本发明属于药品食品安全及家蚕养殖领域，尤其涉及一种检测受污染桑叶毒性和安全性的方法。
背景技术：
桑树是多年生木本植物，桑叶营养丰富，干物质中约含粗蛋白24％-28％、总糖23％-26％、粗脂肪3.5％-6.0％，富含食物纤维、氨基酸、维生素和多种动物和人体必须的微量元素，含生物碱、黄酮等活性成分。桑叶是家蚕的唯一植物饲料，是蚕茧生产的基础；桑叶也可作为禽畜动物饲料。卫生部将桑叶列为既是食品又是药品。桑叶是中药材，含1-脱氧野尻霉素(DNJ)等生物碱、黄酮等活性成分，有降血糖、降血脂和降血压等药效。桑叶可制作桑叶菜，具有清香、鲜脆、色泽碧绿的特点，是具有较高营养价值和保健功能的绿色蔬菜；桑叶可制作桑叶茶，茶汤清澈明亮，清香甘甜，鲜醇爽口，对降血糖、消疮祛斑、减肥清脂、降低血粘有一定效果；桑叶粉还可制作桑叶面条、桑叶饼等，作为糖尿病等特殊人群的食品。
桑园及附近农作物使用化学农药，会使桑叶受污染而含有农药残毒；白僵菌农药、苏云金杆菌农药、核型多角体病毒等昆虫病原菌(真菌、细菌、病毒)制剂等生物农药，桑粉虱、桑螟等桑园害虫会发生家蚕同样的病，患病昆虫尸体、排泄物、鳞毛等污染桑叶，均会成为蚕病暴发的传染来源；桑叶受病原真菌为害，使桑叶受真菌污染，有的真菌及其次生产物含有真菌毒素；工厂废气污染大气，硫化物、氟化物等被桑叶吸附累积，使桑叶受到毒物污染，给桑叶利用带来不安全因素。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种简便快速、结果可靠、综合全面、灵敏准确的检测受污染桑叶毒性和安全性的方法，适用于受污染桑叶作为饲料对家蚕健康危害和养殖风险评估。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
检测受污染桑叶毒性和安全性的方法，通过桑叶养蚕试验，利用测试桑叶饲养健康家蚕幼虫，根据蚕的行动、体态、食桑、排便、吐丝、化蛹、化蛾、交配、产卵、皮肤、生长发育方面差异，以及死亡率、幼虫成蛹率、幼虫成蛾率、正常产卵蛾率、良卵率指标，测试一般毒性、神经毒性、器官毒性、发育毒性、生殖毒性及病原微生物致病性。
上述检测受污染桑叶毒性和安全性的方法，包括以下步骤：
(1)准备健康的试验蚕；(2)采摘测试桑叶分区养蚕；(3)调查观察蚕的健康状况；
(4)一般毒性测试；(5)神经毒性测试；(6)器官毒性测试；(7)发育毒性测试；
(8)生殖毒性测试；(9)病原微生物致病性测试；(10)测试桑叶作为家蚕饲料的安全性综合评价。
步骤(1)按以下操作进行：选用合格蚕种，按常规养蚕操作与消毒防病措施，对所用试验蚕室和用具进行消毒、蚕种催青、小蚕饲养；1龄～2龄小蚕用正常桑叶饲养，饲育温度27℃-28℃，相对湿度85％-90％、长日照；用2龄～4龄任一龄起蚕作为受试蚕，设置处理区，包括测试桑叶饲养区、正常桑叶饲养区，每处理区三重复小区，每小区供试蚕为同头数20头以上。
步骤(2)按以下操作进行：采摘指定的测试桑叶和正常桑叶用于相应的处理区中试验蚕的饲养；按同样环境条件和养蚕操作，温度25℃-27℃，相对湿度75％-85％、自然光照，饲养至上蔟结茧。
步骤(3)按以下操作进行：观察比较测试桑叶饲养区与正常桑叶饲养区蚕儿在体态、行动、食桑、排便、蜕皮、吐丝、化蛹、化蛾、交配、产卵、皮肤、肛门方面的差别，调查统计死亡率、健蛹率、结茧率、幼虫成蛹率、幼虫成蛾率、正常产卵蛾率、良卵率指标。
步骤(4)至(7)按以下操作进行：
(4)一般毒性测试
出现吐液、拒食、体缩、摆头、身体扭曲、呆伏不动、喂叶无反应或死亡症状的，且死亡率测试桑叶饲养区显著高于对照区的，或健蚕率、幼虫成蛹率测试桑叶饲养区显著低于对照区的，诊断所测试桑叶有一般毒性；
(5)神经毒性测试
出现狂燥、乱爬、吐乱丝、旋蛹行为等神经异常症状，且死亡率测试桑叶饲养区显著高于对照区的，或健蚕率、幼虫成蛹率、幼虫成蛾率测试桑叶饲养区显著低于对照区的，诊断所测试桑叶有神经毒性；
(6)器官毒性测试
体壁出现灰黑色斑或烧焦状斑、不脱皮蚕、半脱皮蚕、半脱皮蛹体壁损伤；中肠或肛门损伤而出现脱肛、排稀粪、念珠粪等异常，为器官损伤的表现；出现器官损伤症状，且死亡率测试桑叶饲养区显著高于对照区的，或健蚕率、幼虫成蛹率、幼虫成蛾率测试桑叶饲养区显著低于对照区的，诊断所测试桑叶有器官毒性
(7)发育毒性测试
出现不眠蚕、不脱皮蚕及不结茧、不化蛹、不羽化、不产卵等发育异常，且死亡率测试桑叶饲养区显著高于对照区的，或健蚕率、幼虫成蛹率、幼虫成蛾率测试桑叶饲养区显著低于对照区的，诊断所测试桑叶有发育毒性。
步骤(8)生殖毒性测试，按以下操作进行：
(8.1)结茧后常规保护至蚕蛹羽化，化蛾当天早上同试验小区雌蛾与雄蛾交配，交配时间5h-6h，拆对后振动雌蛾排尿，投入产卵纸袋内单蛾产卵制种，次日上午8：00杀蛾终止产卵，蚕种常规保护7天至蚕卵成固定色；
(8.2)调查不产卵蛾、少产卵蛾、受精异常蛾非正常产卵蛾的数量，计算非正常产卵蛾率；调查正常产卵蛾的单蛾产卵数和良卵数，计算良卵率；
(8.3)非正常产卵蛾率，测试桑叶饲养区显著高于对照区的；或良卵率，测试桑叶饲养区显著低于对照区的的，诊断所测试桑叶有生殖毒性。
步骤(9)病原微生物致病性测试，按以下操作进行：
(9.1)测试桑叶饲养区与对照区分室隔离饲养，分别由不同饲养员采叶饲养，防止交叉传染蚕病；
(9.2)每4h～6h观察一次，发现有病蚕、死蚕及时拾到另外的饲养框隔离，防止二次感染；
(9.3)对病蚕、死蚕进行传染性蚕病种类的诊断，统计记录各类蚕病的病死头数，统计各类蚕病的发病率；
(9.4)出现某蚕病症状，且发病率测试桑叶饲养区显著高于对照区的，诊断所测试桑叶有病原微生物致病性。
步骤(10)测试桑叶作为家蚕饲料的安全性综合评价，按以下操作进行：
(10.1)经测试一般毒性、神经毒性、器官毒性、发育毒性、病原微生物致病性，如没有1项有毒性，则测试桑叶用于养蚕产茧是安全的；如有1项或多项有毒性，则测试桑叶用于养蚕产茧是不安全的；
(10.2)经测试一般毒性、神经毒性、器官毒性、发育毒性、病原微生物致病性、生殖毒性，如没有1项有毒性，则测试桑叶用于种茧育养蚕和制种是安全的；如有1项或多项有毒性，则测试桑叶用于种茧育养蚕和制种是不安全的。
针对利用受污染桑叶存在的安全性问题，发明人建立了一种检测受污染桑叶毒性和安全性的方法，通过桑叶养蚕试验，利用测试桑叶饲养健康家蚕幼虫，根据蚕的行动、体态、食桑、排便、吐丝、化蛹、化蛾、交配、产卵、皮肤、生长发育方面差异，以及死亡率、幼虫成蛹率、幼虫成蛾率、正常产卵蛾率、良卵率指标，测试一般毒性、神经毒性、器官毒性、发育毒性、生殖毒性及病原微生物致病性。与一般的检测方法相比，本发明更为简便快速、结果可靠、综合全面、灵敏准确，具有较高的实用价值。应用本发明获得的毒性和安全性评价结果，可供桑叶作为禽畜饲料安全性评价参考，和供桑叶作为食用、药用品的安全性评价参考，用于受污染桑叶作为饲料对家蚕健康危害和养殖风险评估。因此，本发明利用桑叶养蚕生物试验，测定毒性和评价安全性，技术路线可行，应用前景广阔。
具体实施方式
一、本发明检测受污染桑叶毒性和安全性的方法的基本步骤和操作方法
(1)准备健康的试验蚕
选用当地推广应用的合格蚕种，按常规养蚕操作与消毒防病措施，对所用试验蚕室和用具进行消毒、蚕种催青、小蚕饲养；1龄～2龄小蚕用正常桑叶饲养，饲育温度27℃-28℃，相对湿度85％-90％、长日照(每天光照时间16h)；用2龄～4龄任一龄起蚕作为受试蚕，设置处理区，包括测试桑叶饲养区、正常桑叶饲养区(对照区)，每处理区三重复小区，每小区供试蚕为同等头数20头以上。
(2)采摘测试桑叶分区养蚕
采摘指定的测试桑叶和正常桑叶(对照)用于相应的处理区中试验蚕的饲养；按同样环境条件和养蚕操作，温度25℃-27℃，相对湿度75％-85％、自然光照，饲养至上蔟结茧。(3)调查观察蚕的健康状况
观察比较测试桑叶饲养区与正常桑叶饲养区蚕儿在体态、行动、食桑、排便、蜕皮、吐丝、化蛹、化蛾、交配、产卵、皮肤、肛门等方面的差别，调查统计死亡率、健蛹率、结茧率、幼虫成蛹率、幼虫成蛾率、正常产卵蛾率、良卵率等指标。
(4)一般毒性测试
出现吐液、拒食、体缩、摆头、身体扭曲、呆伏不动、喂叶无反应或死亡症状的，且死亡率测试桑叶饲养区显著高于对照区的(p＜0.05)，或健蚕率、幼虫成蛹率测试桑叶饲养区显著低于对照区的(p＜0.05)，诊断所测试桑叶有一般毒性；
(5)神经毒性测试
出现狂燥、乱爬、吐乱丝、旋蛹等行为的神经异常症状，且死亡率测试桑叶饲养区显著高于对照区的(p＜0.05)，或健蚕率、幼虫成蛹率、幼虫成蛾率测试桑叶饲养区显著低于对照区的(p＜0.05)，诊断所测试桑叶有神经毒性；
(6)器官毒性测试
体壁出现灰黑色斑或烧焦状斑、不脱皮蚕、半脱皮蚕、半脱皮蛹等体壁损伤；中肠或肛门损伤而出现脱肛、排稀粪、念珠粪等异常，为器官损伤的表现；出现器官损伤症状，且死亡率测试桑叶饲养区显著高于对照区的(p＜0.05)，或健蚕率、幼虫成蛹率、幼虫成蛾率测试桑叶饲养区显著低于对照区的(p＜0.05)，诊断所测试桑叶有器官毒性
(7)发育毒性测试
出现不眠蚕、不脱皮蚕及不结茧、不化蛹、不羽化、不产卵等发育异常，且死亡率测试桑叶饲养区显著高于对照区的(p＜0.05)，或健蚕率、幼虫成蛹率、幼虫成蛾率测试桑叶饲养区显著低于对照区的(p＜0.05)，诊断所测试桑叶有发育毒性。
(8)生殖毒性测试
(8.1)结茧后常规保护至蚕蛹羽化，化蛾当天早上同试验小区雌蛾与雄蛾交配，交配时间5h-6h，拆对后振动雌蛾排尿，投入产卵纸袋内单蛾产卵制种，次日上午8：00杀蛾终止产卵，蚕种常规保护7天至蚕卵成固定色；
(8.2)调查不产卵蛾、少产卵蛾(产卵数少于120粒的蚕蛾或少于该品种正常产卵数30％的蚕蛾)、受精异常蛾(所产蚕卵80％以上是不受精卵等)等非正常产卵蛾的数量，计算非正常产卵蛾率(即非正常产卵蛾数占总参试雌蛾数的比率)；调查正常产卵蛾的单蛾产卵数和良卵数，计算良卵率；
(8.3)非正常产卵蛾率，测试桑叶饲养区显著高于对照区的(p＜0.05)；或良卵率，测试桑叶饲养区显著低于对照区的(p＜0.05)的，诊断所测试桑叶有生殖毒性。
(9)病原微生物致病性测试
(9.1)测试桑叶饲养区与对照区分室隔离饲养，分别由不同饲养员采叶饲养，防止交叉传染蚕病；
(9.2)每4h～6h观察一次，发现有病蚕、死蚕及时拾到另外的饲养框(盘)隔离，防止二次感染；
(9.3)对病蚕、死蚕进行传染性蚕病种类的诊断，统计记录各类蚕病的病死头数，统计各类蚕病的发病率；
(9.4)出现某蚕病症状，且发病率测试桑叶饲养区显著高于对照区的(p＜0.05)，诊断所测试桑叶有病原微生物致病性。
(10)测试桑叶作为家蚕饲料的安全性综合评价
(10.1)经测试一般毒性、神经毒性、器官毒性、发育毒性、病原微生物致病性，如没有1项有毒性，则测试桑叶用于养蚕产茧是安全的；如有1项或多项有毒性，则测试桑叶用于养蚕产茧是不安全的；
(10.2)经测试一般毒性、神经毒性、器官毒性、发育毒性、病原微生物致病性、生殖毒性，如没有1项有毒性，则测试桑叶用于种茧育养蚕和制种是安全的；如有1项或多项有毒性，则测试桑叶用于种茧育养蚕和制种是不安全的。
二、本发明检测受污染桑叶毒性和安全性的方法的应用实例
以下各例基本步骤和操作方法参考一进行。
应用例1带毒复混肥施用桑园的桑叶的毒性和安全性评价
某养蚕村新推某品牌复混肥(简称A肥料)，A肥料为合格产品，有“肥料登记证”、“生产许可证”、“产品合格证”等证件，肥料厂宣传A肥料营养齐全、肥效稳定，增产明显，抗虫力强。上半年5月中旬该村50％桑园施用该肥料。该村5月下旬至7月下旬饲养的3批蚕，部分养蚕户的蚕发生中毒，生产受到损失。养蚕户怀疑A肥料可能是药肥，肥料中可能含有毒物(杀虫剂)，施到桑园使桑叶污染带毒。但肥料厂否认A肥料含有毒物。抽样A肥料进行农药残留检测，没有检出常用农药成分。
该村桑园7月下旬全部夏伐，统一在距地面10cm～20cm处剪伐，并进行桑园除草、清园和施肥，停止使用A肥料。
材料与方法：为测试下半年桑叶是否有毒，9月中下旬对该村3地块桑园的桑叶测试毒性。3地块桑园代号为：A1桑园、A2桑园、CK桑园。其中，A1桑园、A2桑园上半年使用A肥料，发生过养蚕中毒；CK桑园上半年没有使用A肥料，养蚕没有出现中毒现象。设置处理区：A1桑园桑叶饲养区、A2桑园桑叶饲养区、CK桑园桑叶饲养区，每处理区养蚕3小区(即重复3区)，每个小区50头蚕。供试蚕为：家蚕“7532”品种的原蚕3龄起蚕，蚕室温度25℃-27℃，相对温度75％-85％，自然光照。连续用测试桑叶饲养13天至五龄熟蚕期，分小区上蔟结茧，调查记录各龄期死亡头数，上蔟后第7天调查茧中死亡头数。
结果(表1)：A1桑园桑叶饲养区从第2天开始陆续出现中毒症状，A2桑园桑叶饲养区从第5天起出现中毒症状。中毒症状表现：吐液、拒食、体缩、摆头、身体扭曲、死亡、痉挛、乱爬，死后尸体呈C形、扭曲、直线形、S形多种形状。3龄起蚕至上蔟后第7天累计死亡率，A1桑园桑叶饲养区达55.33％，极显著高于正常桑园桑叶饲养区；A2桑园桑叶饲养区达18.67％，极显著高于正常桑园桑叶饲养区。
结论：到9月中下旬，A1桑园、A2桑园的桑叶有一般毒性和神经毒性，用于养蚕是不安全的。
表1用测试桑叶养蚕的死亡情况
应用例2桑粉虱重度为害桑叶的毒性和安全性评价。
某年6月，有一桑园受到桑粉虱严重为害，叶背密密麻麻布满桑粉虱的若虫(幼虫)。为测定桑粉虱危害桑叶的毒性与致病性，测试如下：
材料与方法：采摘桑粉虱为害较重、叶背灰白点较多的第9叶位叶片(重度为害叶，每cm2有8个以上桑粉虱若虫或尸体)来测试；供试蚕：蚕品种“7532×932”，常规饲养致3龄起蚕。处理区设置：桑粉虱重度为害叶区和正常桑叶区(对照区)，各在一间蚕室饲养，防止相互传染。各处理区养蚕3小区(重复3小区)，每小区30头蚕。3龄起蚕后喂桑粉虱为害桑叶至4龄末期(共8天)。
结果：桑粉虱重度为害叶区喂叶后经36h后蚕体即有病斑出现，48h后几乎100％蚕的身体有病斑，其中80％的蚕的足部有黑斑点。当龄有90％蚕不能入眠而死亡，少数入眠能蜕皮的，继续喂粉虱为害叶又会重新长出病斑，于4龄末死亡。累计死亡率100％。正常桑叶区(对照区)死亡率为0。桑粉虱为害叶区的蚕尸体，拾在垫有湿滤纸的培养皿，继续观察：在死后5h，100％的尸体僵硬，2天后尸体表面布满白色菌丝，死后4d-5d尸体表面布满灰色的粉末。经诊断，死蚕为家蚕灰僵病而致死。
结论：桑粉虱为害叶具有器官毒性，蚕体接触后会出现黑色病斑，影响眠蚕蜕皮；具有家蚕灰僵病的致病性；用桑粉虱为害叶养蚕是不安全的。
应用例3桑树赤锈病为害桑叶的毒性与安全性评价
桑树赤锈病(Aecidium mori Barclay)，又称赤粉病、金桑、金叶，是桑树常见的真菌病害，主要为害桑树新梢的嫩芽、叶片及桑花、椹。桑叶染病后，会出现点状分布的壶状锈孢子器，从锈孢子器中喷出鲜橙黄色粉状的锈孢子布满桑叶。
为评价被赤锈病菌物及其次生产物污染的桑叶的毒性和安全性，进行测试如下：
材料与方法：供试蚕：蚕品种为两广二号，按常规饲养至3龄起蚕。设处理区：赤锈病重度为害叶饲养区、正常叶饲养区(对照区)，各处理区饲养3小区(3重复小区)，每小区50头蚕。从3龄起蚕开始，连续用测试叶饲养至结茧。按《桑蚕丝茧育养蚕技术规程》(DB45/T87-2003)的环境条件和要求进行养蚕和蚕茧保护，蛹期、蛾期、卵期的保护温度为24℃-26℃、相对湿度75％-85％。
调查项目：(1)蚕食桑、爬行、吐丝结茧活动情况；(2)蚕体壁、中肠、口器等器官情况；(3)蚕生长发育、眠蚕、熟蚕、结茧、化蛹、化蛾情况；(4)调查不眠蚕、不脱皮蚕、不吐丝结茧蚕、不化蛹蚕等发育异常蚕；(5)调查不产卵蛾、少产卵蛾(产卵数＜120粒的蚕蛾，或产卵数＜该品种正常产卵数30％的蚕蛾)、受精异常蛾(所产蚕卵20％以上是不受精卵)等非正常产卵蛾的数量，计算非正常产卵蛾率(即非正常产卵蛾数占总参试雌蛾数的比率)；调查正常产卵蛾的单蛾产卵数和良卵数，计算良卵率；(6)调查传染性蚕病发生情况
结果(表2)与评价：
(1)赤锈病重度为害叶区没有出现吐液、拒食、体缩、摆头、身体扭曲等家蚕急性中毒症状，健蚕率为100％、结茧率100％、死笼率为0，3龄蚕虫蛹率100％、3龄蚕成蛾率极高97.33％，且高于对照区(正常叶)，诊断：赤锈病重度为害叶区没有一般毒性；
(2)赤锈病重度为害叶区蚕儿没有出现呆伏不动、喂叶无反应或狂燥、乱爬、乱吐丝、旋蛹等神经异常蚕，诊断：赤锈病重度为害叶区没有神经毒性；
(3)赤锈病重度为害叶区蚕体壁没有异常病斑、排便正常、吐丝正常、眠起脱皮正常、化蛹正常，表明赤锈病重度为害叶区没有器官毒性；
(4)赤锈病重度为害叶区没有出现不眠蚕、不脱皮蚕、不吐丝结茧蚕、不化蛹蚕等发育异常蚕，3龄蚕成蛹率100％，3龄蚕成蛾率高达97.33％，且高于对照区，诊断：赤锈病重度为害叶没有发育毒性；
(5)赤锈病重度为害叶区非正常产卵蛾率仅为6.67％，且低于对照区；单蛾良卵率高达99.66％，高于对照区，诊断：赤锈病重度为害叶没有生殖毒性；
(6)赤锈病重度为害叶区健蚕率、3龄蚕成蛹率100％，没有出现病死蚕，诊断：赤锈病重度为害叶没有病原微生物致病性。
结论：赤锈病重度为害叶养蚕没有毒性和病原微生物的致病性，是安全的。
表2赤锈病重度为害叶养蚕的生命力和生殖力