一种透明化试剂、生物组织透明化成像方法及其应用与流程

本发明涉及了一种生物试剂、处理方法及其应用，涉及生物样本处理和生物医学成像领域的一种透明化试剂、生物组织透明化成像方法及其应用。

背景技术：

脑组织透明技术是利用多种有机化合物或离子去污剂的混合试剂对脑组织进行处理，使其光学特性发生改变，由强散射介质转变为弱散射介质，透光性增强，从而提高光学显微镜的成像深度，有利于实现对脑组织的三维重建和对神经元空间结构的解析。目前脑组织透明技术最常用的方法是CLARITY和CUBIC。由于CLARITY对脑组织进行丙烯酰胺凝胶包埋后用离子去污剂处理，凝胶的融入使得脑组织产生严重膨胀，离子去污剂强力的洗脱作用使得神经细胞膜结构被完全破坏。而CUBIC利用非离子去污剂的水溶液对脑组织进行处理，非离子去污剂缓和的作用使透明化过程需超过一周的时间且荧光信号产生严重的淬灭。

技术实现要素：

本发明的目的在于提出一种透明化试剂、生物组织透明化成像方法及其应用，以缩短透明化时程，简化操作步骤，减少组织结构破损和荧光淬灭并获得更好的成像效果。

为了实现上述目的，本发明的技术方案包括以下顺序步骤：

一、一种透明化试剂：

透明化试剂是由山梨糖醇、尿素、甘油和去污剂的四种主要成分溶于二甲基亚砜溶剂中形成的混合试剂。山梨糖醇、尿素、甘油和去污剂溶于二甲基亚砜的质量体积比分别是25％-35％、10％-30％、1％-5％、0％-5％。

所述的山梨糖醇为市售产品，可用于改变蛋白质四级结构，产生组织透明效果并减缓脑组织的膨胀。

所述的尿素为市售产品，是主要的透明化成分，用于非破坏性的溶解细胞膜以及使蛋白质结构松散化。

所述的甘油为市售产品，主要用于提高试剂的清澈度并部分减缓脑组织的膨胀。

所述的去污剂可为离子去污剂或非离子去污剂，如十二烷基磺酸钠、Triton X-100、Tween 20或Tween 80市售产品，其可以在透明化试剂中选择性加入，用于大程度的破坏细胞膜结构，加速透明化进程。

二、一种透明化试剂的应用是在针对离体生物组织透明化处理和离体生物组织成像中的应用，尤其是在神经系统成像中的应用。

三、一种生物组织透明化的成像方法，包括以下步骤：

A)生物组织的固定和分离；

B)将生物组织浸泡在透明化试剂中，直到生物组织变得透明，透明化试剂采用权利要求1所述的透明化试剂；

C)对透明化的生物组织进行染色、制片和成像。

本发明所述的生物组织指的是离体或者已经死亡的生物组织。

所述步骤A中的生物组织为脑组织、胚胎、肾脏、脊柱、肝脏组织、肠道组织或者卵巢组织。

所述步骤A中的生物组织来源于爬行类、鸟类和哺乳类动物的生物体。

所述步骤A中具体是采用心脏灌流的方法进行：腹腔麻醉后，打开胸腔，经心尖处将输液器针头穿入左心室，灌注生理盐水或PBS(磷酸缓冲液)，剪开右心耳，冲洗体循环血液，血液冲洗完成后再灌注质量浓度为4％的多聚甲醛溶液，完成后开颅取脑。

所述步骤B中浸泡采用密闭容器，在恒定的温度与摇动速度下进行振荡。优选的温度为20-40摄氏度，摇动速度为50-70rpm/min。

所述步骤C中染色采用免疫荧光染色、免疫组织化学染色、化学染料染色和病毒感染表达荧光蛋白的方法。

所述步骤C中染色采用免疫荧光染色法，具体是：组织样本从透明化试剂中取出并放入PBST(包含0.1％体积浓度Triton X-100的磷酸缓冲液)，用PBST清洗多余的透明化试剂，接着加入一抗孵育使抗体完全结合靶位点，再使用PBST洗脱多余的一抗，然后加入携带有荧光基团的二抗进行孵育，使二抗与一抗结合，最后用PBST洗脱多余的二抗。

对于透明化自表达荧光蛋白的生物组织，不需要所述步骤C中生物组织染色步骤，而是直接进行制片和成像。

所述步骤C中透明化生物组织的制片采用如下方法：先制备金属或塑料的回形模具，回形模具中部设有方形孔洞，外部为方形框架，厚度需与透明化的组织厚度相一致；然后将回形模具置于载玻片上，载玻片置于桌面上，透明化的生物组织置于回形模具的方形孔洞中，在方形孔洞中加满透明化试剂；最后将盖玻片置于回形模具上，使方形孔洞密封。

一般现有透明处理方法不能适用于多种光学显微镜成像，而本发明方法的成像，可采用多种光学显微镜成像，包括宽场荧光显微镜、激光片层扫描显微镜、激光共聚焦显微镜和双光子荧光显微镜等。

采用本发明的方法优势在于：

①本发明所使用的透明化试剂都是市售产品，购买方便且价格便宜；

②本发明的步骤简单，方法简单易行；

③相对于已发表的组织透明化方法，本方法可大大缩减样本处理所需的时间；

④相对于已发表的组织透明化方法，本方法不会产生明显的组织膨胀或组织皱缩的负面效果；

⑤相对于已发表的组织透明化方法，本方法对组织样品结构的破坏程度较小，对于含有表达荧光蛋白的样品，荧光几乎不产生淬灭。

⑥本方法的适用性广泛，可用于多种生物组织，也可以与各种染色方法相互结合并通过不同的成像手段得到图像结果。

附图说明

图1为用于成像封片所使用的载玻片、回形模具和盖玻片的图片；

图2为小鼠大脑固定分离后的图片；

图3为小鼠大脑经过透明化试剂透明化五天后的图片；

图4为免疫荧光染色后激光共聚焦的成像结果：黑色代表视野范围内所有星形胶质细胞的位置；

图5为对样本Z轴多层扫描并进行图像匹配的三维重建结果：可观察到密集排列并呈海星状的星形胶质细胞。

图6为对Vget-EYFP鼠小脑组织激光共聚焦的成像结果：灰色代表小脑网状结构，黑色斑点代表脑组织内自表达的绿色荧光蛋白。

图中：回形模具1、载玻片2、盖玻片3。

具体实施方式

以下组织分离实施例、实施例和效果实例可以更详细的说明本发明，但不以任何形式限制本发明。

本发明实施例如下：

实施例1

A.脑组织的固定和分离，实施例采用小鼠大脑，其固定和分离过程如下：

装好多聚甲醛、温生理盐水吊瓶，排空气泡。质量浓度10％的水合氯醛麻醉小鼠(20g小鼠约0.2ml)，待小鼠完全麻醉后腹面向上固定好老鼠。打开小鼠胸腔，充分显露心脏和肝脏，尽可能多暴露心脏。找到鼠心尖，用止血钳预夹住心尖，持针从心尖略偏右下进，插入有突破感即停，打开生理盐水的输液器。剪破右心耳，此时液体从吊瓶内流下，红色血液从右房流出并冲尽全身血液，时间约4-5分钟，40ml生理盐水每只小鼠。换质量浓度4％的多聚甲醛灌注60ml。取脑组织，灌流成功情况下大脑完全变白，无红色血管，分离出的大脑见图2。后续将大脑置于质量浓度4％多聚甲醛4摄氏度固定24小时。

B.将组织浸泡在山梨糖醇、尿素和甘油溶于二甲基亚砜的混合试剂中，透明化试剂具体成分配比是：质量比体积浓度30％的山梨糖醇、质量比体积浓度20％的尿素和质量比体积浓度5％的甘油定容于100毫升的二甲基亚砜溶液中。

37摄氏度65rpm摇床内处理约5天，直到组织变得透明，透明后的脑组织见图3。透明完成后将全脑置于脑模具上，刀片切下1mm厚度的脑片。

C.用无尘试纸轻轻擦去所有的试剂并将脑样本放入24孔板中。加入1mlPBST恒温摇床37摄氏度65rpm清洗1天。然后吸走所有PBST，重新加入1mlPBST恒温摇床37摄氏度65rpm清洗30分钟。再次吸走所有PBST，加入新的1ml PBST和20ul兔抗鼠GFAP一抗，恒温摇床37摄氏度65rpm处理2天。完成后回收一抗，1ml PBST恒温摇床37摄氏度65rpm再次清洗1天，期间每4-6h换液。吸走所有PBST，加入新的1ml PBST、1ul DAPI和20ul羊抗兔Cy3二抗。恒温摇床37摄氏度80rpm处理1天。吸走所有溶液，加入1ml PBST恒温摇床37摄氏度80rpm清洗1天。吸走PBST，加入1ml透明化试剂恒温摇床37摄氏度65rpm处理数分钟，不断观察至脑片恢复全透明。将金属回形模具置于载玻片上，透明化的组织置于模具中部方形孔洞中并添加满透明化试剂。

后将盖玻片置于模具上，使样品密封并封片。如图1所示，将回形模具1置于载玻片2上，透明化的生物组织置于回形模具的方形孔洞中，在方形孔洞中加满透明化试剂；最后将盖玻片3置于回形模具上，使方形孔洞密封。

制片完成后在奥林巴斯FV1000荧光共聚焦显微镜下进行成像，结果如图4所示。

使用组织分离实施例的方法获得待观察的小鼠脑组织样本，运用实施例的方法对脑组织样本进行透明化处理、染色、制片和成像，最终成像结果如图4。因组织已被透明化，可以对样本进行较大深度的成像，对样本Z轴多层扫描并进行图像匹配可完成对样本的三维重建，最终结果如图5。

实施例2

A.脑组织的固定和分离，实施例采用Vget-EYFP转基因大鼠小脑(此鼠系脑组织内抑制性神经元自表达绿色荧光蛋白)，其固定和分离过程如下：

质量浓度2％的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠(50mg/kg)，待大鼠完全麻醉后腹面向上固定好老鼠。沿腹腔打开胸腔，尽可能多暴露心脏。找到心尖，用止血钳预夹住心尖，持针从心尖略偏右下进，插入有突破感即停，打开灌流泵以55ml/min流速灌注PBS溶液。剪破右心耳，将流速提高到100ml/min冲尽全身血液，冲洗2分钟。换质量浓度4％的多聚甲醛100ml/min灌注，待鼠尾翘起后将流速降至55ml/min，灌注10分钟。取脑组织，灌流成功情况下大脑完全变白，无红色血管。后续将脑置于4％多聚甲醛4℃固定24小时。固定完成后将全脑置于脑模具上，刀片切下1mm厚度的小脑脑片。

B.将组织浸泡在山梨糖醇、尿素、甘油和十二烷基磺酸钠溶于二甲基亚砜的混合试剂中，透明化试剂具体成分配比是：质量比体积浓度25％的山梨糖醇、质量比体积浓度30％的尿素、质量比体积浓度5％的甘油和质量比体积浓度1％的十二烷基磺酸钠定容于100毫升的二甲基亚砜溶液中。

20摄氏度50rpm摇床内处理约2天，直到组织变得透明；

C.将金属回形模具置于载玻片上，将浸泡在透明化试剂的脑组织取出并置于模具中部方形孔洞中并添加满透明化试剂。

后将盖玻片置于模具上，使样品密封并封片。如图1所示，将回形模具1置于载玻片2上，透明化的生物组织置于回形模具的方形孔洞中，在方形孔洞中加满透明化试剂；最后将盖玻片3置于回形模具上，使方形孔洞密封。

制片完成后在奥林巴斯FV1000荧光共聚焦显微镜下进行成像。

使用组织分离实施例的方法获得待观察的小鼠脑组织样本，运用实施例的方法对脑组织样本进行透明化处理、制片和成像，最终成像结果如图6。

实施例3

A.脑组织的固定和分离，实施例采用小鼠大脑，其固定和分离过程同实施例1.

B.将组织浸泡在山梨糖醇、尿素、甘油和Triton X-100溶于二甲基亚砜的混合试剂中，透明化试剂具体成分配比是：质量比体积浓度35％的山梨糖醇、质量比体积浓度10％的尿素、质量比体积浓度5％的甘油和质量比体积浓度5％的Triton X-100定容于100毫升的二甲基亚砜溶液中。

40摄氏度70rpm摇床内处理约5天，直到组织变得透明。透明完成后将全脑置于脑模具上，刀片切下2mm厚度的脑片。

C.用无尘试纸轻轻擦去所有的试剂并将脑样本放入24孔板中。加入1mlPBS恒温摇床40摄氏度70rpm清洗1天。然后吸走所有PBS。取下1ml注射器的针头，用针头尖端粘取一粒Dil细胞膜荧光染料小颗粒。将此颗粒放置于24孔板中的脑片上。加入PBS至刚好浸润样本但不淹没过染料颗粒。室温下静置5天。完成后加入2ml PBS后立即吸走，重复3-4次直至清洗掉所有剩余的Dil颗粒。之后重新加入2ml PBS，恒温摇床40摄氏度70rpm清洗1天。吸走所有PBS，加入1ml透明化试剂恒温摇床40摄氏度70rpm处理数分钟，不断观察至脑片恢复全透明。将金属回形模具置于载玻片上，透明化的组织置于模具中部方形孔洞中并添加满透明化试剂。

后将盖玻片置于模具上，使样品密封并封片。如图1所示，将回形模具1置于载玻片2上，透明化的生物组织置于回形模具的方形孔洞中，在方形孔洞中加满透明化试剂；最后将盖玻片3置于回形模具上，使方形孔洞密封。

制片完成后在奥林巴斯FV1000荧光共聚焦显微镜下进行成像。

应用本发明可通过简单的操作方式在2-5天内完成对生物样本的透明化处理。因组织的透明化且细胞保存度完好，在光学显微镜下可以实现更高深度和更大体积的成像，可实现对样本的三维成像和空间结构解析。尤其是对于脑组织样本，可以完成对空间跨度较大的神经元和胶质细胞结构的分析以及对不同位置脑区的连接提供有力的图像证据。