一种荧光寿命测量方法及系统与流程

本发明涉及荧光寿命测量技术领域，特别是涉及一种荧光寿命测量方法及系统。

背景技术：

荧光寿命是指荧光分子停留在激发态的平均时间，其不仅与分子自身的结构有关，而且与分子所处的微环境的极性、粘度等条件有关。因此通过测量荧光寿命可以直接了解荧光分子所处环境的变化，在生物物理，生物化学及临床医学诊断等方面有着广泛的应用。

荧光寿命的测量包括两种实现方法：时域法和频域法。与时域法相比，频域法硬件成本低，测量效率高，能在某一特定频率快速得到样品的荧光寿命，具有良好的应用前景。其中，频域外差法的荧光调制度高，信噪比强，是目前频域法的主流技术。但是，现有采用的频域外差法存在这样的问题，调制像增强器增益的信号的频率需要接近激发光的高调制频率，这对像增强器的技术要求比较高。

技术实现要素：

鉴于此，本发明提供一种荧光寿命测量方法及系统，采用低频方波信号调制光电倍增管的增益，与现有技术相比可放宽对像增强器的要求。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种荧光寿命测量方法，包括：

以激发光照射样品，由光电倍增管接收样品产生的荧光，所述激发光的调制信号为频率为fE的余弦信号,并以频率为fH0的方波信号X(t)调制光电倍增管的增益电压，其中：

TH0为方波信号X(t)的最小正周期，TH0＝1/fH0，TH1为方波信号为高电平时对应时域带宽的一半，fH0<<fE；

样品产生的荧光经过所述光电倍增管后，由荧光屏接收获得第一图像，采用光电探测器采集所述第一图像，获得第二图像；

以下述方程式描述所述第二图像，对所述方程式进行傅里叶变换，计算得到去调制度和相位差，根据所述去调制度和所述相位差计算样品产生荧光的荧光寿命，所述方程式为：

其中，x,y表示空间坐标，AE为激发光的直流分量，BE为激发光的交流分量的幅值，AF为样品产生荧光的直流分量，Δf＝fHk-fE，fHk为方波信号X(t)的第k次谐波分量的频率，k为大于零的正整数，m(x，y，fE)表示去调制度，δ(x，y，fE)表示相位差。

可选地，所述以激发光照射样品，包括：

以频率为fE的余弦信号调制发光二极管产生激发光，以所述激发光照射样品。

可选地，所述激发光描述为：

其中，AE为激发光的直流分量，BE为激发光的交流分量的幅值。

可选地，样品产生的荧光描述为：

其中，x,y表示空间坐标，AF为样品产生荧光的直流分量，m(x，y，fE)表示去调制度，δ(x，y，fE)表示相位差。

可选地，所述采用光电探测器采集所述第一图像，获得第二图像包括：

采用光电探测器采集所述第一图像，并经滤波处理后，获得所述第二图像。

可选地，根据所述去调制度和所述相位差计算样品产生荧光的荧光寿命包括：根据以下计算式计算样品产生荧光的荧光寿命：

其中，

可选地，采用像增强器接收样品产生的荧光，样品产生的荧光进入所述像增强器，经光电阴极转换成电信号，电信号经过所述像增强器的微通道板后，由荧光屏接收。

一种荧光寿命测量系统，包括第一信号源、激发光源、第二信号源、光电倍增管和荧光屏、光电探测器和数据处理器；

所述第一信号源用于产生频率为fE的余弦信号，调制激发光源；

所述激发光源用于产生激发光照射样品；

所述第二信号源用于产生频率为fH0的方波信号X(t)调制光电倍增管的增益电压，其中：

TH0为方波信号X(t)的最小正周期，TH0＝1/fH0，TH1为方波信号为高电平时对应时域带宽的一半，fH0<<fE；

所述光电倍增管用于接收样品产生的荧光，荧光经所述光电倍增管后由所述荧光屏接收得到第一图像；

所述光电探测器用于采集所述第一图像获得第二图像；

所述数据处理器用于以下述方程式描述所述第二图像，对所述方程式进行傅里叶变换，计算得到去调制度和相位差，根据所述去调制度和所述相位差计算样品产生荧光的荧光寿命，所述方程式为：

其中，x,y表示空间坐标，AE为激发光的直流分量，BE为激发光的交流分量的幅值，AF为样品产生荧光的直流分量，Δf＝fHk-fE，fHk为方波信号X(t)的第k次谐波分量的频率，k为大于零的正整数，m(x，y，fE)表示去调制度，δ(x，y，fE)表示相位差。

可选地，所述激发光源为发光二极管。

可选地，所述光电探测器包括CCD相机或者CMOS相机。

由上述技术方案可知，本发明所提供的一种荧光寿命测量方法及系统，由调制信号采用频率为fE的余弦信号的激发光照射样品，激发样品产生荧光，产生的荧光由光电倍增管接收，并以频率为fH0的方波信号调制光电倍增管的增益电压，其中fH0<<fE；样品产生的荧光经过光电倍增管，受低频方波信号的谐波分量调制，形成混频信号由荧光屏接收，获得第一图像，采用光电探测器采集第一图像获得第二图像，进一步根据第二图像计算样品产生荧光的荧光寿命。

与现有技术相比，本发明荧光寿命测量方法及系统，采用低频方波信号来对光电倍增管的增益电压进行调制，因此可放宽对像增强器的技术要求。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的一种荧光寿命测量方法的流程图；

图2为本发明实施例中采用的激发光调制信号的波形图；

图3为本发明实施例中采用的方波信号的波形图；

图4为本发明实施例中得到的差频图像信号的波形图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

本发明实施例提供一种荧光寿命测量方法，包括：

以激发光照射样品，由光电倍增管接收样品产生的荧光，所述激发光的调制信号为频率为fE的余弦信号,并以频率为fH0的方波信号X(t)调制光电倍增管的增益电压，其中：

TH0为方波信号X(t)的最小正周期，TH0＝1/fH0，TH1为方波信号为高电平时对应时域带宽的一半，fH0<<fE；

样品产生的荧光经过所述光电倍增管后，由荧光屏接收获得第一图像，采用光电探测器采集所述第一图像，获得第二图像；

以下述方程式描述所述第二图像，对所述方程式进行傅里叶变换，计算得到去调制度和相位差，根据所述去调制度和所述相位差计算样品产生荧光的荧光寿命，所述方程式为：

其中，x,y表示空间坐标，AE为激发光的直流分量，BE为激发光的交流分量的幅值，AF为样品产生荧光的直流分量，Δf＝fHk-fE，fHk为方波信号X(t)的第k次谐波分量的频率，k为大于零的正整数，m(x，y，fE)表示去调制度，δ(x，y，fE)表示相位差。

可以看出，本实施例荧光寿命测量方法，由调制信号为频率为fE的余弦信号的激发光照射样品，激发样品产生荧光，产生的荧光由光电倍增管接收，并以频率为fH0的方波信号调制光电倍增管的增益电压，其中fH0<<fE；样品产生的荧光经过光电倍增管，受低频方波信号的谐波分量调制，形成混频信号由荧光屏接收，获得第一图像，采用光电探测器采集第一图像获得第二图像，进一步根据第二图像计算样品产生荧光的荧光寿命。与现有技术相比，本发明荧光寿命测量方法，采用低频方波信号来对光电倍增管的增益电压进行调制，因此可放宽对像增强器的技术要求。

下面对本实施例荧光寿命测量方法进行详细说明。请参考图1，本实施例提供的荧光寿命测量方法，包括以下步骤：

S10：以激发光照射样品，由光电倍增管接收样品产生的荧光，所述激发光的调制信号为频率为fE的余弦信号,并以频率为fH0的方波信号X(t)调制光电倍增管的增益电压。

具体的，可以第一信号源输出频率为fE的余弦信号，调制激发光源产生激发光，照射样品。激发光源可采用发光二极管。产生的激发光描述为：

其中，AE为激发光的直流分量，BE为激发光的交流分量的幅值。

激发光E(t)照射到样品产生荧光，样品产生的荧光可描述为：

其中，x,y表示空间坐标，AF为样品产生荧光的直流分量，m(x，y，fE)表示荧光的去调制度，δ(x，y，fE)表示荧光的相位差。

本实施例中由光电倍增管接收样品产生的荧光，具体可采用像增强器接收样品产生的荧光。

同时，以另一信号源输出频率为fH0的方波信号X(t)，对像增强器微通道板的增益电压进行调制，方波信号X(t)描述为：

TH0为方波信号X(t)的最小正周期，TH0＝1/fH0，TH1为方波信号为高电平时对应时域带宽的一半，方波信号X(t)的占空比为2TH1/TH0。

请参考图2和图3，图2为本实施例中采用的激发光调制信号的波形图，图3为本实施例中采用的方波信号的波形图，本实施例中激发光的调制信号为高频信号，该方波信号为低频信号，fH0<<fE。在本实施例荧光寿命测量方法的一种具体应用中，采用的激发光调制信号的频率fE＝60MHz，方波信号X(t)的频率fH0＝(1M+1K)Hz，其占空比2TH1/TH0＝0.475。

对于方波信号X(t)，对其进行傅里叶展开，第k次谐波分量Rk(t)描述为：

在该式中，fHk为方波信号X(t)的第k次谐波分量的频率，满足fHk＝k fH0，k∈Z且k≠0。

S11：样品产生的荧光经过所述光电倍增管后，由荧光屏接收获得第一图像，采用光电探测器采集所述第一图像，获得第二图像。

样品产生的荧光进入像增强器，经光电阴极转换成电信号，经过微通道板过程中，在方波信号X(t)第k次谐波分量的调制下，形成混频信号；混频信号由像增强器荧光屏接收。得到外差图像，即第一图像。第一图像可描述为：

采用光电探测器采集第一图像P(x，y，t)的低频分量，并经滤波处理后得到差频图像，即第二图像，可参考图4，图4为一种实施例中得到的差频图像信号的波形图。

S12：以下述方程式描述所述第二图像，对所述方程式进行傅里叶变换，计算得到去调制度和相位差，根据所述去调制度和所述相位差计算样品产生荧光的荧光寿命，所述方程式为：

其中，x,y表示空间坐标，Δf＝fHk-fE，fHk为方波信号X(t)的第k次谐波分量的频率，Δf满足Δf＜＜fE，且Δf≠0。

示例性的，在本实施例测量方法的一种具体应用中，采用的激发光调制信号的频率fE＝60MHz，方波信号X(t)的频率fH0＝(1M+1K)Hz，其中Δf＝60KHz，故取k＝60。

对上述方程式进行傅里叶变换，得到去调制度m(x，y，fE)和相位差δ(x，y，fE)：

其中Im和Re分别表示求虚部和求实部。

根据所述去调制度和所述相位差计算样品产生荧光的荧光寿命，具体根据以下计算式计算：

其中，

本发明荧光寿命测量方法，基于外差高次谐波调频实现荧光寿命的测量，其中对光电倍增管增益的调制频率较低，与现有的频域法测量技术相比，使得对像增强器的重复频率技术指标要求放宽。采用该测量方法在测量多组分荧光样品时，无需更改像增强器增益的调制频率，可以实现荧光样品中各个组分的最优寿命测量，在实际应用中可提高实验效率。并且，本发明荧光寿命测量方法继承了频域荧光寿命测量方法效率高和抗干扰能力强等优点。

相应的，本发明实施例还提供一种荧光寿命测量系统，包括第一信号源、激发光源、第二信号源、光电倍增管和荧光屏、光电探测器和数据处理器；

所述第一信号源用于产生频率为fE的余弦信号，调制激发光源；

所述激发光源用于产生激发光照射样品；

所述第二信号源用于产生频率为fH0的方波信号X(t)调制光电倍增管的增益电压，其中：

TH0为方波信号X(t)的最小正周期，TH0＝1/fH0，TH1为方波信号为高电平时对应时域带宽的一半，fH0<<fE；

所述光电倍增管用于接收样品产生的荧光，荧光经所述光电倍增管后由所述荧光屏接收得到第一图像；

所述光电探测器用于采集所述第一图像获得第二图像；

所述数据处理器用于以下述方程式描述所述第二图像，对所述方程式进行傅里叶变换，计算得到去调制度和相位差，根据所述去调制度和所述相位差计算样品产生荧光的荧光寿命，所述方程式为：

其中，x,y表示空间坐标，AE为激发光的直流分量，BE为激发光的交流分量的幅值，AF为样品产生荧光的直流分量，Δf＝fHk-fE，fHk为方波信号X(t)的第k次谐波分量的频率，k为大于零的正整数，m(x，y，fE)表示去调制度，δ(x，y，fE)表示相位差。

可以看出，本实施例荧光寿命测量系统，由调制信号采用频率为fE的余弦信号的激发光照射样品，激发样品产生荧光，产生的荧光由光电倍增管接收，并以频率为fH0的方波信号调制光电倍增管的增益电压，其中fH0<<fE；样品产生的荧光经过光电倍增管，受低频方波信号的谐波分量调制，形成混频信号由荧光屏接收，获得第一图像，采用光电探测器采集第一图像获得第二图像，进一步根据第二图像计算样品产生荧光的荧光寿命。与现有技术相比，本实施例荧光寿命测量系统，采用低频方波信号对光电倍增管的增益电压进行调制，可放宽对像增强器的技术要求。

本实施例中，所述激发光源可采用发光二极管。

可采用像增强器接收样品产生的荧光，样品产生的荧光进入像增强器后，经光电阴极转换成电信号，经过微通道板过程中，在方波信号X(t)的调制下，形成混频信号，由像增强器荧光屏接收。

所述光电探测器可采用电荷耦合图像传感器，如CCD相机；或者采用CMOS相机，或者也可采用其它光电成像设备。

以上对本发明所提供的一种荧光寿命测量方法及系统进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。