专利名称：20(S)—人参皂苷—Rg的制作方法
技术领域：
本发明涉及20(S)-人参皂苷Rg3在制备治疗或预防脑血管疾病的药物中的应用。具体涉及20(S)-人参皂苷Rg3可以通过增加脑血流、改善脑线粒体能量代谢以及改善血液流变性来治疗或预防脑血管疾病。
背景技术：
随着人口老龄化进程的加速以及生活方式的改变，脑血管疾病已成为一个全球性的健康问题，脑血管意外的死亡率在世界范围分别居第3位，极大的危害人民的健康。新型有效的防治脑血管病药物的开发已是临床亟需。
20(S)-人参皂苷Rg3是从人参中分离提取的四环三萜类人参二醇型皂苷单体。
20(S)-人参皂苷Rg3结构式(R-glu-o-glu；R1-OH；R2-CH3)人参皂苷Rg3具有抗肿瘤作用，见Iishi H，Tatsuta M，Baba M，et al.Inhibition byginsenoside Rg3of bombesin-enhanced peritoneal metastasis of intestinal adenocarcinomas inducedby azoxymethane in Wistar rats.Clin Exp Metastasis.1997，15(6)603-11及Mochizuki M，YooYC，Matsuzawa K，et al.Inhibitory effect of tumor metastasis in mice by saponins，ginsenoside-Rb2，20(R)-and 20(S)-ginsenoside-Rg3，of red ginseng.Biol Pharm Bull.1995，18(9)1197-202.。但关于20(S)-人参皂苷Rg3具有预防或治疗脑血管疾病的用途尚未见报道；本发明人通过大量的实验，发现20(S)-人参皂苷Rg3具有治疗或预防脑血管疾病的用途。
发明内容
本发明提供了20(S)-人参皂苷Rg3在制备治疗或预防脑血管疾病的药物中的应用。
本发明提供了20(S)-人参皂苷Rg3在制备治疗或预防缺血性脑中风的药物中的应用。
本发明提供了20(S)-人参皂苷Rg3在制备治疗或预防脑外伤的药物中的应用。
本发明提供了20(S)-人参皂苷Rg3通过增加脑血流、改善脑线粒体能量代谢以及改善血液流变性来治疗或预防脑血管疾病的药物中的应用。
本发明所述的20(S)-人参皂苷Rg3在用于上述任一用途时，其使用剂量范围为10mg～750mg/天，优选100mg～500mg/天。
本发明人通过下列试验证实了20(S)-人参皂苷Rg3具有治疗脑血管疾病的作用。
20(R)-人参皂苷Rg3、20(S)-人参皂苷Rg3由山东省天然药物工程技术研究中心药物化学研究室提供，经HPLC检测含量≥90％，对照品由山东省天然药物工程技术研究中心分析研究室提供。20(S)与20(R)人参皂苷Rg3按文献汤明辉，姜志宏，赵中振，等.HPLC法分离与检测20(S)-人参皂苷Rg3和20(R)-人参皂苷Rg3.中草药.2003，35(3)208～282.所述方法检测。20(R)-人参皂苷Rg3亦可购自中国药品生物制品检定所。
具体实施例方式
制备例120(S)-人参皂苷Rg3和20(R)-人参皂昔Rg3的制备以三七总皂苷(或人参总皂苷)为原料，加入50％的醋酸水溶液，70℃水浴加热6小时，冷却，加入5％碳酸钠溶液，溶液经正丁醇萃取，萃取物蒸干后，上硅胶柱，以氯仿-甲醇为洗脱剂，进行梯度洗脱，得到20(S)-人参皂苷Rg3和20(R)-人参皂苷Rg3的粗品，经反复硅胶柱层析，分别得到20(S)-人参皂苷Rg3和20(R)-人参皂苷Rg3。并按文献汤明辉，姜志宏，赵中振，等.HPLC法分离与检测20(S)-人参皂苷Rg3和20(R)-人参皂苷Rg3.中草药.2003，35(3)208～282.所述方法检测。
制备例2注射用20(S)-人参皂苷Rg3制剂制备称取0.50g 20(S)-人参皂苷Rg3，加入50g PEG-400，使皂苷溶解；配制50g pH5.5的磷酸盐缓冲液，称取0.02g亚硫酸氢钠加入到上述磷酸盐缓冲液中；将缓冲液加入到皂苷的PEG溶液中，混合均匀，加入0.01％针用活性炭100℃保温30分钟，G3垂熔玻璃漏斗过滤、0.22um的微孔滤膜过滤，过滤后的药液分装成2ml/支的针剂50支，分装好的注射剂可以直接压塞、压铝盖成针剂。
制备3注射用20(S)-人参皂苷Rg3冻干粉针制备称取0.50g 20(S)-人参皂苷Rg3，加入50g PEG-400，使皂苷溶解。配制50g pH5.5的磷酸盐缓冲液，称取0.02g亚硫酸氢钠加入到上述磷酸盐缓冲液中；将缓冲液加入到皂苷的PEG溶液中，混合均匀，加入0.01％针用活性炭100℃保温30分钟，G3垂熔玻璃漏斗过滤、0.22um的微孔滤膜过滤；过滤后的药液分装成2ml/支的西林瓶中，经冻干机冻干制成冻干粉针。
制备例4注射用20(R)-人参皂苷Rg3制剂制备称取0.50g 20(R)-人参皂苷Rg3，加入50g PEG-400，使皂苷溶解。配制50g pH5.5的磷酸盐缓冲液，称取0.02g亚硫酸氢钠加入到上述磷酸盐缓冲液中；将缓冲液加入到皂苷的PEG溶液中，混合均匀，加入0.01％针用活性炭100℃保温30分钟，G3垂熔玻璃漏斗过滤、0.22um的微孔滤膜过滤；过滤后的药液分装成2ml/支的西林瓶中，经冻干机冻干制成冻干粉针。
制备例520(S)-人参皂苷Rg3和20(R)-人参皂苷Rg3对照品制备以三七总皂苷(或人参皂苷)为原料，加入50％的醋酸水溶液，70℃水浴加热6小时，冷却，加入5％碳酸钠溶液，溶液经正丁醇萃取，萃取物蒸干后，上硅胶柱，以氯仿-甲醇为洗脱剂，进行梯度洗脱，得到20(S)-人参皂苷Rg3和20(R)-人参皂苷Rg3的粗品，经反复硅胶柱层析，分别得到20(S)-人参皂苷Rg3和20(R)-人参皂苷Rg3精品，然后反复重结晶，得到对照品。
试验例120(S)-人参皂苷Rg3对大鼠局部脑缺血损伤的影响(1)材料20(S)-人参皂苷Rg3注射剂按制备例2制备。
20(R)-人参皂苷Rg3注射剂按制备例4制备。
红四氮唑美国Sigma公司产品，临用前用生理盐水配成4％溶液。
实验动物SD大鼠，雄性，体重280g-350g，山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供。合格证号鲁动质字200106005号。
(2)方法与结果动物随机分为假手术组(等容量溶剂)，模型对照组(等容量溶剂)，尼莫地平组(Nim，1.5mg/kg)，20(R)-人参皂苷Rg310mg/kg组，20(S)-人参皂苷Rg31mg/kg组，20(S)-人参皂苷Rg35mg/kg组，20(S)-人参皂苷Rg310mg/kg组，20(S)-人参皂苷Rg320mg/kg组，20(S)-人参皂苷Rg350mg/kg组，20(S)-人参皂苷Rg375mg/kg组，每组10只。禁食12小时后，水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉，分离右侧颈总动脉，夹闭颈内、颈总动脉，颈外动脉近心端及远心端结扎，中间剪断。将颈外动脉游离端拉至与颈内动脉成一条直线，将栓线(选用直径0.24mm尼龙线，长度5.0cm)由颈外动脉插入至颅内，遇轻微阻力时停止，插入深度约为2cm。结扎颈外动脉开口，并打开颈总动脉动脉夹，消毒缝合伤口，造成右侧大脑中动脉缺血模型；假手术组仅进行右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉的分离(以上实验均在23℃～25℃进行)。术后各组动物静脉注射相应药物(给药体积1ml/200g)。24小时后按文献刘小光，徐理纳，一种能评价溶栓和抗溶栓的大鼠脑中动脉模型，药学学报，1995，30662所述方法及标准观察并记录大鼠的行为障碍(A)提鼠尾观察前肢屈曲情况，如双前肢对称伸向地面，计为0分，如手术对侧前肢出现腕屈曲计为1分，肘屈曲计为2分，肩内旋计为3分，既有腕屈曲和/或肘屈曲，又有肩内旋者，计为4分。(B)将动物置于平地面上，分别推双肩向对侧移动，检查阻力。如双侧阻力对等且有力，计为0分，如向手术对侧推动时阻力下降者，根据下降程度不同分为轻、中、重三度，分别计为1，2和3分。(C)将动物双前肢置一金属网上，观察双前肢的肌张力。双前肢肌张力对等且有力者计为0分。同样根据手术对侧肌张力下降程度不同计为1，2和3分。(D)动物有不停地向一侧转圈者，计为1分。根据标准评分，满分为11分，分数越高，表示动物行为障碍越严重。
行为评分后处死大鼠，取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，冠状切成5片，脑片用红四氮唑(TTC)染色，正常组织经染色后呈红色，梗塞组织呈白色，染色后照相，用中国航空航天大学病理图像分析软件求梗塞面积比。数据用X±s表示，以组间t检验进行统计学处理。结果如表1所示，缺血24小时后，大鼠表现出明显的行为障碍，大鼠脑组织也出现明显的灶状缺血区，达到全脑的25％左右；给予不同剂量的20(S)-人参皂苷Rg3，动物行为障碍有不同程度的减轻，大鼠脑缺血区也有明显好转，且呈剂量依赖性。
相同剂量的20(S)-人参皂苷Rg3抗脑缺血作用优于20(R)-人参皂苷Rg3；20(S)-人参皂苷Rg350mg/kg抗脑缺血作用强于20mg/kg(P＜0.05)，但是与75mg/kg比较无明显差别(P＞0.05)。提示当剂量≥50mg/kg时，药效并没有继续增加。
表1 20(S)-人参皂苷Rg3对大鼠局部脑缺血损伤的影响(n＝10，X±s)组别 行为障碍 缺血面积(％)假手术组 00模型对照组 10.10±1.37 24.26±4.13Nim组 6.90±2.33** 13.09±7.11**20(R)-人参皂苷Rg3组(10mg/kg) 8.03±1.11* 20.2±1.3*1mg/kg7.90±1.24* 18.21±2.73*5mg/kg7.50±1.44* 17.06±3.20*20(S)-人参皂10mg/kg7.50±3.03*@16.41±2.84*@苷Rg3组20mg/kg7.31±1.08**△14.22±3.14**△50mg/kg5.34±1.28** 10.18±3.64**75mg/kg5.20±1.93**#10.27±4.73**#与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与50mg/kg组比较△P＜0.05，#P＞0.05；与10mg/kg 20(R)-人参皂苷Rg3组比较@P＜0.05。
试验例220(S)-人参皂苷Rg3对小鼠闭合性脑外伤的保护作用(1)材料20(S)-人参皂苷Rg3注射剂按制备例3制备。
20(R)-人参皂苷Rg3注射剂按制备例4制备。
清洁级昆明系小鼠，18～22g，雌雄各半，由山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供。合格证号鲁动质字200106003号。
(2)方法与结果将小鼠随机分为正常对照组(等容量溶剂)，模型对照组(等容量溶剂)，20(R)-人参皂苷Rg320mg/kg组，20(S)-人参皂苷Rg32mg/kg组，20(S)-人参皂苷Rg310mg/kg组，20(S)-人参皂苷Rg320mg/kg组，20(S)-人参皂苷Rg340mg/kg组，20(S)-人参皂苷Rg3100mg/kg组，20(S)-人参皂苷Rg3150mg/kg组，每组10只。按文献王超云，蒋王林，智红英，等.黄芩苷对脑损伤的保护作用.中草药，2004，35(2)188～190所述方法造成小鼠闭合性脑外伤模型，各组静脉给药，24小时后剥取鼠脑，称量湿重，70℃烘干24小时，称干重，计算脑含水量；脑含水量高于正常值表示脑部水肿。
结果如表2所示，闭合性脑外伤造成小鼠脑严重水肿，给予不同剂量的20(S)-人参皂苷Rg3，小鼠脑水肿有不同程度的减轻，且呈剂量依赖性。
相同剂量的20(S)-人参皂苷Rg3降低脑水肿作用优于20(R)-人参皂苷Rg3；20(S)-人参皂苷Rg3100mg/kg降低脑水肿作用强于40mg/kg(P＜0.05)，但是与150mg/kg比较无明显差别(P＞0.05)。提示当剂量≥100mg/kg时，药效并没有继续增加。
表2 20(S)-人参皂苷Rg3对闭合性脑外伤的影响(n＝10，X±s)组别脑含水量(％)正常对照组 76.1±0.3**模型对照组 84.5±1.320(R)-人参皂苷Rg3组(20mg/kg) 81.1±1.1*2mg/kg 81.6±0.4*10mg/kg 79.9±0.3*20mg/kg 79.8±0.5*@20(S)-人参皂苷Rg3组40mg/kg 79.7±0.4**△100mg/kg 77.4±0.4**150mg/kg 76.5±0.3**#与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与100mg/kg组比较△P＜0.05，#P＞0.05；与20mg/kg 20(R)-人参皂苷Rg3组比较@P＜0.05。
试验例320(S)-人参皂苷Rg3增加麻醉Beagle犬脑血流实验(1)材料20(S)-人参皂苷Rg3注射剂按制备例2制备。
Powerlab/8sp.澳大利亚ADInstrments公司ELECTROMAGNETIC BLOOD FLOWMETERMF-27型，日本光电公司。
流量计探头4号、4.5号，日本光电公司。
单道心电图机，FX-2111型，北京福田电子医疗仪器有限公司。
实验动物Beagle犬，雌雄各半，体重8～12kg，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供，动物合格证号鲁动质字B20021136号。
(2)方法与结果将Beagle犬随机分为空白对照组(等容量溶剂)，尼莫地平组(Nim，0.3mg/kg)，20(S)-人参皂苷Rg3给药组(1.5mg/kg、3mg/kg、6mg/kg)，称重后以3.5％戊巴比妥钠1.0ml/kg后肢外侧隐静脉注射麻醉。分离右侧颈总动脉，结扎颈外动脉，以探头挂在颈总动脉上，并装上活动栓，以防动脉滑脱，测定颈总动脉流量代表脑血流量。分离股动脉，插管连入Powerlab/8sp记录股动脉平均压。四肢皮下插入针状电极描记心电图。稳定20min后，记录颈内动脉血流、血压、心电作为给药前对照；舌下静脉注射相应药物并记录给药后5min、15min、30min、60min、90min时各项指标。此时的颈内动脉血流量为单侧脑组织的血流量，应换算为每100g脑组织的血流量ml/(100g·min)。并按公式计算脑血管阻力(mmHg·min·100g)/ml＝血压/颈内动脉血流量。数据用X±s表示，并与空白对照组比较，T-Test检验。
结果如表3、表4所示，20(S)-人参皂苷Rg3在给药后一定时间内具有明显的增加脑血流、降低脑血管阻力作用。
表3 20(S)-人参皂苷Rg3对麻醉犬颈内动脉血流量的影响(X±s)颈内动脉血流量ml/(100g·min)分组给药前 5min15min 30min 60min 90min空白对照组 135±16134±16 136±16132±13 131±14 124±14Nim 133±13155*±13153±15*156±14*166±11**146±136mg/kg130±18158±9*160±9*170±10**166±9**160±10*20(S)-人参3mg/kg133±15144±8 157±8*159±7*159±12*135±16皂苷Rg31.5mg/kg130±18128±16 155±7*157±13*133±19 119±22与空白对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01
表4 20(S)-人参皂苷Rg3对麻醉犬脑血管阻力的影响(X±s)脑血管阻力(mmHg·min·100g)/ml分组给药前 5min 15min 30min 60min 90min空白对照组 1.08±0.40 1.05±0.38 1.00±0.381.03±0.341.06±0.371.13±0.42Nim 0.95±0.22 0.80±0.18 0.79±0.17*0.72±0.11*0.74±0.13*0.77±0.156mg/kg 1.16±0.18 0.96±0.20 0.82±0.20*0.83±0.15*0.72±0.17*0.87±0.1920(S)-人参皂 3mg/kg 1.01±0.25 0.91±0.19 0.80±0.18*0.76±0.13*0.79±0.16*0.88±0.20苷Rg31.5mg/kg 0.92±0.26 0.86±0.18 0.83±0.180.72±0.18*0.79±0.27*0.95±0.29与空白对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01试验例420(S)-人参皂苷Rg3改善缺血性脑中风大鼠脑线粒体能量代谢作用(1)材料20(S)-人参皂苷Rg3注射剂按制备实施例3制备。
尼莫地平注射液(商品名尼立苏)，山东新华制药股份有限公司产品，规格10mg/50ml，批准文号(95)卫药准字X-121(2号)，批号00060211。
低温超速离心机OPTIMATML-80XP，美国Beckman公司。
UV-9100北京瑞利分析仪器有限公司。
邻苯二甲醛(o-phthalaldehyde，OPT)为Fluka产品。二苯基己三烯(diphenylhexa-triene，DPH)，NADH、NBT为Sigma产品；其余均为国产分析纯。
实验动物SD大鼠，雄性，体重280g-350g，山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供。合格证号鲁动质字200106005号。
(2)方法与结果将大鼠随机分为假手术组，模型对照组，尼莫地平组(Nim，1mg/kg)，20(S)-人参皂苷Rg3给药组(20，10，5mg/kg)，每组10只。禁食12小时后，按前文所述方法手术，造成大鼠右侧大脑中动脉缺血；假手术组仅进行右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉的分离。手术后舌下静脉给予相应药物(假手术、模型对照组给予等容量溶剂)。24h后，动物再次麻醉，蔗糖梯度离心法[3]制备脑线粒体，改良Lowry法蛋白定量，将线粒体悬液浓度调至1.0g蛋白·L-1(4℃操作，-20℃保存)。脑线粒体经过3次冻融之后以Clark氧电极法Kobayashi T，Kuroda S，Tada M，et al.Calcium-induced mitochondrial swelling and cytochrome c release in thebrainits biochemical characteristics and implication in ischemic neuronal injury.[J].Brain Res.2003，17；960(1-2)62-70.连续描记III态(R3)快速耗氧及ADP完全磷酸化后的IV态(R4)耗氧曲线，R3和R4耗氧速率的比值为呼吸控制率(RCR)；根据耗氧曲线计算磷氧比(P/O)，氧化磷酸化效率(OPR)。
结果显示，20(S)-人参皂苷Rg3能够抑制脑缺血大鼠脑线粒体RCR、P/O、OPR的降低，提示20(S)-人参皂苷Rg3可以通过改善脑能量代谢来发挥其抗缺血性脑中风作用。
表5 20(S)-人参皂苷Rg3对脑缺血大鼠脑线粒体能量代谢的影响(X±s)OPR分组RCR(％) P/OnmolATP·min-1假手术组2.8±0.52.5±0.3 167.5±23.8模型对照组 1.4±0.3**1.4±0.2**64.9±9.7***尼莫地平2.5±0.8△△2.3±0.4△△133.5±48.7△△6mg/kg 2.6±0.4△△2.2±0.3△△136.7±32.4△△20(S)-人参3mg/kg 1.8±0.6△1.9±0.2△△103.8±11.2△△1.5mg/kg 1.6±0.51.7±0.4 71.9±44.8与假手术组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较△P＜0.05，△△P＜0.01。
试验例520(S)-人参皂苷Rg3改善缺血性脑中风大鼠血液流变性作用(1)材料20(S)-人参皂苷Rg3注射剂按制备实施例2制备。
血塞通，云南植物药业有限公司产品，100mg/2ml，批号20020108，滇卫药准字(1995)第000138号。
实验动物SD大鼠，雄性，体重280g-350g，山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供。合格证号鲁动质字200106005号。
LBY-N6A血液流变学测试仪北京普利生公司。
(2)方法与结果动物随机分为空白对照组(溶剂)，血塞通组(XST，40mg/kg)，20(S)-人参皂苷Rg3给药组(20，10，5mg/kg)，每组10只。按前述方法造成脑缺血，禁食16小时后，各组动物分别尾静脉注射相应药物，15min后，大鼠腹主动脉取血5ml，以0.5％肝素抗凝，用血液流变学测试仪测定全血粘度、血浆粘度等指标。
数据用X±s表示，并与空白对照组比较，T-Test检验。
结果如表所示，20(S)-人参皂苷Rg3能够降低脑缺血大鼠全血粘度、血浆粘度、红细胞压积，提示20(S)-人参皂苷Rg3可以通过改善血液流变性来发挥其抗缺血性脑中风作用。
表6 20(S)-人参皂苷Rg3对大鼠血液流变性的影响(X±s)全血粘度(mPa.s) 血浆粘度红细胞压积组别低切变率 中切变率 高切变率(mPa.s) (％)空白对照组 8.03±0.34 9.29±0.59 18.36±1.05 2.66±0.20 0.96±0.05血塞通组 4.63±0.20**5.28±0.26**11.89±0.53**1.44±0.03*0.48±0.06*20(S)- 20mg/kg4.71±0.46**5.29±0.58**11.46±1.09**1.48±0.04*0.48±0.04*人参皂 10mg/kg4.85±0.57**5.67±0.73**12.54±1.47*1.42±0.20*0.52±0.06*苷Rg35mg/kg5.03±0.38*6.13±0.47*12.98±0.80*1.46±0.15*0.53±0.05*与空白对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
试验例320(S)-人参皂苷Rg3急性毒性试验(1)材料20(S)-人参皂苷Rg3注射剂按制备实施例3制备。
清洁级昆明系小鼠，18～22g，雌雄各半，由山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供。合格证号鲁动质字200106003号。饲料由中国药品生物制品鉴定检验所提供。
(2)方法根据预试验设计给药剂量并分组空白对照组、100mg/kg、150mg/kg、225mg/kg、337.5mg/kg、506.25mg/kg、759.375mg/kg组，共8组，每组10只。称重后，按0.2ml/10g的体积静脉注射，对照组给予等体积溶剂。给药后密切观察小鼠的毒性反应和7天内死亡情况，并按改进寇氏法测定LD50。
(3)结果20(S)-人参皂苷Rg3注射剂的LD50为408.7±78.6mg/kg；LD50的95％可信限349.2～529.5mg/kg。
权利要求
1. 20(S)-人参皂苷Rg3在制备治疗或预防脑血管疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，20(S)-人参皂苷Rg3在制备治疗或预防缺血性脑中风的药物中的应用。
3.根据权利要求1所述应用，20(S)-人参皂苷Rg3在制备治疗或预防脑外伤的药物中的应用。
4.根据权利要求1所述的应用，20(S)-人参皂苷Rg3在增加脑血流、改善脑线粒体能量代谢以及改善血液流变性方面的应用。
5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其使用剂量范围为10mg～750mg。
6.根据权利要求5所述的应用，其优选剂量为100mg～500mg。
7.含有20(S)-人参皂苷-Rg3的用于治疗或预防脑血管疾病的药物组合物。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，该组合物可以通过口服、舌下、经皮、经肌肉静脉途径给药。
9.根据权利要求7或8所述的药物组合物，该组合物可以以片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊、悬浮液、溶液、糖浆、注射剂、霜剂、软膏、喷雾剂、口嚼剂或贴剂等形式存在。
全文摘要
本发明涉及20(S)－人参皂苷－Rg
文档编号A61K31/7028GK1593441SQ200410054799
公开日2005年3月16日 申请日期2004年7月22日 优先权日2003年7月23日
发明者田京伟, 傅风华, 蒋王林, 王超云 申请人:山东绿叶天然药物研究开发有限公司