一种人类IgG浓度的检测方法与流程

本发明涉及一种人类IgG浓度的检测方法，尤其涉及一种一抗—IgG—(二抗—MSN—酶复合物)三层夹心式结构的构建及其用于人类免疫球蛋白IgG浓度的检测方法；属于生物传感技术领域。

背景技术：

IgG是一种免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)，是血清主要的抗体成分，约占血清Ig的75％。IgG的功能作用主要在机体免疫中起保护作用，大多数抗菌、抗病毒，能有效地预防相应的感染性疾病。其指标对于诊断某些疾病具有较大意义。

由于IgG较其他类Ig更易扩散到血管外的间隙内，因而在结合补体、增强免疫细胞吞噬病原微生物和中和细菌毒素的能力方具有重要作用，能有效地抗感染。传统的测定IgG的方法有荧光免疫分析、放射免疫法，电化学检测法等。这些检测方法虽然在一定程度上灵敏有效，但对技术要求高，耗时耗力，且对仪器有一定的要求，各自具有一定的局限性。

技术实现要素：

针对现有的传统检测人类IgG的方法存在的不足，本发明的目的是在于提供一种选择性好、灵敏度高、检测限低、检测范围宽的检测人类免疫球蛋白IgG浓度的方法。

为了实现上述技术目的，本发明提供了一种人类IgG浓度的检测方法，该方法包括以下步骤：

1)在介孔NH₂—二氧化硅纳米粒子(MSN)载体上同时修饰葡萄糖氧化酶和二抗Ab₂，得到二抗—MSN—酶复合物；

2)将一抗Ab₁修饰在酶标板的各孔内，再以乙醇胺溶液对酶标板进行封闭，得到一抗Ab₁修饰的酶标板；

3)取一系列不同浓度的标准IgG溶液分别加入至所述一抗Ab₁修饰的酶标板的各孔内进行IgG与一抗Ab₁之间的特异性结合反应，得到结合了IgG的酶标板；

4)将所述二抗—MSN—酶复合物加入至结合了IgG的酶标板的各孔内进行IgG与二抗Ab₁之间的特异性结合反应，得到含一抗—IgG—(二抗—MSN—酶复合物)三层夹心式结构的酶标板；

5)向含一抗—IgG—(二抗—MSN—酶复合物)三层夹心式结构的酶标板的各孔内加入葡萄糖/Fe²⁺混合溶液进行反应后，再加入邻二氮菲显色剂，并检测各孔内溶液的吸光度值；

6)根据检测得到的各孔内溶液吸光度值与对应的标准IgG溶液浓度建立标准曲线；

7)取待测IgG溶液替换标准IgG溶液按3)、4)和5)的步骤进行操作，检测得到吸光度值，依据标准曲线，即得待测IgG溶液的浓度。

优选的方案，在介孔NH₂—二氧化硅纳米粒子载体溶液中加入戊二醛溶液在室温下反应，再加入葡萄糖氧化酶和二抗Ab₂，在3～5℃温度下进行反应，即得二抗—MSN—酶复合物。戊二醛的作用是将葡萄糖氧化酶和二抗Ab₂固定在介孔NH₂—二氧化硅纳米粒子载体上。

优选的方案，先将一抗Ab₁溶液加入至酶标板的各孔内在3～5℃温度下过夜，再将乙醇胺溶液加入至酶标板的各孔内在室温下进行封闭，即得一抗Ab₁修饰的酶标板。更优选的方案，将100μL、10μg/mL的一抗Ab₁溶液加入孔板4℃下过夜，用PBST作为洗涤液洗板2次，每孔加入150μL、1M乙醇胺溶液进行封闭，2～3h后洗板2次。

较优选的方案，二抗Ab₂为山羊抗人IgG抗体。

较优选的方案，一抗Ab₁为小鼠抗人IgG抗体。

较优选的方案，所述介孔NH₂—二氧化硅纳米粒子通过如下方法制备得到：将十六烷基三甲基溴化铵溶于氢氧化钠溶液中后，加入正硅酸乙酯进行水解反应，得到二氧化硅纳米粒子沉淀；将所述二氧化硅纳米粒子沉淀悬浮于甲苯中后，与氨丙基三乙氧基硅烷在氮气保护下，于75～80℃温度下反应11～12h，反应所得产物与NH₄NO₃的乙醇溶液在55～60℃温度下反应2～3h，即得。

优选的方案，3)或4)中的特异性结合反应的条件为：温度为36～37℃，时间为3～5h。

优选的方案，将浓度分别为1pg/mL、5pg/mL、10pg/mL、100pg/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1μg/mL和10μg/mL的一系列标准IgG溶液分别加入一抗Ab₁修饰的酶标板的各孔内，进行特异性结合反应。

优选的方案，葡萄糖/Fe²⁺混合溶液中亚铁离子浓度为0.15～0.16mM、葡萄糖浓度为16～17mg/mL。

优选的方案，吸光度值的检测波长为490nm。

优选的方案，酶标板为96孔聚苯乙烯酶标板。

优选的方案，葡萄糖/Fe²⁺混合溶液为包含葡萄糖和Fe²⁺的醋酸缓冲溶液，醋酸溶液浓度为10mM。葡萄糖在葡萄糖氧化酶催化作用下进行分解，产生H₂O₂与溶液中的Fe²⁺进行氧化还原反应，Fe²⁺被氧化成Fe³⁺。

本发明的方案中，邻二氮菲显色剂与未被过氧化氢氧化的Fe²⁺反应形成橙红色络合物，使溶液显色，有利于通过酶标仪对吸光度进行测定。

优选的方案，2)中，将一抗Ab₁加入至酶标板的各孔内修饰，一抗Ab₁以溶液形式加入，含一抗Ab₁溶液的体积为100μL，浓度为10μg/mL。

优选的方案，5)中的反应条件为：在37℃温度下反应3～5h。

本发明的检测人类IgG浓度的方法以氨基介孔硅球纳米粒子为载体构建一抗—IgG—(二抗—MSN—酶复合物)三层夹心式结构，将其用于检测人类IgG浓度，具有选择性好、灵敏度高、检测限低，且检测范围宽等优点。本发明的技术方案，首先进行氨基介孔硅球的合成，合成的硅球纳米粒子由于带-NH₂基团，能用于结合抗体和酶；将酶标板用一抗进行铺板，用乙醇胺对孔板表面进行封闭，防止在孔板表面发生非特异性吸附；然后在板孔中加入IgG进行反应，铺板一抗能与IgG进行特异性识别并结合；向孔板中加入二抗-MSN-酶复合物，被一抗捕获的IgG能与MSN中二抗发生特异性结合；加入葡萄糖/Fe²⁺溶液，使MSN上的葡萄糖氧化酶催化葡萄糖分解，产生H₂O₂将溶液中的Fe²⁺氧化成Fe³⁺，邻二氮菲与剩余Fe²⁺形成橙红色络合物(Fe(phen)₃)²⁺；设置酶标仪检测波长为490nm，对酶标板各孔吸光度进行检测，吸光度与IgG的浓度呈反比，从而实现IgG溶液浓度的检测。而在传统的ELISA方法中，由于信号分子中酶链接数量不够，通常致使检测灵敏度和检测限受限。而在本发明中合成的介孔硅球表面有丰富的-NH₂，作为载体能够与上百个酶分子共价链接从而提高MSN表面酶和抗体数量，进而将信号放大、提高灵敏度、降低检测限。通过加入不同浓度IgG经酶标仪测量处理后得到标准曲线，该标准曲线为一条直线(如图4)，IgG浓度越大酶标仪测得OD值越小；再加入未知浓度IgG形成夹心式结构测量OD值，将该OD值与标准曲线进行比较得到未知浓度IgG的浓度。本发明的技术方案利用介孔NH₂—二氧化硅纳米粒子含有的大量-NH₂，能结合大量酶以及抗体分子，促进信号放大，增强了灵敏度，降低了检测限。

与现有技术相比，本发明技术方案的优点在于：

(1)本发明的技术方案以氨基介孔硅球纳米粒子为载体构建一抗—IgG—(二抗—MSN—酶复合物)三层夹心式结构，大大增加了抗体和酶载量，且与IgG之间通过特异性结合，促进信号放大，进而提高检测灵敏度，降低检测限，检测范围广。

(2)本发明的技术方案可测浓度为1pg/mL-10μg/mL的IgG，而人类正常细胞中IgG的浓度为9.5～12.5mg/mL，当患变态反应性疾病、自身免疫性疾病、各种感染以及多发性骨髓瘤等时，免疫球蛋白可异常增高。患获得性免疫缺陷综合征等免疫缺损病时免疫球蛋白可异常降低，通过本发明的技术方案对经过稀释后患者血清具有足够的检测灵敏度。

(3)本发明的技术方法检测范围宽，无需借助精密仪器设备，并且可推广至其他传感器，用于对不同蛋白或小分子的浓度进行检测。

附图说明

【图1】为本发明的检测方法的原理示意图；

【图2】为介孔NH₂—二氧化硅纳米粒子的TEM示图；

【图3】为实施例1中不同浓度IgG产生信号的显色图；

【图4】为实施例1中不同浓度IgG对应OD值的标准曲线图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例1

本发明人IgG的检测方法的一种实施例，其原理示意图如图1所示。该检测方法具体包括以下步骤：

(1)介孔NH₂—二氧化硅纳米粒子(MSN)的合成：先将1g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶于480mL水和NaOH(2.00mol/L,3.5mL)混合液中，在80℃条件下搅拌30min使CTAB溶解，快速加入正硅酸乙酯(TEOS)(4.75g，22.83mmol)，反应2h后得到的沉淀悬浮于200mL无水甲苯中，与0.17mL氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)在氮气保护下80℃回流搅拌12h，所得产物与NH₄NO₃0.6％的乙醇溶液60℃回流2h，得到载体NH₂—MSN。

(2)对NH₂—MSN进行修饰二抗和酶：50μL NH₂—MSN溶液加入2950μL、25％戊二醛中室温下反应3h，离心洗涤去掉未反应的戊二醛，再将葡萄糖氧化酶(GOX)与二抗同时加入，(其中m二抗：m GOX＝1:75,)在4℃下反应过夜，次日离心去掉未反应的酶和抗体，得到二抗—MSN—酶。

(3)铺板一抗及封闭：将100μL、10μg/mL的一抗溶液加入孔板4℃下过夜，用PBST作为洗涤液洗板2次，每孔加入150μL、1M乙醇胺溶液进行封闭，2h后洗板2次，得到修饰过一抗的酶标板。

(4)不同浓度人IgG特异性结合：将浓度为1pg/mL、5pg/mL、10pg/mL、100pg/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1μg/mL、10μg/mL的人IgG溶液分别加入酶标板板孔中，37℃水浴反应4h，PBST洗板3次除去未结合上的IgG，得到结合了不同浓度IgG的酶标板孔。

(5)IgG与MSN特异性结合：将100μL稀释4倍的二抗-MSN-酶溶液加入酶标板中，在37℃水浴条件下反应4h，用10mM的醋酸-醋酸钠缓冲溶液洗板3次，除去未反应掉的二抗-MSN-酶，得到一抗—IgG—(二抗—MSN—酶)三层夹心式结构。

(6)葡萄糖/Fe²⁺溶液与MSN反应：向形成三层夹心式结构的酶标板孔中加入含有Fe²⁺的葡萄糖溶液进行反应，其中溶液亚铁离子浓度为0.15mM、葡萄糖浓度为16.8mg/mL，37℃水浴反应10min。

(7)邻二氮菲显色：酶标板中加入20μL、15mM邻二氮菲溶液显色，与剩余Fe²⁺形成橙红色络合物，在490nm波长处用酶标仪测吸光度得到各孔的OD值，然后将各孔的OD值与对应的IgG浓度作标准曲线，得到测量IgG浓度的标准曲线。

(8)实际样品的测量：取5pg/mL、500pg/mL、5ng/mL、50ng/mL人类IgG的血清溶液，加入修饰有一抗的酶标板中，反应完洗板，然后将100μL稀释4倍的二抗-MSN-酶溶液加入酶标板中，在37℃水浴条件下反应4h，用10mM的醋酸-醋酸钠缓冲溶液洗板3次，除去未反应掉的MSN，得到一抗—IgG—(二抗—MSN—酶)三层夹心式结构。加入葡萄糖/Fe²⁺溶液，37℃条件下反应10min，酶标板中加入20μL、15mM邻二氮菲溶液显色，与剩余Fe²⁺形成橙红色络合物，在490nm波长处用酶标仪测吸光度得到OD值，与标准曲线比对得到测量浓度值，测量浓度值与加标浓度值对比得到回收率为96％～103％。

(9)葡萄糖/Fe²⁺溶液与MSN反应:向形成三层夹心式结构的酶标板孔中加入含有Fe²⁺的葡萄糖溶液进行反应，其中溶液亚铁离子浓度为0.15mM、葡萄糖浓度为16.8mg/mL，37℃水浴反应10min。

(10)邻二氮菲显色：酶标板孔中加入20μL、15mM邻二氮菲溶液显色，与剩余Fe²⁺形成橙红色络合物，在490nm波长处测吸光度得到各孔的OD值，然后将该OD值与标准曲线进行对照，即测得所述未知浓度的人类IgG的浓度，该待测IgG的浓度即为标准曲线中测得的OD对应的横坐标浓度值。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。