一种检测胰岛素的高通量核酸适体传感器及其制备方法与流程

本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种检测胰岛素的高通量核酸适体传感器及其制备方法。

背景技术：

糖尿病是威胁人类健康的重大代谢性疾病，可引起一系列代谢紊乱和并发症(如糖尿病酮症酸中毒、心血管疾病、肾脏、眼病、神经病变、视网膜病变及糖尿病足)。实施血糖检测可以更好的掌控糖尿病患者的血糖变化，降低糖尿病并发症的风险，提高患者的生活质量，改善身体状况。现在常规检测血糖的产品即是便携式血糖仪，只能对单一目标物血糖(葡萄糖)进行检测，难以应用于不同类型目标物的检测，这大大限制了这些便携式仪器即时检测的应用范围。

糖尿病是体内胰岛素的分泌不足或者身体对胰岛素的利用障碍引起的，因此，获取患者的血液胰岛素水平，将糖尿病疾病防治中心前移，坚持以预防为主，在胰岛素水平出现异常初期对患者采取有针对性的治疗措施，降低糖尿病的发病率；同时有助于医生进一步了解患者高血糖的发病原因，避免由于治疗手段单一而引起的误诊、诊治时机的延误等，提高糖尿病的诊治水平，降低糖尿病患者并发症的患病率，提高患者的生活质量。同时，血液胰岛素水平的快速测定，对胰岛素瘤和胰岛素抵抗综合征等有关疾病的早期诊断、疗效观察、发病机理及临床和基础研究也具有重要的价值。

目前,常规胰岛素检测方法主要有放射免疫法、化学发光免疫分析法、电化学分析法、荧光光谱法、质谱分析法和表面等离子体共振法，在众多测试方法中放射免疫法和化学发光免疫分析法实验步骤复杂，检测周期长，对操作者及仪器设备等要求高，不适合于现场快速检测。虽然电化学分析法由于具有灵敏度高、实时快速响应、成本低、小型化、易于构建便携设备用于现场检测，但由于胰岛素在电极表面的存在直接氧化效率低、电极表面易于钝化等缺点，电化学检测方法的发展受到制约。采用纳米材料修饰电极检测胰岛素所制备的传感器具有灵敏度高、检测下限低、稳定性好、制备方法简单、材料安全性高等优点。但也存在一个明显的氧化峰电位较高问题，基本都在0.6-0.8V之间，对于电化学传感器来说，过高的氧化电位容易引起样品溶液中其它电活性物质，如抗坏血酸、尿素和乙酰氨基酚等的严重干扰，影响胰岛素在实际样品测量过程中的准确性。采用荧光和质谱的检测方法，结合核酸适体的高亲和性与高选择性优点，所制备传感器检测灵敏，制备方法简单，但同样存在着操作仪器价格昂贵，不利于现场快速便携检测的特点。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是胰岛素在检测过程中存在的检测时间长、操作复杂等，公开了一种检测胰岛素的高通量核酸适体传感器及其制备方法。

为解决上述问题，本发明采用以下技术方案：

一种检测胰岛素的高通量核酸适体传感器，在微孔板上固定结合纳米金颗粒，然后加入胰岛素核酸适体，纳米金颗粒与胰岛素核酸适体通过Au-S键结合在微孔板上，同时在纳米金颗粒上固定蔗糖酶及与胰岛素核酸适体部分互补的DNA互补链，胰岛素核酸适体与DNA互补链根据碱基配对原则形成稳定的双链结构，制成DNA互补链/蔗糖酶/纳米金检测探针，将DNA互补链/蔗糖酶/纳米金检测探针固定到胰岛素核酸适体的纳米金微孔板中，得到检测胰岛素的高通量核酸适体传感器。

所述胰岛素核酸适体的5’端修饰有巯基，序列如5’-SH-(CH₂)₆-ACA GGG GTG TGG GGA CAG GGG TGT GGG G-3’所示，DNA互补链的5’端修饰有巯基，序列如5’-SH-(CH₂)₆-ACA GCA TTC AGC GCA TCG G-3’所示。

一种检测胰岛素的高通量核酸适体传感器的制备方法，制备步骤如下：

(1)纳米金与微孔板的准备：微孔板在15-17mol/L HNO₃溶液中处理2h，用双蒸水冲洗2-3次后，把80-120μL表面羧基功能化的纳米金溶液加入微孔板中，然后将微孔板置于培养箱中，37℃培育24h，最后用双蒸水冲洗2-3次，制得纳米金微孔板；

(2)蔗糖酶修饰纳米金的准备：把2mg/mL的蔗糖酶和2mg/mL互补链DNA加入到纳米金中制得混合物，于4℃下保存6h，向混合物中加入100μL浓度为10mmol/L PBS缓冲液，将混合物放在振荡培养箱中，37℃下培育16h后，14000rpm离心20min，倒掉离心后的上清液，用10mmol/L PBS缓冲液冲洗掉未结合的蔗糖酶和互补链DNA，剩余的离心底物于1mL浓度为10mmol/L PBS缓冲液中4℃保存，完成互补链DNA/酶/纳米金探针的制备；

(3)核酸适体的固定：以TCEP为溶剂配制10μmol/L的胰岛素核酸适体溶液，黑暗处理1h激活，取200μL胰岛素核酸适体溶液加入到纳米金微孔板上，于37℃黑暗培育16-24小时，加入50μL巯基乙醇，继续37℃黑暗培育1h，将胰岛素核酸适体固定于纳米金微孔板，最后用50μL浓度为10mmol/L PBS缓冲液冲洗2-4次；

(4)核酸适体传感器的配制：将100μL的DNA/酶/纳米金探针加入到固定有胰岛素核酸适体的纳米金微孔板中，37℃振荡培育2h，并用100μL浓度为10mmol/L PBS缓冲液冲洗2-4次，完成胰岛素核酸适体传感器的配制。

一种检测胰岛素的高通量核酸适体传感器与血糖仪结合作为快速准确检测胰岛素的应用。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明针对胰岛素检测当前存在的系列问题，综合纳米偶联体-核酸适体技术，血糖仪检测技术等，构建用以快速灵敏检测胰岛素的传感新方法，并与血糖检测指标集成一体用于糖尿病的早期诊断与预防，将糖尿病疾病防治中心前移，降低糖尿病及其并发症的发病率；同时对胰岛素瘤和胰岛素抵抗综合征等有关疾病的早期诊断、疗效观察、发病机理及临床和基础研究也具有重要的价值。

(2)与现有技术相比，本发明利用血糖仪这种已经广泛商业化的产品具有便携、简单、操作方便等优点，同时可将核酸适配体分子识别体系在生物医学领域的应用潜力变成现实，可以真正实现在事故地点或其他场合进行简便、实时地检测，因此具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为利用血糖仪检测胰岛素的高通量核酸适体传感器检测原理图。

图2为响应时间曲线图。

图3为胰岛素浓度标准曲线图。

具体实施方式

本发明中胰岛素特异性适体Aptamer，序列如5’-SH-(CH₂)₆-ACA GGG GTG TGG GGA CAG GGG TGT GGG G-3’所示；互补链序列如5’-SH-(CH₂)₆-ACA GCA TTC AGC GCA TCG G-3’所示；所用试剂：PBS缓冲液，10mmol/L，PH7.4(Na₂HPO₄，10mmol/L；KH₂PO₄，2mmol/L；NaCl，137mmol/L；KCl，2.7mmol/L)；Tris-醋酸缓冲液，10mmol/L，PH 5.2；TCEP，2.5mmol/L；巯基乙醇，1mmol/L；TCEP和巯基乙醇用Tris-醋酸缓冲液配制。蔗糖酶：用PBS配制成2mg/mL；蔗糖，1mol/L，用PBS配制；浓硝酸，纯度为65％-68％，浓度为16mol/L；实验用水是电阻为18.2MΩ的超纯水。

(1)纳米金与96微孔板的准备

首先，96微孔板用50μL 16mol/L HNO₃处理2h，后用双蒸水冲洗3次，把100μL纳米金溶液(直径20nm)加入96微孔板中，把96微孔板放入振荡培养箱中，37℃下培育24h，取出后用100μL双蒸水冲洗2次。

(2)蔗糖酶修饰纳米金的准备

把500μL 2mg/mL的蔗糖酶和500μL 2mg/mL DNA加入到1mL AuNPs混合，在4℃下保存6h；在混合物中加入100μL(用PBS配置成0.5μmol/L的缓冲液)，将混合物放在振荡培养箱中37℃下培育16h后，在室温下用离心机将其离心20min，14000rpm；将离心后的上清液倒出，用PBS缓冲液冲洗掉未结合的蔗糖酶和DNA。剩余的离心底物在1mL PBS缓冲液中4℃保存，这种修饰过的纳米金可以在两个月内保持稳定。此处得到的便是DNA互补链/蔗糖酶/纳米金探针。

(3)Aptamer的固定

将Aptamer用TCEP稀释至10μmol/L，激活放在黑暗无光处1h后，取200μL Aptamer加入到AuNPs(96微孔板)，在37℃黑暗无光条件下培育超过16h后，加入50μL巯基乙醇将其固定，继续在37℃下培育1h，然后把Aptamer和用纳米金修饰的96微孔板用50μL的PBS缓冲液冲洗3次。

(4)胰岛素的检测

将100μL的DNA互补链/蔗糖酶/纳米金探针加入到固定有Aptamer和纳米金的96微孔板中，96微孔板在振荡培养箱中37℃下培育2h，用100μL PBS缓冲液冲洗3次；之后分别加入100μL用PBS缓冲液配制的不同浓度的胰岛素溶液(0.1μmol/L，0.2μmol/L，0.5μmol/L，1μmol/L，2μmol/L，4μmol/L，6μmol/L，8μmol/L，10μmol/L，12μmol/L)，在37℃黑暗无光条件下培育2h。孵育完成后，把微孔板中的上清液吸出，用10μL的PBS冲洗微孔板两次，将吸出液和冲洗液同时放入离心管内，加入30μL 1mol/L蔗糖，37℃下培育1h，从得到溶液中取出2μL用罗氏血糖仪检测其浓度。根据公式y＝0.1+0.034x，计算得出胰岛素的浓度，如表1所示，根据偏差得出本发明的检测方法准确。

考察了特异响应时间影响，在此实验中，Aptamer与纳米金的结合时间、DNA/蔗糖酶/纳米金探针的形成时间都比较长，很难直接从实验的最终结果表征出它们结合效果的好坏，但胰岛素与适体的响应时间会直接影响结果的测定。如图2所示为响应时间对胰岛素浓度的影响，该图中我们选取的胰岛素浓度为300μmol/L，当响应时间低于120min时，血糖仪检测信号随着时间增加而不断增大；当响应时间等于2h，检测信号达到最大值；时间低于180min时，检测信号保持稳定；当响应时间大于180min后，检测信号反而开始下降，这是由于响应时间过长，胰岛素很难在长时间内保持性质稳定，且适体与胰岛素结合后也有可能与互补链发生作用立的争夺，而导致胰岛素的结合的适体量减少。因此我们确定在本实验中胰岛素与适体的响应时间应控制在120-180min之间，时间过长或者过短都会影响实验结果的准确性。

进一步，获得了传感器的响应特性，如图3所示，得到目标物胰岛素的浓度在0.1μmol/L-10μmol/L范围内，溶液中的葡萄糖浓度(y)和胰岛素的浓度(x)有良好的线性关系，线性回归方程为y＝0.1+0.034x，相关系数R＝0.9758，检出限为0.1μmol/L。