗体B152,质控C线34为包被在硝酸纤维素膜3上抗鼠多克隆的羊抗体；

十八、结合垫2有抗α-HCG抗体，检测线T1 32为硝酸纤维素膜3上包被有H-HCG特异性抗体B152，检测线T2 33为硝酸纤维素膜3上包被有H-HCG特异性抗体B207，质控C线34为包被在硝酸纤维素膜3上抗鼠多克隆的羊抗体；

十九、结合垫2有抗α-HCG抗体，检测线T1 32为硝酸纤维素膜3上包被有抗β-HCG抗体,检测线T2 33为硝酸纤维素膜3上包被有H-HCG特异性抗体B207，质控C线34为包被在硝酸纤维素膜3上抗鼠多克隆的羊抗体；

二十、结合垫2有抗α-HCG抗体，检测线T1 32为硝酸纤维素膜3上包被有抗β-HCG抗体，检测线T2 33为硝酸纤维素膜3上包被有H-HCG特异性抗体B152，质控C线34为包被在硝酸纤维素膜3上抗鼠多克隆的羊抗体；

二十一、结合垫2有抗α-HCG抗体,检测线T1 32为硝酸纤维素膜3上包被有H-HCG特异性抗体B207，检测线T2 33为硝酸纤维素膜3上包被有抗β-HCG抗体，质控C线34为包被在硝酸纤维素膜3上抗鼠多克隆的羊抗体；

二十二、结合垫2有抗α-HCG抗体，检测线T1 32为硝酸纤维素膜3上包被有H-HCG特异性抗体B152，检测线T2 33为硝酸纤维素膜3上包被有抗β-HCG抗体,质控C线34为包被在硝酸纤维素膜3上抗鼠多克隆的羊抗体；

二十三、结合垫2有抗β-HCG抗体，检测线T1 32为硝酸纤维素膜3上包被有有H-HCG特异性抗体B207，检测线T2 33为硝酸纤维素膜3上包被有H-HCG特异性抗体B152,质控C线34为包被在硝酸纤维素膜3上抗鼠多克隆的羊抗体；

二十四、结合垫2有抗β-HCG抗体，检测线T1 32为硝酸纤维素膜3上包被有H-HCG特异性抗体B152，检测线T2 33为硝酸纤维素膜3上包被有H-HCG特异性抗体B207，质控C线34为包被在硝酸纤维素膜3上抗鼠多克隆的羊抗体。

二十五、结合垫2有抗β-HCG抗体，检测线T1 32为硝酸纤维素膜3上包被有抗α-HCG抗体,检测线T2 33为硝酸纤维素膜3上包被有H-HCG特异性抗体B207，质控C线34为包被在硝酸纤维素膜3上抗鼠多克隆的羊抗体。

二十六、结合垫2有抗β-HCG抗体，检测线T1 32为硝酸纤维素膜3上包被有抗α-HCG抗体,检测线T2 33为硝酸纤维素膜3上包被有H-HCG特异性抗体B152,质控C线34为包被在硝酸纤维素膜3上抗鼠多克隆的羊抗体。

二十七、结合垫2有抗β-HCG抗体，检测线T1 32为硝酸纤维素膜3上包被有H-HCG特异性抗体B207,检测线T2 33为硝酸纤维素膜3上包被有抗α-HCG抗体,质控C线34为包被在硝酸纤维素膜3上抗鼠多克隆的羊抗体。

二十八、结合垫2有抗β-HCG抗体，检测线T1 32为硝酸纤维素膜3上包被有H-HCG特异性抗体B152，检测线T2 33为硝酸纤维素膜3上包被有抗α-HCG抗体，质控C线34为包被在硝酸纤维素膜3上抗鼠多克隆的羊抗体。

本发明一种H-HCG快速免疫诊断试纸还可以制作成卡、笔的形式。当双通道模式制成卡、笔的形式时，试纸外套有一外壳，外壳上设计有与所述样本垫1、所述加液垫21、所述硝酸纤维素膜3、所述吸样垫4分别对应的加样孔7、加液孔8、硝酸纤维素膜视窗9、吸样垫视窗10(如图5所示)。

实施例一：

所述一种H-HCG快速免疫诊断层析试纸的制备方法，包括如下步骤：

主要原料如下：

试剂：氯金酸、柠檬酸三钠、抗α-HCG或β-HCG的抗体，H-HCG特异性抗体B207或B152；、BSA、海藻糖、NaCl、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、硼酸、硼砂、吐温-20、Triton X-100、蔗糖、超纯水；

耗材：硝酸纤维素膜(NC膜)、8975玻璃纤维、GF-06玻璃纤维、吸水垫、底板、容量瓶、锥形瓶、EP管、枪头。

一、制备前的准备：

1.1 2％柠檬酸三纳溶液配制

称取0.105g柠檬酸三纳于15mlEP管中，加入5ml纯水，混匀至完全溶解即为2％柠檬酸三纳溶液。

取40ml纯水于50ml容量瓶中，向容量瓶中加入0.5ml 1％氯金酸溶液，用纯水定容至50ml，混匀即为0.01％氯金酸溶液。将50ml 0.01％氯金酸溶液倒入100ml锥形瓶中，放在电炉上用3-4档加热至沸腾，用移液枪吸取380μL 2％柠檬酸三纳溶液，快速打入到沸腾的氯金酸溶液中，继续加热，即40-55nm胶体金制备完毕。

1.2 PBS缓冲液配制：

称取Na₂HPO₄·12H₂O 1.615-2g，NaH₂PO₄·2H₂O 0.225-5g，NaCl 4.0-5.0g于烧杯中，加入400ml超纯水溶解定容至500ml，0.22μm滤膜过滤后备用。

1.3复溶液配制：

称取BSA 1g，蔗糖10-13g于烧杯中，加入70ml PBS溶解，加入0.08-0.1ml Triton X-100，混匀，定容至100ml，0.22μm滤膜过滤后备用。

2、最佳pH确定：

分别取1mL胶体金于6个1.5mLEP管中，向每管分别加入0.2M K₂CO₃ 1μL、2μL、3μL、5μL、7μL、10μL，对应pH分别约为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，向每管分别加入150-200μL 0.1mg/mL抗体溶液，混匀，37度静置20min，向每管分别加入100-130μL10％NaCl溶液，混匀，静置观察颜色变化，0.2M K₂CO₃加入量为1-3μL的EP管中胶体金颜色仍为紫红色，其他管变为蓝色，最适pH为7.0-8.0。

3、最小抗体标记量确定：

取4支EP管，分别取1mL胶体金加入各管中，再向每管分别加入K₂CO₃2-4μL，混匀，加入30μL(3μg)、50μL(5μg)、70μL(7μg)、100μL(10μg)的0.08-0.1mg/ml的抗体溶液，混匀，37℃静置20min，向每管加入10％NaCl溶液，混匀，静置观察颜色变化，抗体加入量为7-10μg的EP管中胶体金颜色未发生明显变化为紫红色，抗体加入量为3、5μg的EP管中胶体金变蓝，说明1ml胶体金的最小抗体加入量为5-8μg。

4、金标抗体制备：

分别取40nm-55nm的胶体金1mL于EP管中，向管中分别加入K₂CO₃溶液2-4μL，混匀，向EP管中加入0.08-0.1mg/ml抗体70μL，混匀，37℃放置20min，从管中取100μL于500μLEP管中，加入10μL10％NaCl溶液，混匀，静置观察颜色为红色，可以进行后续试验。向40-55nm的胶体金EP管中加入100μL 5％PEG溶液,37℃静置2h进行封闭，4℃10000g离心20min，弃上清，用100μL复溶液复溶，4℃保存备用。

5、

0.2M硼酸溶液配制：称取硼酸12.37g于烧杯中，加入800ml超纯水溶解后定容至1L，0.22μm滤膜过滤后备用。

0.05M硼砂溶液配制：称取硼砂19.07g于烧杯中，加入800ml超纯水溶解后定容至1L，0.22μm滤膜过滤后备用。

10mM pH8.0硼酸-硼砂缓冲液配制：分别取3ml 0.05M硼砂溶液、7ml 0.2M硼酸溶液于烧杯中，加入190ml超纯水，混匀备用。

10mM pH8.4硼酸-硼砂缓冲液配制：分别取4.5ml 0.05M硼砂溶液、5.5ml 0.2M硼酸溶液于烧杯中，加入190ml超纯水，混匀备用。

二、制备方法

①、样本垫1的制备：

配制样本液，称取0.5g±0.05gBSA于100ml烧杯中，加入70ml 10mM pH8.4硼酸盐缓冲液溶解，加入0.3ml吐温-20，混匀，定容至100ml，0.22μm滤膜过滤后备用；

再将经剪裁为成0.7cm和3.2cm宽的长条后的玻璃纤维膜置于样本液中室温浸泡4h，37℃烘干，干燥皿中保存备用；

②、结合垫2的制备：

配制结合垫2处理液：称取0.1g±0.05gBSA，0.5g±0.05g海藻糖于100ml烧杯中，加入70ml 10mM pH8.0硼酸盐缓冲液溶解，加入0.3ml吐温-20，混匀，定容至100ml，0.22μm滤膜过滤后备用；

金标抗体的制备：取1mL 40-55nm胶体金于EP管中，加入2μL 0.2M K₂CO₃溶液，混匀，加入70μL 0.08-0.1mg/ml抗体溶液，混匀，37℃静置20min，加入100μL 10％BSA溶液(终浓度1％)，混匀，37℃放置1.5h，4℃，12000g离心20min，弃上清，加入1ml PBS复溶，4℃，12000g离心20min，弃上清，加入100μL复溶液复溶，4℃保存备用；

再将结合垫2原料裁成0.7cm宽的长条后置于结合垫2处理液中室温浸泡4h，37℃烘干，再用划膜喷金机按照8-15μL/cm的量将金标抗体喷于经浸泡后的结合垫2原料，37℃烘干，干燥皿中保存备用；

③、硝酸纤维素膜3包被：配制包被缓冲液：称取3g海藻糖于烧杯中，加入80-100mlPBS溶解，加入3-5ml甲醇，混匀，定容至100ml，0.22μm滤膜过滤后备用；

包被检测线T1 32：用包被缓冲液将抗体稀释至0.5-2mg/ml，按0.9-1.5μL/cm的量划在所述硝酸纤维素膜3上，37℃烘干后干燥皿中保存备用。

包被检测线T2 33：用包被缓冲液抗体稀释至0.5-2mg/ml，按0.9-1.3μL/cm的量划在所述硝酸纤维素膜3上，37℃烘干后干燥皿中保存备用。

包被质控C线34：用包被缓冲液将羊抗鼠多克隆抗体稀释至1.0-1.5mg/ml，按0.7-1.4μL/cm的量划在所述硝酸纤维素膜3上，37℃烘干后干燥皿中保存备用；

④、试纸的制备：

单通道试纸制备：

在温度20-30℃、湿度小于30-40％的干燥室内，取支撑板5，将已包被的硝酸纤维素膜3放置在支撑板5的中部粘贴；

在所述硝酸纤维素膜3的检测T线31一侧搭接结合垫2(搭结合垫2的三分之一)粘贴，在结合垫2另一侧搭接粘贴样本垫1(搭样本垫1的十分之一)，在硝酸纤维素膜3上的质控C线34一侧搭接吸样垫4(搭吸样垫4的十分之一)；在最上面贴一层标志膜，即H-HCG快速免疫诊断试纸制备成功，最后用裁剪机将制备的试纸切成3-4mm宽的试纸条。切好的试纸条可单用，也可以再装入塑料卡或棒(笔)内，形成HCG-H快速诊断试纸卡或棒(笔)；

双通道试纸制备：

在温度20-30℃、湿度小于30-40％的干燥室内，取支撑板5，将已包被的所述硝酸纤维素膜3放置在支撑板5的中部粘贴；

在所述硝酸纤维素膜3一侧粘贴所述吸样垫4，且所述吸样垫4一侧与所述硝酸纤维素膜3搭接，另一侧边缘与所述支撑板5平齐，所述硝酸纤维素膜3另一侧与所述样本垫1搭接，使得待测样本依次通过所述样本垫1、所述硝酸纤维素膜3、所述吸样垫4形成第一水平流动通道；

将所述纤维隔离薄膜6两端分别搭接在所述样本垫1、所述硝酸纤维素膜3上方，所述结合垫2两端分别搭接在所述纤维隔离薄膜6、所述硝酸纤维素膜3上方，所述加液垫21两端分别搭接在纤维隔离薄膜6、所述结合垫2上方，使得检测过程中缓冲液依次通过所述加液垫21、所述结合垫2、所述硝酸纤维素膜3、所述吸样垫4形成第二水平流动通道，即H-HCG快速免疫诊断试纸制备成功，最后用裁剪机将制备的试纸剪切成4mm宽的试纸条，切好的试纸条可装入塑料卡或棒(笔)内，形成HCG-H快速诊断试纸卡或棒(笔)；

上述双通道具体研究过程为：当样本中的被检测物通过第一水平流动通道达所述硝酸纤维素膜3后，与所述检测T线31上的特异性抗体结合，10秒-5分钟后，所述吸样垫4有样本层析时，所述加液垫21上加缓冲液，所述结合垫2中的标记物(缀合物)通过第二水平流动通道达到所述硝酸纤维素膜3上，与所述检测T线31上的检测物—特异性抗体复合物结合后呈肉眼可见的颜色(阳性/阴性)反应。为了方便或更准确观察所述吸样垫4有无样本层析，所述吸样垫4上可添加着色剂或着色条带，当所述吸样垫4有样本层析时显色，此时便可在所述加液垫21处加入缓冲液，该方法优于和/或优先以10秒-5分钟后再在所述加液垫21处加入缓冲液的方式。

上述所述搭接长度均为2mm；且双通道试纸条中，运用到所述加液垫21上的缓冲液是根据检测物不同而选择的不同标的缓冲液，用于快速诊断出结果。三、试纸测试及结果判断

1、试纸条测试：

单通道：将试纸条放入待测液(使加样孔7浸没在液面下)中停留5s，取出平放在台面上，15min后读取结果，30min内有效；

双通道：将试纸条放入待测液(使加样孔7浸没在液面下)中停留5s，取出平放在台面上，当所述吸样垫视窗10中的颜色由白色变为红色后，取50μLPBS滴在加液孔8中，5min后读取结果，30min内有效。

2、结果判断：

如图1、图3：当出现二条红色条带，一条位于检测线T、另一条位于质控C线34，表明已怀孕，或者表明孕妇的胎盘功能良好、发生流产的几率极小；当出现一条红色条带，仅位于质控C线34，表明没有怀孕或者表明孕妇的胎盘功能差；当5-10分钟时在质控C线34无红色条带出现，表明不正确的操作过程或者试纸条已变质损坏，需要用新的试纸条正确操作和/或重新测试。

如图2、图4，当出现三条红色条带，一条位于检测线T1 32、一条位于检测线T2 33、另一条位于质控C线34，表明已怀孕，而且孕妇的胎盘功能良好、发生流产的机会极小；当出现二条红色条带，一条位于检测线T1 32或者T2、另一条位于质控C线34，表明已怀孕，但是孕妇的胎盘功能不好、发生流产的几率大，需要进一步检查和/或治疗；当出现一条红色条带，仅位于质控C线34，表明没有怀孕；当5-10分钟时在质控C线34无红色条带出现，表明不正确的操作过程或者试纸条已变质损坏，需要用新的试纸条正确操作和/或重新测试。

实施例二

H—HCG快速免疫诊断层析试纸的敏感性检测

1、12.5mIU/ml、25mIU/ml、50mIU/ml HCG溶液的配制：用含0.5％BSA的PBS溶液将HCG标准品复溶，再配制成12.5mIU/ml、25mIU/ml、50mIU/ml HCG溶液。

2、110mIU/ml H-HCG溶液的配制：用含0.5％BSA的PBS溶液将H-HCG标准品复溶，再配制成110mIU/ml溶液。

3、单通道：将同一批号的试纸条分别放入12.5mIU/ml、25mIU/ml、50mIU/ml HCG溶液及110mIU/ml H-HCG溶液中停留约5s，取出平放在台面上等待约15min，观察结果，检测结果30min内有效。每个检测浓度各重复3次，各溶液3次检测结果均为阳性才可判为次浓度的结果为阳性；

双通道：将同一批号的试纸条分别放入12.5mIU/ml、25mIU/ml、50mIU/ml HCG溶液及110mIU/ml H-HCG溶液中停留约5s(使加样孔7浸没在液面下)，取出平放在台面上，当吸样垫视窗10中的颜色由白色变为红色后，取50μL PBS溶液加在上层加液孔8中，等待约10min读取结果，检测结果30min内有效，每个检测浓度各重复3次，各溶液3次检测结果均为阳性才可判为次浓度的结果为阳性。

表1单/双通道敏感性测试

注：“-”表示不可见，“+++”表示明显可见,110＝110mIU/ml H-HCG溶液.

从表1可知：单通道和双通道敏感性测试12.5mIU/ml、25mIU/ml、50mIU/ml HCG标准品时HCG线正常，符合国标要求，H-HCG线未出线，说明HCG标准品与H-HCG抗体无交叉反应；测试110mIU/ml H-HCG标准品时HCG和H-HCG线均出线，说明H-HCG标准品与抗α-HCG抗体、抗β-HCG抗体和H-HCG抗体B207/B152均有较好的交叉反应。

实施例三

H—HCG快速免疫诊断层析试纸的特异性检测

1、溶液配制：0mIU/ml HCG溶液：称取0.5gBSA于烧杯中，加入70ml PBS缓冲液溶解定容至100ml，0.22μm滤膜过滤后备用。

2、500mIU/ml人促黄体生成素(hLH)溶液：用含0.5％BSA的PBS溶液将hLH标准品复溶，用0mIU/ml HCG溶液将其配制成浓度为500mIU/ml，即为hLH A液；用25mIU/ml HCG溶液将其配制成浓度为500mIU/ml，即为hLH B液；用110mIU/ml H-HCG溶液将其配制成浓度为500mIU/ml，即为hLH C液。

3、1000mIU/ml人卵泡刺激素(hFSH)溶液：用含0.5％BSA的PBS溶液将hFSH标准品复溶，用0mIU/ml HCG溶液将其配制成浓度为1000mIU/ml，即为hFSH A液；用25mIU/ml HCG溶液将其配制成浓度为1000mIU/ml，即为hFSH B液；用110mIU/ml H-HCG溶液将其配制成浓度为1000mIU/ml，即为hFSH C液。

4、1000μIU/ml人促甲状腺素(hTSH)溶液：用含0.5％BSA的PBS溶液将hLH标准品复溶，用0mIU/ml HCG溶液将其配制成浓度为1000μIU/ml，即为hTSH A液；用25mIU/ml HCG溶液将其配制成浓度为1000μIU/ml，即为hTSH B液；用110mIU/ml H-HCG溶液将其配制成浓度为1000μIU/ml，即为hTSH C液。

5、阴性特异性：

单通道：将同一批号的试纸条分别放入浓度为500mIU/ml hLH A液、1000mIU/ml hFSH A液、1000μIU/ml hTSH A液溶液中停留约5s，取出平放在台面上等待约15min，观察结果，检测结果30min内有效，各浓度各重复3次，各溶液的3次检测结果均为阴性则判断该溶液的特异性为阴性；

双通道：将同一批号的试纸条分别放入浓度为500mIU/ml hLH A液、1000mIU/ml hFSH A液、1000μIU/ml hTSH A液溶液中停留约5s(使加样孔7浸没在液面下)，取出平放在台面上，当吸样垫视窗10中的颜色由白色变为红色时取50μL PBS溶液加在上层加液孔8中，等待约10min读取结果，检测结果30min内有效，各浓度各重复3次，各溶液的3次检测结果均为阴性则判断该溶液的特异性为阴性。

表2单/双通道阴性特异性测试结果

注：“-”表示不可见，“+++”表示明显可见

从表2可知：单通道和双通道试纸条的阴性特异性测试HCG线和H-HCG线均为阴性，两条T线均无假阳性出现，该项指标符合国标要求。

6、阳性特异性：

单通道：将同一批号的试纸条分别放入浓度为500mIU/ml Hlh B液和C液、1000mIU/ml hFSH B液和C液、1000μIU/ml hTSH B液和C液溶液中停留约5s，取出平放在台面上等待约15min，观察结果，检测结果30min内有效。各浓度各重复3次，各溶液的3次检测结果均为阴性则判断该溶液的特异性为阴性；

双通道：将同一批号的试纸条分别放入浓度为500mIU/ml hLH B液和C液、1000mIU/ml hFSH B液和C液、1000μIU/ml hTSH B液和C液溶液中停留约5s(使加样孔7浸没在液面下)，取出平放在台面上，当吸样垫视窗10中的颜色由白色变为红色后，取50μL PBS溶液加在上层加液孔8中，等待约10min读取结果，检测结果30min内有效，各浓度各重复3次，各溶液的3次检测结果均为阳性则判断该溶液的特异性为阳性。

表3单/双通道阳性特异性测试结果

注：“-”表示不可见，“++”表示可见，“+++”表示明显可见

从3表可知：单通道和双通道试纸条的阳性特异性测试HCG线和H-HCG线均为阳性，两条T线均无假阴性出现，该项指标也符合国标要求。

实施例四：

H—HCG快速免疫诊断层析试纸的稳定性检测

将同一批号的试纸条在37℃放置7d、15d、21d后分别测试试纸条灵敏度、特异性及重复性，灵敏度和特异性测试方法同实施例二和实施例三。

重复性测试方法如下：

1、单通道：每个时间点取20根试纸条放入25mIU/ml HCG标准品或者110mIU/ml的H-HCG溶液中停留约5s，取出平放在台面上等待约15min，观察结果，检测结果30min内有效。

2、双通道：每个时间点取20根试纸条放入25mIU/ml HCG标准品或者110mIU/ml的H-HCG溶液中停留约5s(使加样孔7浸没在液面下)，取出平放在台面上，当吸样垫视窗10中的颜色由白色变为红色后，取50μL PBS溶液加在上层加液孔8中，等待约10min读取结果，检测结果在30min内有效。

表4 37℃、21天破坏后试纸条单、双通道最低检测限测试结果

注：“-”表示不可见，“++”表示可见，“+++”表示明显可见,110＝110mIU/ml H-HCG溶液.

表5 37℃、21天破坏后试纸条阴性特异性测试结果

注：“-”表示不可见，“+++”表示明显可见

表6 37℃、21天破坏后试纸条阳性性特异性测试结果

注：“-”表示不可见，“++”表示可见，“+++”表示明显可见

表7 37℃破坏后试纸条重复性测试结果

注：“-”表示不可见，“++”表示可见，“+++”表示明显可见

从表4-7可知：单通道和双通道试纸条经过37℃破坏后测试敏感性、特异性和重复性，结果均无假阳性和假阴性，符合国标要求，说明试纸条稳定性良好。

实施例五:

H—HCG快速免疫诊断层析试纸的临床实验

对收集的临床尿液、血液，使用本申请试纸条，按照使用方法进行检测，以医院临床检查结果进行对照，医院血检结果显示50份样本中有5份样本的血HCG值小于1.2mIU/ml，诊断为未怀孕，为阴性样本，其它45份样本的血HCG值大于5mIU/ml，诊断为怀孕，为阳性样本，经过其它临床辅助检查，在45份阳性样本中诊断出5份胎停育样本；将该50份样本的尿液、血液分别用本试纸条检测，试纸条检出的5份阴性样本与医院临床结果一致未出现假阳性，试纸条检出的其它45份样本均为阳性与医院临床结果一致未出现假阴性，HCG线符合率100％，另外在45份阳性样本中本试纸条检测出的5份胎停育样本与医院临床诊断结果也一致，H-HCG线对胎停育检测符合率也为100％，说明本申请的试纸条可以同时检测正常怀孕和胎停育的异常妊娠或流产的初步诊断。本试纸条临床测试见表8：

表8试纸条临床测试结果

注：“-”表示不可见，“+++”表示明显可见，++表示可见，+微弱可见

文中，H-HCG表示高糖基化人绒毛膜促性腺激素。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。