一种C反应蛋白免疫荧光定量试纸条及其制备方法与流程

本发明涉及免疫学检测领域，更具体地涉及一种C反应蛋白免疫荧光定量试纸条及其制备方法。

背景技术：

C反应蛋白(C-reaction,CRP)是由肝脏合成的一种急性时相蛋白，痕量存在于健康人血清中，当机体受到感染或组织损伤时含量迅速升高，随着病情改善或组织结构功能的恢复其含量恢复到正常水平。根据血清、血浆或全血中CRP的浓度水平，可以有效的判断有无感染、疾病的危险程度及疾病是否处于活动期。因此，CRP作为全身性炎症反应早期检测的灵敏指标，已在临床许多疾病的诊断、治疗和预后中广泛应用。

目前CRP的检测方法有免疫扩散法、乳胶凝集法、免疫标记法、速率散射比浊法及免疫透射比浊法。其中，免疫扩散法特异性高、重复性好、操作简单、价格低廉、不需要特殊仪器，但是敏感性较差；乳胶凝集法操作简单、快速、特异性较高，但易受补体、类风湿因子等干扰，产生假阳性结果；速率散射比浊法和免疫透射比浊法的检测时间、操作方法、结果精确度、重复性、灵敏度方面均较优，但需要配备大型的全自动蛋白分析仪。

免疫荧光标记是免疫层析技术和荧光标记技术的结合，被广泛应用于多类抗原物质的检测，具有检测仪器精巧轻便、操作简单迅速、结果精准等优点。因此，制备和生产C反应蛋白免疫荧光定量试纸条非常有市场价值。然而，要实现C反应蛋白免疫荧光定量试纸条的制备和长期保存，储存液是关键之一。储存液的好坏关乎试纸条的准确度和保存期，因此，通过改进储存液，开发高准确度的C反应蛋白免疫荧光定量试纸条非常有现实意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种C反应蛋白免疫荧光定量试纸条及其制备方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种C反应蛋白免疫荧光定量试纸条，包括吸水垫、硝酸纤维素膜、质控线、检测线、结合垫、样品垫、PVC底板；其中，结合垫上喷有C反应蛋白一抗-荧光微球偶联物；检测线为C反应蛋白一抗，质控线为C反应蛋白二抗，且检测线和质控线依次固定于硝酸纤维素膜上；样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次搭接并承载于PVC底板；C反应蛋白一抗-荧光微球偶联物使用储存液进行浸渍处理、保存和稀释；所述的储存液配方为：PB的质量浓度为15～25mM、BSA的百分浓度为1.6％～2％、Tween-80的百分浓度为0.4％～0.6％、葡萄糖的百分浓度为0.4％～0.6％、甘氨酸的百分浓度为1.5％～2.5％、PEG4000的百分浓度为0.8％～1.2％、PEG20000的百分浓度为1％～2％、Proclin300或叠氮钠的百分浓度为0.01％～0.1％。

作为优选的储存液配方，PB的质量浓度为20mM、BSA的百分浓度为1.8％、Tween-80的百分浓度为0.5％、葡萄糖的百分浓度为0.5％、甘氨酸的百分浓度为2％、PEG4000的百分浓度为1％、PEG20000的百分浓度为1.5％、Proclin300或叠氮钠的百分浓度为0.03％。

试纸条加样层析后，检测质控线和检测线的荧光信号强度，并以质控线荧光信号强度校正检测线的荧光信号强度，实现C反应蛋白的定量检测。

一种C反应蛋白免疫荧光定量试纸条的制备方法，包括如下步骤：

(1)将荧光微球活化后与C反应蛋白一抗偶联，偶联完毕后加入封闭剂，保存于储存液中；

(2)将C反应蛋白一抗-荧光微球偶联物用储存液稀释后，喷于结合垫上，干燥保存；

(3)将C反应蛋白一抗固定于硝酸纤维素膜上作为检测线，将C反应蛋白二抗固定于硝酸纤维素膜上作为质控线；

(4)在PVC底板上依次搭接地粘贴：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，并剪切成适当宽度即成为C反应蛋白免疫荧光定量试纸条，其中，样品垫材质为玻璃纤维素膜或滤血膜，结合垫材质为玻璃纤维素膜；

上述的储存液配方为：PB的质量浓度为15～25mM、BSA的百分浓度为1.6％～2％、Tween-80的百分浓度为0.4％～0.6％、葡萄糖的百分浓度为0.4％～0.6％、甘氨酸的百分浓度为1.5％～2.5％、PEG4000的百分浓度为0.8％～1.2％、PEG20000的百分浓度为1％～2％、Proclin300或叠氮钠的百分浓度为0.01％～0.1％。

作为优选的储存液配方，PB的质量浓度为20mM、BSA的百分浓度为1.8％、Tween-80的百分浓度为0.5％、葡萄糖的百分浓度为0.5％、甘氨酸的百分浓度为2％、PEG4000的百分浓度为1％、PEG20000的百分浓度为1.5％、Proclin300或叠氮钠的百分浓度为0.03％。

C反应蛋白一抗-荧光微球偶联物在储存液中的保存浓度为0.1～10mg/mL。

本发明的有益效果是：

相对于普通储存液制备的试纸条，本发明所制备的C反应蛋白免疫荧光定量试纸条存储稳定性更佳，精密度更好，检测样品的出峰具有更高的信号和较平整的基线，准确度较高。

附图说明

图1：优选的储存液制备的C反应蛋白免疫荧光定量试纸条检测芬兰ORION DIAGNOSTICA的C反应蛋白标准曲线；

图2：优选的储存液制备的C反应蛋白免疫荧光定量试纸条检测C反应蛋白重组抗原的检测值与理论值散点图；

图3：不同储存液制备的试纸条检测含不同浓度C反应蛋白的病人血清样本的荧光检测折线图；

图4：不同储存液制备的试纸条检测含C反应蛋白的病人血清样本检测值与芬兰ORION DIAGNOSTICA QuikRead CRP检测值的相关图。

具体实施方式

实施例1

C反应蛋白免疫荧光定量试纸条的制备过程如下：

(1)优选储存液的制备：PB的质量浓度为20mM、BSA的百分浓度为1.8％、Tween-80的百分浓度为0.5％，葡萄糖的百分浓度为0.5％、甘氨酸的百分浓度为2％、PEG4000的百分浓度为1％、PEG20000的百分浓度为1.5％、Proclin300百分浓度为0.03％，按上述配方配制混匀后过滤除菌，制得储存液；

(2)样品垫的制备：用样品垫处理液浸泡玻璃纤维膜10min，置于干燥间37℃湿度30％，烘干3h，制得样品垫，备用；

(3)结合垫的制备：用结合垫处理液浸泡玻璃纤维素膜10min，浸泡处理后，置于干燥间37℃湿度30％，烘干3h，制得结合垫，备用；

(4)将1mg的200nm聚苯乙烯荧光微球先后加入20μL的0.5mg/mL的EDC和0.5mg/mL的NHS，在活化缓冲液37℃活化1h；

(5)加入0.1mgC反应蛋白一抗(鼠源C反应蛋白单克隆抗体)，在200μL偶联缓冲液中与荧光微球偶联，完毕后加入封闭液20μL，制得C反应蛋白一抗-荧光微球偶联物，18000rpm离心15min后，加入200μL储存液，制得C反应蛋白一抗-荧光微球偶联物浓度为5mg/mL，2～8℃保存；

(6)用储存液将C反应蛋白一抗-荧光微球偶联物稀释到0.5mg/mL，用喷金划膜仪喷于经结合垫处理液处理后的结合垫上，用鼓风干燥箱干燥7h。铝箔袋密封置于20-25℃、湿度约30％的条件下存放备用；

(7)将1mg/mLC反应蛋白二抗(羊抗鼠IgG多克隆抗体)和1mg/mLC反应蛋白一抗分别用包被液包被，以条带状1.0mm用喷金划膜仪分别固定于硝酸纤维素膜上分别作为质控线和检测线；

(8)在PVC底板上依次搭接地粘贴：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水滤纸，并剪切成宽度4.1mm即成为C反应蛋白免疫荧光定量试纸条；

(9)将切好的试纸条装卡，过压壳机，准备检测；

(10)样品垫处理液：100mMPBS、1％Triton、0.75％BSA、0.5％PVA、0.9％NaCl、0.3％葡聚糖、0.05％Proclin300，pH7.8；

(11)结合垫处理液：2％Tween-80、1.5％PVA、0.5％BSA、1％海藻糖，PH7.05-7.10；

(12)活化缓冲液为75mM MES，pH5.5；

(13)偶联缓冲液：20mM PB，pH7.5；

(14)封闭液：20％BSA；

(15)包被液：20mMPBS，1.2％异丙醇、0.4％葡聚糖20000、1.5％BSA、0.5％Tween-80、0.03％Proclin300，pH7.0。

实施例2

将实施例1制备的C反应蛋白免疫荧光定量试纸条建立标准曲线并进行检测，实施方法如下：

(1)建立标准曲线：用国际临床化学联合会(IFCC)C反应蛋白标准品浓度为41.2mg/L稀释至5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、800ng/mL、1000ng/mL八个浓度。用制备好的试纸条加样80μL上免疫荧光分析以检测，每个浓度重复3次取平均值。以检测线所出的T峰面积和质控线所出的C峰面积的比值为纵坐标，标准品理论值为横坐标。

标准曲线如图1所示；y＝0.0174x+0.0785，R²＝0.9933，用该方程可计算样品中的C反应蛋白含量，实现定量，且相关性好。

(2)样品检测：用抗原稀释液对C反应蛋白重组抗原倍比稀释至5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、160ng/mL、320ng/mL、640ng/mL八个浓度。抗原稀释液：20mMPBS，0.5％BSA，0.5％Tween-20，PH7.2；将求得T/C峰面代入y＝0.0174x+0.0785中Y，求得X为所测抗原值，

如图2所示，可以看出实施例2制备的试纸条检测值与理论值偏差小(R²＝0.996)，检测的准确率高。

实施例3

配制对照储存液，具体配方为：PB的质量浓度为50mM、BSA的百分浓度为1％、Tween-80的百分浓度为1％，葡萄糖的百分浓度为1％、甘氨酸的百分浓度为0.5％、PEG4000的百分浓度为2％、Proclin300百分浓度为0.3％。

采用实施例1制备的优选储存液(以下简称储存液2)与对照储存液(以下简称储存液1)进行助稳性能和精密度对比，实施方法和结果如下：

用储存液1和储存液2，对相同工艺标记的C反应蛋白(CRP)一抗-荧光微球进行喷膜干燥，分别组装成40个试纸条，放铝箔袋、干燥剂封口。一袋放置冰箱4℃保存7天(对照组)，另外一袋放置温箱37℃加速7天。完整7天后，取出卡条，分别加入浓度为5ng/mL和50ng/mL的CRP重组抗原检测。根据理论37℃加速7天相当于4℃保存1年，模拟1年后的抗原检测情况，结果如下表1、表2所示。

表1、2种储存液制得的试纸条测试5ng/mL CRP重组抗原的效果对比

表2、2种储存液制得的试纸条测试50ng/mL CRP重组抗原的效果对比

从表1、2得出，优选的储存液2制备的试纸条在37℃加速七天后，检测值下降比例小于8％，且精密度较好；而对照储存液1制备的试纸条在37℃加速七天后，检测值下降30％以上，精密度相对较差。

实施例4

用储存液1和储存液2(同实施例3)，对相同工艺标记的C反应蛋白一抗-荧光微球进行喷膜干燥，组装好试纸条，分别用浓度为2mg/mL、5mg/mL、16mg/mL、34mg/mL、184mg/mL的含C反应蛋白的芬兰ORION DIAGNOSTICA QuikRead CRP赋值的病人全血样本对两种试纸条加样检测，随后用配套检测仪器对试纸条窗口信息进行读取。通过仪器激光对窗口的荧光微球进行激发，再采集窗口300个位置(作横坐标)的发射荧光强度(作纵坐标)，利用荧光分析软件将300个点按顺序连在一起形成折线图。

如图3所示，折线图可反映荧光微球在NC膜上的跑膜情况，图中有两个峰，左边为T峰(对应肉眼视卡条为检测线)，右边为C峰(对应肉眼视卡条为质控线)，使用储存液2的整体出峰效果较好，说明储存液2对抗体-荧光微球偶联物从结合垫释放到NC膜效果较好。使用储存液1的则出峰信号不高，基线不平整，前段抬起较明显，影响软件对峰面积的计算，进而影响读值的准确度。

实施例6

用储存液1和储存液2(同实施例3)，对相同工艺标记的C反应蛋白一抗-荧光微球进行喷膜干燥，分别组装15个试纸条，用15个不同浓度的含C反应蛋白抗原的病人全血样本同时对两种试纸条加样检测。由于C反应蛋白在病人样本浓度较大，本实施例稀释200倍检测。用配套检测仪器对试纸条窗口信息进行读取，用荧光分析软件计算T峰面积与C峰面积，同时用该项目准确度较高的芬兰ORION DIAGNOSTICA的QuikRead CRP(POCT免疫比浊仪)检测的结果值。

以QuikRead CRP评价2种储存液制备的试纸条检测结果的临床诊断准确性。如图4所示，纵坐标为T峰面积/C峰面积，横坐标QuikRead CRP结果值，储存液2制备的试纸条检测结果与芬兰ORION DIAGNOSTICA的QuikRead CRP仪器检测结果较吻合(R²＝0.981)，而储存液1的全血线性相关较差(R²＝0.873)，重复性也不好。这与前述储存液2让抗体-荧光微球释放效果更好，软件计算面积更加准确有关。