专利名称：20(S)—人参皂苷—Rg的制作方法
术领域本发明涉及20(S)-人参皂苷Rg3在制备治疗或预防心脑血管疾病的药物中的应用。
背景技术：
随着人口老龄化进程的加速以及生活方式的改变，心脑血管病已成为一个全球性的健康问题， 冠心病、卒中的死亡率在世界范围分别居第1、3位，高血压一直被认为是卒中的主要危险因素。新型有效的防治心脑血管病药物的开发已刻不容缓。
20(S)-人参皂苷Rg3是从人参中分离提取的四环三萜类人参二醇型皂苷单体。
20(S)-人参皂苷Rg3结构式(R-glu-o-glu；R1-OH；R2-CH3)据报道，Rg3具有抗肿瘤、抑制新生血管生成、抗炎等作用，但关于20(S)-人参皂苷Rg3具有预防或治疗心脑血管疾病的作用未见报道；鉴于此，本发明人通过大量的实验研究，发现20(S)-人参皂苷Rg3具有预防或治疗心脑血管疾病的医药用途。
发明内容
本发明提供了20(S)-人参皂苷Rg3在制备治疗或预防心脑血管疾病的药物中的应用。
本发明提供了20(S)-人参皂苷Rg3在制备治疗或预防脑损伤的药物中的应用。
本发明提供了20(S)-人参皂苷Rg3在制备治疗或预防心肌缺血的药物中的应用。
本发明提供了20(S)-人参皂苷Rg3在制备治疗或预防充血性心力衰竭药物中的应用。
本发明提供了含有20(S)-人参皂苷Rg3的治疗心脑血管疾病的药物组合物。
本发明所述的20(S)-人参皂苷Rg3在用于上述任一用途时，其使用剂量范围为10mg～750mg/天，优选100mg～500mg/天。
本发明中使用的20(S)-人参皂苷Rg3可以单独使用或以药物组合物形式使用。药物组合物包括作为活性成分的20(S)-人参皂苷Rg3及药用载体。该药物组合物可以通过静脉、口服、舌下、经皮、经肌肉或皮下、皮肤粘膜途径给药。药物组合物可以以片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊、悬浮液、溶液、糖浆、注射剂的形式存在。本发明所提供的各种药物剂型均可以以药学常规方法制备而成。
本发明人通过下列试验证实了20(S)-人参皂苷Rg3具有治疗心脑血管疾病的作用。20(R)-人参皂苷Rg3、20(S)-人参皂苷Rg3由山东省天然药物工程技术研究中心药物化学研究室提供，经HPLC检测含量≥90％，对照品由山东省天然药物工程技术研究中心分析研究室提供。20(S)与20(R)人参皂苷Rg3按文献汤明辉，姜志宏，赵中振，等.HPLC法分离与检测20(S)-人参皂苷Rg3和20(R)-人参皂苷Rg3.中草药.2003，35(3)208～282.所述方法检测。20(R)-人参皂苷Rg3亦可购自中国药品生物制品检定所。
具体实施例方式
制备例120(S)-人参皂苷Rg3和20(R)-人参皂苷Rg3的制备以三七总皂苷(或人参总皂苷)为原料，加入50％的醋酸水溶液，70℃水浴加热6小时，冷却，加入5％碳酸钠溶液，溶液经正丁醇萃取，萃取物蒸干后，上硅胶柱，以氯仿-甲醇为洗脱剂，进行梯度洗脱，得到20(S)-人参皂苷Rg3和20(R)-人参皂苷Rg3的粗品，经反复硅胶柱层析，分别得到20(S)-人参皂苷Rg3和20(R)-人参皂苷Rg3。并按文献汤明辉，姜志宏，赵中振，等.HPLC法分离与检测20(S)-人参皂苷Rg3和20(R)-人参皂苷Rg3.中草药.2003，35(3)208～282.所述方法检测。
制备例220(S)-人参皂苷Rg3针剂制备称取0.50g 20(S)-人参皂苷Rg3，加入50g PEG-400，使皂苷溶解；配制50g pH5.5的磷酸盐缓冲液，称取0.02g亚硫酸氢钠加入到上述磷酸盐缓冲液中；将缓冲液加入到皂苷的PEG溶液中，混合均匀，加入0.01％针用活性炭100℃保温30分钟，G3垂熔玻璃漏斗过滤、0.22um的微孔滤膜过滤，过滤后的药液分装成2ml/支的针剂50支，分装好的注射剂可以直接压塞、压铝盖成针剂。
制备3注射用20(S)-人参皂苷Rg3冻干粉针制备称取0.50g 20(S)-人参皂苷Rg3，加入50g PEG-400，使皂苷溶解。配制50g pH5.5的磷酸盐缓冲液，称取0.02g亚硫酸氢钠加入到上述磷酸盐缓冲液中；将缓冲液加入到皂苷的PEG溶液中，混合均匀，加入0.01％针用活性炭100℃保温30分钟，G3垂熔玻璃漏斗过滤、0.22um的微孔滤膜过滤；过滤后的药液分装成2ml/支的西林瓶中，经冻干机冻干制成冻干粉针。
制备例4注射用20(R)-人参皂苷Rg3冻干粉针制备称取0.50g 20(R)-人参皂苷Rg3，加入50g PEG-400，使皂苷溶解。配制50g pH5.5的磷酸盐缓冲液，称取0.02g亚硫酸氢钠加入到上述磷酸盐缓冲液中；将缓冲液加入到皂苷的PEG溶液中，混合均匀，加入0.01％针用活性炭100℃保温30分钟，G3垂熔玻璃漏斗过滤、0.22um的微孔滤膜过滤；过滤后的药液分装成2ml/支的西林瓶中，经冻干机冻干制成冻干粉针。
制备例520(S)-人参皂苷Rg3和20(R)-人参皂苷Rg3对照品制备以三七总皂苷(或人参皂苷)为原料，加入50％的醋酸水溶液，70℃水浴加热6小时，冷却，加入5％碳酸钠溶液，溶液经正丁醇萃取，萃取物蒸干后，上硅胶柱，以氯仿-甲醇为洗脱剂，进行梯度洗脱，得到20(S)-人参皂苷Rg3和20(R)-人参皂苷Rg3的粗品，经反复硅胶柱层析，分别得到20(S)-人参皂苷Rg3和20(R)-人参皂苷Rg3精品，然后反复重结晶，得到对照品。
试验例120(S)-人参皂苷Rg3对大鼠局部脑缺血损伤的影响(1)材料按制备例2制备20(S)-人参皂苷Rg3按制备例4制备20(R)-人参皂苷Rg3红四氮唑美国Sigma公司产品，临用前用生理盐水配成4％溶液。
实验动物SD大鼠，雄性，体重280g-350g，山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供。合格证号鲁动质字200106005号。
(2)方法与结果动物随机分为假手术组(等容量溶剂)，模型对照组(等容量溶剂)，尼莫地平组(Nim，1.5mg/kg)，20(R)-人参皂苷Rg35mg/kg组，20(S)-人参皂苷Rg31mg/kg组，20(S)-人参皂苷Rg35mg/kg组，20(S)-人参皂苷Rg310mg/kg组，20(S)-人参皂苷Rg320mg/kg组，20(S)-人参皂苷Rg350mg/kg组，20(S)-人参皂苷Rg375mg/kg组，每组10只。禁食12小时后，水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉，分离右侧颈总动脉，夹闭颈内、颈总动脉，颈外动脉近心端及远心端结扎，中间剪断。将颈外动脉游离端拉至与颈内动脉成一条直线，将栓线(选用直径0.24mm尼龙线，长度5.0cm)由颈外动脉插入至颅内，遇轻微阻力时停止，插入深度约为2cm。结扎颈外动脉开口，并打开颈总动脉动脉夹，消毒缝合伤口，造成右侧大脑中动脉缺血模型；假手术组仅进行右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉的分离(以上实验均在23℃～25℃进行)。术后各组动物静脉注射相应药物(给药体积1ml/200g)。24小时后按文献刘小光，徐理纳，一种能评价溶栓和抗溶栓的大鼠脑中动脉模型，药学学报，1995，30662所述方法及标准观察并记录大鼠的行为障碍(A)提鼠尾观察前肢屈曲情况，如双前肢对称伸向地面，计为0分，如手术对侧前肢出现腕屈曲计为1分，肘屈曲计为2分，肩内旋计为3分，既有腕屈曲和/或肘屈曲，又有肩内旋者，计为4分。(B)将动物置于平地面上，分别推双肩向对侧移动，检查阻力。如双侧阻力对等且有力，计为0分，如向手术对侧推动时阻力下降者，根据下降程度不同分为轻、中、重三度，分别计为1，2和3分。(C)将动物双前肢置一金属网上，观察双前肢的肌张力。双前肢肌张力对等且有力者计为0分。同样根据手术对侧肌张力下降程度不同计为1，2和3分。(D)动物有不停地向一侧转圈者，计为1分。根据标准评分，满分为11分，分数越高，表示动物行为障碍越严重。
行为评分后处死大鼠，取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，冠状切成5片，脑片用红四氮唑(TTC)染色，正常组织经染色后呈红色，梗塞组织呈白色，染色后照相，用中国航空航天大学病理图像分析软件求梗塞面积比。数据用X±s表示，以组间t检验进行统计学处理。
结果如表1所示，缺血24小时后，大鼠表现出明显的行为障碍，大鼠脑组织也出现明显的灶状缺血区，达到全脑的25％左右；给予不同剂量的20(S)-人参皂苷Rg3，动物行为障碍有不同程度的减轻，大鼠脑缺血区也有明显好转，且呈剂量依赖性。
相同剂量的20(S)-人参皂苷Rg3抗脑缺血作用优于20(R)-人参皂苷Rg3；20(S)-人参皂苷Rg350mg/kg抗脑缺血作用强于20mg/kg(P＜0.05)，但是与75mg/kg比较无明显差别(P＞0.05)。提示当剂量≥50mg/kg时，药效并没有继续增加。
表1 20(S)-人参皂苷Rg3对大鼠局部脑缺血损伤的影响(n＝10，X±s)组别 行为障碍缺血面积(％)假手术组 0 0模型对照组10.10±1.37 24.26±4.13Nim组 6.90±2.33**13.09±7.11**20(R)-人参皂苷Rg3组(10mg/kg) 8.03±1.11*20.2±1.3*1mg/kg 7.90±1.24*18.21±2.73*5mg/kg 7.70±2.44*17.06±3.20*20(S)-人参皂苷 10mg/kg 7.50±3.03*@16.41±2.84*@Rg3组 20mg/kg 7.31±1.08**△14.22±3.14**△50mg/kg 5.34±1.28**10.18±3.64**75mg/kg 5.20±1.93**#10.27±4.73**#
与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与50mg/kg组比较△P＜0.05，#P＞0.05；与10mg/kg20(R)-人参皂苷Rg3组比较@P＜0.05。
试验例220(S)-人参皂苷Rg3对小鼠闭合性脑外伤的保护作用(1)材料按制备例2制备20(S)-人参皂苷Rg3，按制备例4制备20(R)-人参皂苷Rg3清洁级昆明系小鼠，18～22g，雌雄各半，由山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供。合格证号鲁动质字200106003号。
(2)方法与结果将小鼠随机分为正常对照组(等容量溶剂)，模型对照组(等容量溶剂)，20(R)-人参皂苷Rg320mg/kg组，20(S)-人参皂苷Rg32mg/kg组，20(S)-人参皂苷Rg310mg/kg组，20(S)-人参皂苷Rg320mg/kg组，20(S)-人参皂苷Rg340mg/kg组，20(S)-人参皂苷Rg3100mg/kg组，20(S)-人参皂苷Rg3150mg/kg组，每组10只。按文献王超云，蒋王林，智红英，等.黄芩苷对脑损伤的保护作用.中草药，2004，35(2)188～190所述方法造成小鼠闭合性脑外伤模型，各组静脉给药，24小时后剥取鼠脑，称量湿重，70℃烘干24小时，称干重，计算脑含水量；脑含水量高于正常值表示脑部水肿。
结果如表2所示，闭合性脑外伤造成小鼠脑严重水肿，给予不同剂量的20(S)-人参皂苷Rg3，小鼠脑水肿有不同程度的减轻，且呈剂量依赖性。
相同剂量的20(S)-人参皂苷Rg3降低脑水肿作用优于20(R)-人参皂苷Rg3；20(S)-人参皂苷Rg3100mg/kg降低脑水肿作用强于40mg/kg(P＜0.05)，但是与150mg/kg比较无明显差别(P＞0.05)。提示当剂量≥100mg/kg时，药效并没有继续增加。
表2 20(S)-人参皂苷Rg3对闭合性脑外伤的影响(n＝10，X±s)组别脑含水量(％)正常对照组 76.1±0.3**模型对照组 84.5±1.320(R)-人参皂苷Rg3组(10mg/kg) 81.1±1.1*2mg/kg 81.6±0.4*10mg/kg 79.9±0.3*20mg/kg 79.8±0.5*@20(S)-人参皂苷Rg3组40mg/kg 79.7±0.4**△100mg/kg 77.4±0.4**150mg/kg 76.5±0.3**#与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与100mg/kg组比较△P＜0.05，#P＞0.05；与20mg/kg 20(R)-人参皂苷Rg3组比较@P＜0.05。
试验例320(S)-人参皂苷Rg3对大鼠心肌缺血的影响(1)材料按制备例3制备20(S)-人参皂苷Rg3氯化硝基四氮唑蓝(N-BT)，由军事医学科学院药材供应站提供。
实验动物普通级Wistar大鼠，雄性，体重280g-350g，山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供。合格证号鲁动质字200106005号。
(2)方法与结果将大鼠随机分为假手术组，模型对照组(等容量溶剂)，20(S)-人参皂苷Rg31mg/kg组，20(S)-人参皂苷Rg35mg/kg组，20(S)-人参皂苷Rg310mg/kg组，20(S)-人参皂苷Rg320mg/kg组，20(S)-人参皂苷Rg350mg/kg组，20(S)-人参皂苷Rg375mg/kg组，每组10只。禁食12小时后，ip乌拉坦(1.2g/kg)麻醉，测肢体导联心电图。剪去左胸前皮毛，碘酒及酒精消毒，沿胸骨左缘1cm处，剪开胸壁肌肉及二条肋骨，迅速打开胸腔，暴露心脏，在动脉圆锥与左心耳之间结扎左冠状动脉，立即将心脏放回，排挤出胸腔空气，用止血钳闭合胸腔，造成大鼠急性心肌缺血模型。术后各组动物静脉滴注(用输液泵注射)相应药物(给药体积3ml，30min滴完)。记录术后0，2，6h心电图，随后取出心脏，以冷生理盐水洗净后，-20℃冰箱冷冻过夜。次日，将冷冻的心脏由结扎处至心尖部等厚切成5片，浸入新鲜配制的0.5％N-BT磷酸缓冲液(pH7.4)中。37℃水浴振摇10～15min。用滤纸吸干切片表面的染色液，分离染色部分和未染色部分，称重，记算梗死面积。心肌梗死百分比(％)＝梗死部分重量/(非梗死部分重量+梗死部分重量)×100％。
结果如表3所示，不同剂量的20(S)-人参皂苷Rg3明显减少结扎冠状动脉所致大鼠急性心肌缺血引起的心肌梗死面积，并可降低由心肌缺血造成的肢体导联心电图J点的升高。20(S)-人参皂苷Rg350mg/kg抗心肌缺血作用强于20mg/kg(P＜0.05)，但是与75mg/kg比较无明显差别(P＞0.05)，即当剂量≥50mg/kg时，药效并没有继续增加。
表3 20(S)-人参皂苷Rg3对大鼠心肌缺血损伤的影响(n＝10，X±s)心肌梗死百分比J点升高(10×mV)分组(％) 正常 0h 2h 6h模型对照组 24±4 0.8±0.6 6.7±2.3 6.3±2.0 5.9±1.5*丹参注射液组 17±6*0.8±0.6 6.0±1.5*5.6±1.7*5.6±1.6*1mg/kg19±7*0.7±0.5 6.1±1.2*5.6±1.6*4.9±1.2*5mg/kg18±5*0.7±0.6 5.9±1.5*5.3±1.2*4.8±1.6*20(S)-人10mg/kg18±5*0.7±0.5 5.6±1.6*4.9±1.6*4.2±1.1*参皂苷20mg/kg17±6*△0.7±0.5 5.3±1.1*△4.8±1.3*△4.1±1.5*△Rg350mg/kg14±5**0.7±0.6 4.6±1.6*4.2±1.4*3.5±1.0*75mg/kg13±6**#0.7±0.5 4.4±1.3*#4.1±1.6*#3.4±1.1*#
与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与50mg/kg组比较△P＜0.05，#P＞0.05。
试验例420(S)-人参皂苷Rg3对猫实验性心力衰竭的治疗作用(1)材料20(S)-人参皂苷Rg3注射剂按制备例3制备。
Powerlab/8sp生理记录仪澳大利亚InStruments公司生产。
电磁流量计(MFV-3200型)日本光电公司生产。
实验动物健康成年猫体重2～4kg，山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供。(2)方法将猫随机分为模型对照组(等容量溶剂)，20(S)-人参皂苷Rg3小剂量组(5mg/kg)，20(S)-人参皂苷Rg3中剂量组(10mg/kg)，20(S)-人参皂苷Rg3大剂量组(20mg/kg)，每组6只。禁食12小时后，静脉注射戊巴比妥钠40mg/kg麻醉，气管插管，人工呼吸，监测主动脉压(AP)与心电图。左侧开胸，从心尖插导管至左心室，测左室压及其压力变化速度(±dP/dtmax)。将Waltan-Brodie应变弓植入左心室前壁，测定心肌收缩力。用电磁流量计测定升主动脉血流量。以升主动脉流量作为心输出量(CO)，计算心脏指数(CI)，每搏指数(SI)，每搏作功(SW)，左心作功(LVW)及总外周血管阻力(SVR)。各项参数记录于Powerlab/8sp生理记录仪。术后半小时，各项参数达到稳定。从股静脉恒速输注戊巴比妥钠(0.5ml/kg·min)，以±dP/dtmax下降到约1000mmHg/s为主要指标形成急性心力衰竭。待心衰模型稳定后，各组动物静脉滴注(用输液泵注射)相应药物(给药体积10ml，30min滴完)。
(3)结果A、20(S)-人参皂苷Rg3对心力衰竭猫心率与血压的影响结果如表4所示，滴注不同剂量20(S)-人参皂苷Rg3可不同程度降低心力衰竭猫血压，而且对舒张压的作用尤为明显。
表4 20(S)-人参皂苷Rg3对心力衰竭猫血压的影响(n＝6，X±s)平均动脉压(mmHg) 收缩压(mmHg) 舒张压(mmHg)分组给药前 给药后 给药前 给药后 给药前 给药后模型对照组 57±5 53±6 71±11 69±10 45±8 44±820(S)-人参皂苷 20mg/kg 55±4 38±8**##73±14 64±8*#47±6 27±5**##Rg310mg/kg 59±6 43±9*#70±9 66±741±7 30±6**##5mg/kg 62±5 45±7*73±10 67±842±6 35±3*#与给药前比较*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较#P＜0.05，##P＜0.01B、20(S)-人参皂苷Rg3对心力衰竭猫心脏作功的影响结果如表5所示，滴注不同剂量20(S)-人参皂苷Rg3可增加心衰猫的SW与LVW，与给药前、模型对照组比较有显著性差异。
表5 20(S)-人参皂苷Rg3对心力衰竭猫心脏作功的影响(n＝6，X±s)每搏作功(g·m/beat)左心作功(kg·m/min)分组给药前 给药后给药前 给药后模型对照组0.98±0.33 0.87±0.560.064±0.0330.059±0.03220(S)-人参皂 20mg/kg0.86±0.41 1.23±0.51**##0.066±0.0360.087±0.041**##苷Rg310mg/kg0.89±0.32 1.08±0.47*#0.059±0.0320.079±0.036*#5mg/kg0.93±0.38 1.01±0.50#0.061±0.0310.070±0.029#与给药前比较*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较#P＜0.05，##P＜0.01C、20(S)-人参皂苷Rg3对心力衰竭猫总外周血管阻力的影响结果如表6所示，滴注不同剂量20(S)-人参皂苷Rg3可降低心力衰竭猫总外血管阻力，与给药前、模型对照组比较有显著性差异。
表6 20(S)-人参皂苷Rg3对心力衰竭猫总外周血管阻力的影响(n＝6，X±s)总外周血管阻力(mmHg/min/kg)分组给药前给药后模型对照组 79±2782±3320(S)-人参皂苷Rg320mg/kg 81±3051±22**##10mg/kg 83±2864±30**##5mg/kg 82±3071±33*#与给药前比较*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较#P＜0.05，##P＜0.01D、20(S)-人参皂苷Rg3对心力衰竭猫心输出量的影响结果如表7所示，滴注不同剂量20(S)-人参皂苷Rg3可增加心衰猫的心输出量，与给药前、模型对照组比较有显著性差异。
表7 20(S)-人参皂苷Rg3对心力衰竭猫心输出量的影响(n＝6，X±s)每搏输出量指数(ml/beat·m2) 心脏输出量指数(L/min·m2)分组给药前 给药后 给药前给药后模型对照组 4.5±0.94.1±1.2 0.65±0.150.59±0.1820mg/kg4.4±1.28.1±3.5**##0.67±0.200.88±0.23**##20(S)-人参皂10mg/kg5.1±1.67.2±3.3**##0.66±0.170.79±0.16*#苷Rg35mg/kg4.8±0.95.9±1.1*#0.67±0.210.73±0.19#与给药前比较*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较#P＜0.05，##P＜0.01试验例520(S)-人参皂苷Rg3急性毒性试验(1)材料20(S)-人参皂苷Rg3注射剂按制备例2制备。
清洁级昆明系小鼠，18～22g，雌雄各半，由山东省天然药物工程技术研究中心动物实验中心提供。合格证号鲁动质字200106003号。饲料由中国药品生物制品鉴定检验所提供。
(2)方法根据预试验设计给药剂量并分组空白对照组、100mg/kg、150mg/kg、225mg/kg、337.5mg/kg、506.25mg/kg、759.375mg/kg组，共8组，每组10只。称重后，按0.2ml/10g的体积静脉注射，对照组给予等体积溶剂。给药后密切观察小鼠的毒性反应和7天内死亡情况，并按改进寇氏法测定LD50。
(3)结果20(S)-人参皂苷Rg3注射剂的LD50为408.7±78.6mg/kg；LD50的95％可信限349.2～529.5mg/kg。
权利要求
1. 20(S)-人参皂苷Rg3在制备治疗或预防心脑血管疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，20(S)-人参皂苷Rg3在制备治疗或预防脑损伤的药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，20(S)-人参皂苷Rg3在制备治疗或预防心肌缺血的药物中的应用。
4.根据权利要求1所述的应用，20(S)-人参皂苷Rg3在制备治疗或预防充血性心力衰竭药物中的应用。
5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其使用剂量范围为10mg～750mg。
6.根据权利要求5所述的应用，其优选剂量为100mg～500mg。
7.含有20(S)-人参皂苷-Rg3的用于治疗或预防心脑血管疾病的药物组合物。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，该组合物可以通过口服、舌下、经皮、经肌肉静脉途径给药。
9.根据权利要求7或8所述的药物组合物，该组合物可以以片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊、悬浮液、溶液、糖浆、注射剂、霜剂、软膏、喷雾剂、口嚼剂或贴剂等形式存在。
全文摘要
本发明涉及20(S)－人参皂苷－Rg
文档编号A61P9/00GK1593442SQ200410054800
公开日2005年3月16日 申请日期2004年7月22日 优先权日2003年7月23日
发明者田京伟, 傅风华, 蒋王林, 王超云 申请人:山东绿叶天然药物研究开发有限公司