本发明涉及一种用于检测眼科疾病的试剂盒及其检测方法。
背景技术：
：格雷夫斯病(Graves'disease)是一种常见病，女性发病率为1/1000人/年。除甲状腺功能亢进以外，25-50％患有格雷夫斯病的个体病情发展到在临床上累及眼睛，即甲状腺眼病。格雷夫斯眼病(Graves'Ophthalmopathy,GO或TAO)是甲状腺眼病的典型形式。虽然一些GO患者只患有轻微的眼睛不适，但是3-5％患有剧烈疼痛和炎症伴有复视乃至视力丧失。目前由于本病原因未明，临床主要以激素、免疫抑制剂、生长激素类似物、抗甲状腺药物、眶内放射、眼眶减压术等综合治疗为主，但由于种种原因，效果并不尽人意，迄今为止尚无任何一种药物能有效治疗TAO，并获长期缓解。因此，研究治疗甲状腺相关眼病的药物是亟待解决的技术问题。而检测所述疾病更是本领域积极研究的方向。近年来的研究表明，人瘦素蛋白(rh-leptin)对TAO患者眼眶前脂肪成纤维细胞增殖、移行以及细胞分化过程中细胞内脂质形成具有重要的作用。因此，检测人瘦素蛋白的表达情况，可以直接用于鉴定甲状腺相关眼病。然而传统的检测人瘦素蛋白的表达情况具有操作复杂，费时的缺点。核酸适体(Aptamer,又称适配体,适配子)是能高亲和性、高特异性的结合某种生物革El标的单链寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。核酸适体是通过指数富集配体系统进化技术(Systemat1cEvolut1onofL1gandsbyExponent1alenr1chment,SELEX)从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高度特异性结合靶标分子的单链DNA/RNA。已报道核酸适体的靶标包括金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适体的分子识别功能与抗体类似，具有与抗体分子相当甚至更强的靶标识别能力，但与抗体相比具有很多优良的特性，如分子量小，能批量生产，不易失活，无免疫原性、容易合成与标记、快速的穿透组织、良好的代谢动力学、不同批次之间产品不会存在差异和具有很好化学稳定性，在生物检测、疾病诊断治疗等领域具有重要的应用前景。技术实现要素：本发明的目的是提供一种特异结合leptin的核酸适体及其试剂盒。本发明提供的核酸适体，是序列表的序列1-15所示的单链DNA。所述核酸适体与leptin蛋白具有较好的亲和能力。还可将所述核酸适体进行修饰或改造，得到所述核酸适体的衍生物。所述核酸适体的衍生物可为如下任意一种：a)将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；b)将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；c)将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；d)将核酸适体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；e)将所述核酸适体连接上荧光、放射性和治疗性物质后，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。所述核酸适体可用于制备检测leptin的试剂盒。利用本发明的核酸适体，可以捕获血液中的leptin，从而用于甲状腺相关眼病筛查。利用本发明的核酸适体，部分代替单克隆抗体捕获leptin进行检测，具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优点。本发明具有很高的应用价值。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、核酸适体的筛选和制备设计两端包含大约20个核苷酸、中间包括39个核苷酸的随机核酸文库如下：5’-TAGACTATCATGTGACTT(N39)GAGTGCTCGATGCTACTAG-3’；N39代表39个随机核苷酸。将单链DNA文库扩增为双链DNA,产物经2％琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以回收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。75μgRNA文库经硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与2ugleptin蛋白(利用CN100366738C公开的方法，表达得到的目的蛋白)，37℃孵育30min，反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜；然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液(6mol/L尿素，0.55mol/L醋酸铵，l.5mmol/LEDTA,0.15％SDS)中煮沸5min，离心，取上清，无水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20μ1DEPC水中；以RNA为模板RT-PCR扩增双链DNA，体外转录出RNA文库用于下一轮筛选；每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，以该双链DNA为模板体外转录出RNA适配子库，筛选共进行12轮。得到了15个适配子，其序列分别为SEQIDNO:1-15所示。具体序列如下所示：leptin-1：TAGACTATCATGTGACTTCCTTAACTATATACAATTATGTCATATCTTACAAGTACTGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQIDNO:1)leptin-2：TAGACTATCATGTGACTTTACAAGATACATTCATCCCGCAACACACTCAACCAACTCGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQIDNO:2)leptin-3：TAGACTATCATGTGACTTTCTACCTAATAATAACCTATACCTCCCTCAGTAATCACAGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQIDNO:3)leptin-4：TAGACTATCATGTGACTTACCTATTAACTTGTACTCCTACAAACCCAGAACAACACAGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQIDNO:4)leptin-5：TAGACTATCATGTGACTTTCACTGTTAACACAGATAATTAACATAACAACGTCTATAGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQIDNO:5)leptin-6：TAGACTATCATGTGACTTAAACATCCTCCCTATACCTATCCGTATACCGCTTCCTCTGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQIDNO:6)leptin-7：TAGACTATCATGTGACTTAACACCGCCTAATATTAATATCCCCTTCTTCATAGATCAGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQIDNO:7)leptin-8：TAGACTATCATGTGACTTCCGACTTCATACATACTCCTCTTCATCCTGTAATCAACCGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQIDNO:8)leptin-9：TAGACTATCATGTGACTTATATATCCTCCACTTAGATAACAATCTTCAGACACTCCAGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQIDNO:9)leptin-10：TAGACTATCATGTGACTTCCTCCTTCTTCCTCCGATTCATCCTCAATAGATACTATTGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQIDNO:10)leptin-11：TAGACTATCATGTGACTTTTCACGCTCAATCATAAATCTTAGAATCCAATAATTACCGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQIDNO:11)leptin-12：TAGACTATCATGTGACTTCCGCCACTCCTCATCACATCGCCACACCCAAATTCACAAGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQIDNO:12)leptin-13：TAGACTATCATGTGACTTCGCTCCTCTCTTGTTTACTACACATATCTTGTTATCTTAGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQIDNO:13)leptin-14：TAGACTATCATGTGACTTACCTATTCCGCCCTCACCTTCCTCTACTAGATCATAACTGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQIDNO:14)leptin-15：TAGACTATCATGTGACTTATAATTCTATATATATCGCACTACATCAAACGCCATAAAGAGTGCTCGATGCTACTAG(SEQIDNO:15)实施例2蛋白结合适配子的性能测定将RNA适配子分别取2.0μg，用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)37℃消化lh，纯化回收去磷酸化的RNA；通过T4多核苷酸激酶标记[γ-32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。10nmol放射性标记的RNA适配子分别与不同浓度(1-200nM)的leptin37℃孵育30min，各组反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品平行做两次测定。计算各个适配子与leptin的解离常数。结果如下：名称解离常数Kd(单位nM)leptin-110.9leptin-210.8leptin-39.9leptin-410.3leptin-510.5leptin-69.6leptin-79.8leptin-810.0leptin-910.3leptin-109.9leptin-119.8leptin-1210.1leptin-1310.6leptin-149.7leptin-159.7PBS空白对照无结合能力实施例3所述适配子特异性分析以及稳定性分析分别采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，霍乱弧菌VgrG3C蛋白，大肠杆菌外膜蛋白A，Lp-PLA2蛋白,leptin，与14条适配子进行特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都不与这些蛋白相结合，而只与leptin结合保持较高的特异性。将所述的适配子，取0.2ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置二周。通过RT-PCR检测，发现二周的放置其结构稳定，没有被降解。实施例4所述适配子疾病的诊断将14个适配子分别与12个格雷夫斯眼病患者以及正常人的血液混合30min，通过生物素分离，定量分析其中的leptin蛋白的含量，通过分析发现，12个格雷夫斯眼病患者中leptin蛋白的含量相对于正常人显著增加2倍。以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表〈110〉李倩〈120〉一种用于检测眼科疾病的试剂盒及其检测方法〈160〉15〈210〉1〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉leptin-1：TAGACTATCATGTGACTTCCTTAACTATATACAATTATGTCATATCTTACAAGTACTGAGTGCTCGATGCTACTAG〈210〉2〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉leptin-2：TAGACTATCATGTGACTTTACAAGATACATTCATCCCGCAACACACTCAACCAACTCGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQIDNO:2）〈210〉3〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉leptin-3：TAGACTATCATGTGACTTTCTACCTAATAATAACCTATACCTCCCTCAGTAATCACAGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQIDNO:3）〈210〉4〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉leptin-4：TAGACTATCATGTGACTTACCTATTAACTTGTACTCCTACAAACCCAGAACAACACAGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQIDNO:4）〈210〉5〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉leptin-5：TAGACTATCATGTGACTTTCACTGTTAACACAGATAATTAACATAACAACGTCTATAGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQIDNO:5）〈210〉6〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉leptin-6：TAGACTATCATGTGACTTAAACATCCTCCCTATACCTATCCGTATACCGCTTCCTCTGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQIDNO:6）〈210〉7〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉leptin-7：TAGACTATCATGTGACTTAACACCGCCTAATATTAATATCCCCTTCTTCATAGATCAGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQIDNO:7）〈210〉8〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉leptin-8：TAGACTATCATGTGACTTCCGACTTCATACATACTCCTCTTCATCCTGTAATCAACCGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQIDNO:8）〈210〉9〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉leptin-9：TAGACTATCATGTGACTTATATATCCTCCACTTAGATAACAATCTTCAGACACTCCAGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQIDNO:9）〈210〉10〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉leptin-10：TAGACTATCATGTGACTTCCTCCTTCTTCCTCCGATTCATCCTCAATAGATACTATTGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQIDNO:10）〈210〉11〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉leptin-11：TAGACTATCATGTGACTTTTCACGCTCAATCATAAATCTTAGAATCCAATAATTACCGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQIDNO:11）〈210〉12〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉leptin-12：TAGACTATCATGTGACTTCCGCCACTCCTCATCACATCGCCACACCCAAATTCACAAGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQIDNO:12）〈210〉13〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉leptin-13：TAGACTATCATGTGACTTCGCTCCTCTCTTGTTTACTACACATATCTTGTTATCTTAGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQIDNO:13）〈210〉14〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉leptin-14：TAGACTATCATGTGACTTACCTATTCCGCCCTCACCTTCCTCTACTAGATCATAACTGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQIDNO:14）〈210〉15〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉leptin-15：TAGACTATCATGTGACTTATAATTCTATATATATCGCACTACATCAAACGCCATAAAGAGTGCTCGATGCTACTAG（SEQIDNO:15）当前第1页1 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