研究血管性痴呆发生过程中线粒体能量代谢障碍及人参皂苷Re作用的实验方法与流程

本发明涉及一种研究血管性痴呆发生过程中线粒体能量代谢障碍及人参皂苷re作用的实验方法。

背景技术：

血管性痴呆(vasculardementia，vd)是指由缺血性卒中、出血性卒中和造成记忆、认知和行为等脑区低灌注的脑血管疾病所致的严重认知功能障碍综合征。是继阿尔茨海默病(alzheimer’sdisease，ad)之后第二常见的痴呆类型，同时也是老年人中最常见的痴呆类型，目前全世界约有30％的痴呆患者为血管性痴呆患者，一项近期的调查显示我国血管性痴呆的患病率约为0.8％。有丹麦学者统计，每个血管性痴呆病人平均每年要花费约合14000美元用于治疗及日常照料。目前人们用于血管性痴呆病人的治疗及日常照料的花费已高于其他任何一种痴呆类型，而血管性痴呆病人的数量在高于65岁的老年人中仍在成倍的增加。随着我国进入老龄化社会，血管性痴呆将成为我们所要面临的重要的公共卫生问题。

由于人们至今对vd的发病机制尚不明确，临床上仅能针对症状进行相应的治疗，不能阻止或逆转疾病进程。为了能够更好地治疗及预防血管性痴呆，近年学者们围绕着vd的发病原因，发病机制进行了深入的研究，线粒体(mitochondria，mito)功能障碍在血管性痴呆发病中所起的作用受到越来越多的关注。线粒体是一种广泛分布于真核细胞内的细胞器，其参与细胞内自由基形成、细胞内离子跨膜转运和细胞凋亡等过程，但其最为重要的功能是进行adp氧化磷酸化，生成atp，为细胞提供生物动能。

线粒体是糖、脂肪和氨基酸最终氧化磷酸化释放能量的场所。通过线粒体内的nadh(还原型辅酶i)氧化呼吸链和琥珀酸氧化呼吸链/fadh2(还原型黄素腺嘌呤二核苷酸)氧化呼吸链2条电子传递链(electrontransportchain，etc)的传递作用，线粒体内营养物质代谢所产生的成对氢原子(2h)与机体吸入的氧结合生成水。呼吸链在传递氢的过程中偶联氧化磷酸化，在atp酶的作用下将adp合成atp为机体组织提供基本代谢所需要的能量。线粒体的上述产能过程是通过一系列复杂的酶促反应完成的，当相关酶促反应不能正常进行时，线粒体不能有效合成atp，呼吸链电子传递过程中所产生的副产物氧自由基蓄积，线粒体耗氧下降，不能为组织提供足够的能量，机体组织就会供能不足，出现相应功能障碍。

细胞生命活动所需能量90％以上由线粒体氧化磷酸化提供。大脑作为思想行为中枢对氧的需求非常大。尽管大脑的重量只占身体总重量的2％，但氧的消耗却占20％。线粒体功能的改变直接影响神经细胞的功能。线粒体功能正常与否，是决定细胞生存或死亡的关键因素。

vd目前临床治疗效果不甚理想，西药治疗主要是应用胆碱酯酶抑制剂及促进脑代谢药物等，而在中医学上，vd属于神志疾病，中医药在防治痴呆方面有独特的经验。人参是我国传统的名贵中药，属五加科草本植物，素有“百草药王”之美称，主要产于吉林省长白山一带，是我国“东北三宝”之一，具有广泛的药理作用。从人参中分离出的人参皂苷re被认为是人参促智和延缓衰老作用的主要有效成分，其中re含量较高，是人参的一种活性成分，有报道显示，人参皂苷re对自然衰老大鼠的学习记忆障碍有改善所用。

技术实现要素：

本发明的目的在于本研究通过进行一系列的体内及体外试验研究血管性痴呆发生发展过程中的线粒体能量代谢障碍及人参皂苷re的神经保护作用，实验方法简单，效果好，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种研究血管性痴呆发生过程中线粒体能量代谢障碍及人参皂苷re作用的实验方法，该方法包括以下步骤：

s1：选取健康雄性wistar大鼠作为实验对象，随机分为假手术组、模型组及人参皂苷re低(5mg/kg)、中(10mg/kg)、高(20mg/kg)剂量组，采用双侧颈总动脉分次结扎方法制备血管性痴呆大鼠模型，并利用morris水迷宫定位航行试验训练检查大鼠的行为及记忆功能，结果示手术造模组大鼠逃避潜伏期明显较假手术组长，表明大鼠学习记忆能力下降，证明模型制备成功；

根据分组情况，分别给予大鼠低、中、高低剂量人参皂苷re，与模型组及假手术组大鼠再次进行morris水迷宫测试；

s2：电镜下观察各组大鼠海马组织学及超微结构的变化，结果进一步证明血管性痴呆大鼠模型建立可靠，通过组间比较结果提示人参皂苷re可减轻血管性痴呆大鼠海马缺血损伤程度；

s3：应用westernblot法测定线粒体代谢过程中的关键酶亚基蛋白表达：即细胞色素c氧化酶iv亚基蛋白表达及丙酮酸脱氢酶a1亚基蛋白表达；

s4：应用荧光光度计技术检测大鼠海马线粒体呼吸态4h2o2产率。

与现有技术相比，本发明的研究血管性痴呆发生过程中线粒体能量代谢障碍及人参皂苷re作用的实验方法具有以下优点：

采用本方法可以表明，缺血致血管性痴呆模型大鼠存在海马线粒体代谢过程中的关键酶亚基蛋白即细胞色素c氧化酶iv亚基蛋白表达及丙酮酸脱氢酶a1亚基蛋白表达下降。提示海马线粒体代谢过程中的关键酶亚基蛋白即细胞色素c氧化酶iv亚基蛋白表达及丙酮酸脱氢酶a1亚基蛋白表达下降参与了血管性痴呆的发生发展过程。而人参皂苷re在一定时间和浓度下具有改善血管性痴呆大鼠海马线粒体代谢过程中关键酶亚基蛋白表达下降的作用，提示人参皂苷re对血管性痴呆大鼠海马线粒体具有一定的保护作用。本方法简单，实验效果突出。

通过本实验研究发现线粒体呼吸功能障碍参与了血管性痴呆的发生发展过程，线粒体生物动能机制是血管性痴呆的发病机制之一。同时证明人参皂苷re对血管性痴呆大鼠海马线粒体具有保护和治疗作用。

附图说明

图1是本发明的电镜下观察假手术组的大鼠海马组织的he染色结果；

图2是是本发明的电镜下观察模型组的大鼠海马组织的he染色结果；

图3是本发明的电镜下观察低剂量组的大鼠海马组织的he染色结果；

图4是本发明的电镜下观察高剂量组的大鼠海马组织的he染色结果；

图5是本发明的电镜下观察假手术组的大鼠海马组织的超微结构的变化结果；

图6是本发明的电镜下观察模型组的大鼠海马组织的术后1个月超微结构的变化结果；

图7是本发明的电镜下观察模型组的大鼠海马组织的术后6个月超微结构的变化结果；

图8是本发明的电镜下观察高剂量组的大鼠海马组织的术后1个月超微结构的变化结果；

图9是本发明的电镜下观察高剂量组的大鼠海马组织的术后3个月超微结构的变化结果；

图10是本发明的电镜下观察高剂量组的大鼠海马组织的术后6个月超微结构的变化结果；

图11是本发明的电镜下观察各组的大鼠海马线粒体细胞色素c氧化酶iv亚基蛋白表达测定术后1个月的变化结果；

图12是本发明的电镜下观察各组的大鼠海马线粒体细胞色素c氧化酶iv亚基蛋白表达测定术后3个月的变化结果；

图13是本发明的电镜下观察各组的大鼠海马线粒体细胞色素c氧化酶iv亚基蛋白表达测定术后6个月的变化结果；

图14是本发明的电镜下观察各组的大鼠海马线粒体丙酮酸脱氢酶a1亚基蛋白表达测定术后1个月的变化结果；

图15是本发明的电镜下观察各组的大鼠海马线粒体丙酮酸脱氢酶a1亚基蛋白表达测定术后3个月的变化结果；

图16是本发明的电镜下观察各组的大鼠海马线粒体丙酮酸脱氢酶a1亚基蛋白表达测定术后6个月的变化结果；

图17是本发明的电镜下观察各组的大鼠海马线粒体呼吸态4h2o2产率结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。

一种研究血管性痴呆发生过程中线粒体能量代谢障碍及人参皂苷re作用的实验方法，对本发明作进一步详细、完整的描述。

1.选取健康雄性wistar大鼠作为实验对象，随机分为假手术组、模型组及人参皂苷re低(5mg/kg)、中(10mg/kg)、高(20mg/kg)剂量组，采用双侧颈总动脉分次结扎方法制备血管性痴呆大鼠模型，并利用morris水迷宫定位航行试验训练检查大鼠的行为及记忆功能，实验结果见下表。

各组逃避潜伏期比较(n＝6，s，)

注：与假手术组比较，**：p＜0.01；与模型组比较，*：p＜0.05

结果示手术造模组大鼠逃避潜伏期明显较假手术组长，表明大鼠学习记忆能力下降，证明模型制备成功。

根据分组情况，分别给予大鼠低、中、高低剂量人参皂苷re，与模型组及假手术组大鼠再次进行morris水迷宫测试，结果示不同浓度re组与模型组比较，潜伏期均明显缩小，其中以高剂量组为最好，与模型组相比均有显著性差异。

这些结果表明，人参皂苷re在一定时间和浓度下可提高vd大鼠的学习记忆能力。

2.分别参见图1-图4，图5-图10，电镜下观察各组大鼠海马组织学及超微结构的变化，结果进一步证明血管性痴呆大鼠模型建立可靠。通过组间比较结果提示人参皂苷re可减轻血管性痴呆大鼠海马缺血损伤程度。

图1是假手术组海马组织的he染色结果，结果表明：海马组织呈正常形态结构，细胞排列均匀整齐，呈条带状，神经细胞轮廓清晰，多呈圆形，细胞核位于细胞中央大而圆、着色较浅，核仁清晰。

图2是模型组海马组织的he染色结果，结果表明：术后1个月，神经细胞发生收缩，细胞体积变小，部分神经胶质细胞着色加深；术后3个月，细胞体积有所增加；术后6个月，细胞排列紊乱，间距加大，明显变性、坏死，呈三角形，胞质浓缩、深染，核固缩，核仁模糊，失去正常结构。

图3是低剂量组海马组织的he染色结果，结果表明：术后1个月，神经细胞和神经胶质细胞体积均有轻微增加；术后3个月，神经细胞体积继续增加，胶质细胞染色也开始变浅；术后6个月，部分神经细胞变性、坏死，锥体细胞核固缩成三角形蓝色质块，胞体皱缩呈梭形。

图4是高剂量组海马组织的he染色结果，结果表明：术后1个月和术后3个月：神经细胞和神经胶质细胞体积比模型组显著增大，细胞核染色浅，核仁清晰，同时神经胶质细胞的染色变浅；术后6个月：少部分神经细胞固缩，排列相对整齐，呈带状，多呈圆形，疏松的海马组织得以改善，呈回复趋势。

图5-图10是超微结构改变的结果。

参见图5，假手术组海马组织超微结构改变的结果表明：细胞核圆形、染色浅，无异染色质，细胞内核糖体多，线粒体呈卵圆形或杆状，数目尚可，分布均匀，内嵴尚清晰且排列尚可，嵴内腔未见扩张，基质均匀一致，未见线粒体肿胀及空泡变性，周边内质网正常，未见扩张；细胞核呈椭圆形，核膜清晰光滑，核仁清晰位于细胞核中间。

参见图6，模型组海马组织超微结构改变的结果表明：术后1个月，细胞核染色较浅，近核膜处偶见异染色质，细胞质内有大量核糖体，线粒体或局部空泡状，或整个线粒体呈空泡状，可见电子密度大的结构；海马内的毛细血管周围的神经胶质细胞处于严重水肿状态。

参见图7，模型组海马组织超微结构改变的结果表明：术后6个月，线粒体形态呈卵圆形，但其数目较少，且分布不均，内嵴大部分排列紊乱，部分可见内嵴溶解消失，基质疏松，线粒体肿胀明显且空泡变性；周边内质网扩张，变性，核仁消失，染色质边缘化，固缩。

参见图8，人参皂甙高剂量组术后1个月海马组织超微结构改变的结果表明：神经细胞核染色浅，少量异染色质位于核膜、或散在于细胞核中，线粒体较多、偶见空泡状；神经胶质细胞核染色浅、异染色质减少，核仁清晰，常染色质增加；毛细血管周围的线粒体仍然呈水肿状，但较模型组减轻。

参见图9，人参皂甙高剂量组术后3个月海马组织超微结构改变的结果表明：术后3个月神经细胞核染色浅，偶见异染色质，核仁清晰，线粒体多、偶见空泡化；毛细血管周围的神经胶质细胞有少量水肿，但较给药1个月时明显减轻。

参见图10，人参皂甙高剂量组术后6个月海马组织超微结构改变的结果表明：术后6个月线粒体形态、数目与假手术组线粒体无异，內嵴清晰且排列整齐，内质网正常；细胞核呈椭圆形，核膜清晰，但中心区染色质密度降低。

3.应用westernblot法测定线粒体代谢过程中的关键酶亚基蛋白表达：即细胞色素c氧化酶iv亚基蛋白表达及丙酮酸脱氢酶a1亚基蛋白表达。

(1)细胞色素c氧化酶iv亚基蛋白表达测定

图11-图13分别是各组大鼠术后1个月，术后3个月和术后6个月的海马线粒体细胞色素c氧化酶iv亚基蛋白表达测定结果，结果示造模组大鼠(即模型组、re高、中、低剂量组)较假手术组大鼠海马线粒体细胞色素c氧化酶iv亚基蛋白表达均明显下降，而不同剂量人参皂苷re组大鼠蛋白表达均高于模型组大鼠，尤以高剂量组最为明显，差异具有统计学意义。

(2)丙酮酸脱氢酶a1亚基蛋白表达测定

图14-图16是各组大鼠术后1个月，术后3个月和术后6个月的海马线粒体丙酮酸脱氢酶a1亚基蛋白表达测定结果，结果示造模组大鼠(即模型组、re高、中、低剂量组)较假手术组大鼠海马线粒体丙酮酸脱氢酶a1亚基蛋白表达均明显下降，而不同剂量人参皂苷re组大鼠蛋白表达均高于模型组大鼠，尤以高剂量组最为明显，差异具有统计学意义。

这些结果表明，缺血致血管性痴呆模型大鼠存在海马线粒体代谢过程中的关键酶亚基蛋白即细胞色素c氧化酶iv亚基蛋白表达及丙酮酸脱氢酶a1亚基蛋白表达下降。提示海马线粒体代谢过程中的关键酶亚基蛋白即细胞色素c氧化酶iv亚基蛋白表达及丙酮酸脱氢酶a1亚基蛋白表达下降参与了血管性痴呆的发生发展过程。而人参皂苷re在一定时间和浓度下具有改善血管性痴呆大鼠海马线粒体代谢过程中关键酶亚基蛋白表达下降的作用，提示人参皂苷re对血管性痴呆大鼠海马线粒体具有一定的保护作用。

4.应用荧光光度计技术检测大鼠海马线粒体呼吸态4h2o2产率。

图17是各组各组大鼠术后1个月，术后3个月和术后6个月的海马线粒体呼吸态4h2o2产率结果，结果示各月造模组大鼠(即模型组、re高、中、低剂量组)海马线粒体线粒体呼吸态4h2o2产率，均较同月假手术组增加，而各剂量re组大鼠4h2o2产率均低于模型组，尤以术后6个月中剂量组及高剂量组大鼠海马线粒体明显，差异具有统计学意义。

上述结果表明缺血致血管性痴呆模型大鼠存在海马线粒体呼吸态4h2o2产率增加。提示线粒体呼吸态4h2o2产率的增加参与了血管性痴呆的发生发展过程。而人参皂苷re在一定时间和浓度下具有减少血管性痴呆大鼠海马线粒体呼吸态4h2o2产率的作用，提示人参皂苷re对血管性痴呆大鼠海马线粒体具有一定的保护作用。

上述实验结果表明线粒体生物动能机制是血管性痴呆的发病机制之一。同时证明一定给药时间和浓度的人参皂苷re对血管性痴呆大鼠海马神经元具有保护和治疗作用。

上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下做出各种变化。