本发明涉及分子生物学和医学领域，具体涉及一种肿瘤蛋白的检测试剂盒。
背景技术：
癌基因HER-2/neu编码的一种重要的肿瘤表面标记蛋白，在乳腺、卵巢、肺、胃、肝等十余种癌症患者中均显示有过量表达，P185过量表达的患者肿瘤恶性程度高，术后易发生转移和复发，并且对化疗药物治疗具有抗性，因此检测肿瘤抗原P185的表达水平，对多种肿瘤的鉴别诊断、分类预示疗效以及治疗方案的选择均有重要意义，尤其是乳腺癌，P185已是国际公认的一个重要的临床指标。
与检测肿瘤组织中肿瘤蛋白P185的表达相比，检测病人血清中肿瘤蛋白P185的表达简便易行，但是目前国内尚未建立检测患者的血清中P185的试剂盒，因此研发出高灵敏性、高特异性及稳定性的P185检测试剂盒，用于乳腺、卵巢、肺、胃、肝等十余种癌症血清中P185的检测，这对上述肿瘤的筛查、诊断与治疗具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种肿瘤蛋白检测试剂盒，该试剂盒精密性高、稳定性好。
本发明的通过下述技术方案实现：
一种肿瘤蛋白的检测试剂盒，包括肿瘤蛋白P185单克隆抗体、酶标板、阳性对照品、阴性对照品、洗涤液、终止液、辣根过氧化物酶-链亲和素及其显色底物，所述的肿瘤蛋白P185单克隆抗体包括包被在酶标板上的肿瘤蛋白P185单克隆抗体和生物素标记的肿瘤蛋白P185单克隆抗体。
优选，所述的包被在酶标板上的肿瘤蛋白P185单克隆抗体为肿瘤蛋白P185单克隆抗体2D11，所述的生物素标记的肿瘤蛋白P185单克隆抗体为肿瘤蛋白P185单克隆抗体3F9，肿瘤蛋白P185单克隆抗体2D11、3F9的制备步骤如下：
a)以NIH/3T3细胞i.p免疫第一批6～8周的Balb/C雌鼠，得到雌鼠的抗NIH/3T3血清；
b)收集长至汇合的T6-17细胞，用PBS缓冲液洗三次，将上述制备的抗NIH/3T3抗血清用PBS缓冲液以1:20～100稀释，然后取2ml加入T6-17细胞中，在4℃ 条件下温育过夜，期间晃动盛放T6-17细胞的试管8-10次，然后再用PBS缓冲液洗三次，得到悬浮于PBS缓冲液中的T6-17细胞；
c)用上述悬浮于PBS缓冲液中的T6-17细胞i.p免疫第二批6-8周的BaLb/C雌鼠，然后取雌鼠的脾细胞制成细胞悬液；
d)将步骤c得到的细胞悬液与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；
e)用ELISA法从上述融合的细胞中筛选出分泌肿瘤蛋白P185单克隆抗体的杂交瘤细胞，采用有限稀释法对杂交瘤细胞进行克隆化，从而得到两株具有稳定分泌肿瘤蛋白P185单克隆抗体能力的杂交瘤细胞株，分别命名为杂交瘤细胞株2D11、杂交瘤细胞株3F9；
f)将杂交瘤细胞株2D11、3F9分别注入不同的雌鼠体内，收集腹水，将腹水中的抗体纯化，即得肿瘤蛋白P185单克隆抗体2D11、3F9。
优选，所述的洗涤液是由28.8g的Na2HPO4·12H2O、80g的NaCl、3.9g的NaH2PO4·2H2O和50ml的Tween-20加入纯化水溶解定容至100000ml所得。
优选，所述显色底物包括显色液A和显色液B，所述的显色液A是用柠檬酸缓冲液将30％过氧化氢稀释1000倍所得，所述的显色液B为用含20％二甲基亚砜的柠檬酸缓冲液将四甲基联苯胺配制成0.4mg/ml所得。
优选，所述终止液是浓度为2mol/L的硫酸溶液。
优选，所述阳性对照品、阴性对照品分别为人体的P185阳性血清、P185阴性血清。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
本发明在常规酶联免疫吸附试验的基础上，通过生物素与辣根过氧化物酶-链亲和素之间的高度放大作用，建立了一种高灵敏度生物素-亲和素-酶联免疫检测试剂盒，以测定待测样中的肿瘤蛋白表达水平。亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，分子量为68kDa，由4个亚单位组成，对生物素有非常高的亲和力，其结合常数高达1015M-1；所述的生物素很易与抗体等蛋白质以共价键结合，这样结合有酶的辣根过氧化物酶-链亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应的显色底物时发生催化作用而呈色，从而达到检测目标抗原或抗体分子的目的，采用本发明的肿瘤蛋白P185检测试剂盒可以有效、稳定地测定人体血清中的肿瘤蛋白P185水平， 其灵敏度高，测试重复性好。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
以下对肿瘤蛋白检测试剂盒的制备、使用步骤以及使用效果进一步说明：
1、肿瘤蛋白P185检测试剂盒的制备
1)常规器材及试剂的准备：
96孔酶标板、P185阳性血清、P185阴性血清、洗涤液、终止液、辣根过氧化物酶-链亲和素以及显色液A、显色液B，其中P185阳性血清和P185阴性血清的符合率达100％。
2)肿瘤蛋白P185单克隆抗体的制备：
a)收集NIH/3T3细胞i.p免疫第一批6～8周的Balb/C雌鼠，NIH/3T3细胞的每次使用剂量为107/只，每隔两周一次，三次后从雌鼠尾部取血，用ELISA法测血清滴度，将滴度最高的雌鼠再用同量的NIH/3T3细胞进行i.p免疫，七天后从该雌鼠的眼窝取血，即得雌鼠的抗NIH/3T3血清；
b)收集长至汇合的T6-17细胞，采用PBS缓冲液(即磷酸盐缓冲液)洗三次，所述的T6-17细胞为转染Her-2/neu癌基因的NIH/3T3细胞，其膜表面高表达肿瘤蛋白P185，将上述制备的抗NIH/3T3血清用PBS缓冲液以1:50的比例稀释，然后取2ml加入T6-17细胞中，在4℃条件下温育过夜，期间晃动盛放T6-17细胞的试管9次以使细胞悬浮，然后再用PBS缓冲液洗三次，得到悬浮于PBS缓冲液中的T6-17细胞；
c)用上述悬浮于PBS缓冲液中的T6-17细胞i.p免疫第二批6-8周的BaLb/C雌鼠，剂量为107/小只，在第1周、第3周和第6周各一次，第7周从雌鼠的尾部取血，用ELISA法测血清滴度，将滴度最高的雌鼠再用同量的T6-17细胞i.p免疫，三天后取该雌鼠的脾细胞制成细胞悬液；d)将步骤c得到的细胞悬液与骨髓瘤细胞SP2/0混合，并在融合剂PEG的作用下进行细胞融合，所述的骨髓瘤细胞SP2/0由中国科学院上海细胞库提供；
e)用ELISA法从上述融合的细胞中筛选出分泌肿瘤蛋白P185单克隆抗体的杂 交瘤细胞，采用有限稀释法对杂交瘤细胞进行克隆化，从而得到两株具有稳定分泌肿瘤蛋白P185单克隆抗体能力的杂交瘤细胞株，分别命名为杂交瘤细胞株2D11和杂交瘤细胞株3F9，
f)将杂交瘤细胞株2D11和3F9分别注入不同的雌鼠体内，收集腹水，采用ProteanA亲和层析法将腹水中的抗体纯化即得肿瘤蛋白P185单克隆抗体2D11和3F9，纯化抗体的方法也可以采用聚乙二醇沉淀法等常规的方法，肿瘤蛋白P185单克隆抗体2D11和3F9纯化前后的SDS-PAGE分析结果，其中第1泳道为肿瘤蛋白P185单克隆抗体纯化前的SDS-PAGE分析结果，第2泳道为肿瘤蛋白P185单克隆抗体纯化后的SDS-PAGE分析结果，可以看出纯化后的肿瘤蛋白P185单克隆抗体2D11和3F9仅存一条带，说明肿瘤蛋白P185单克隆抗体2D11和3F9已被纯化。肿瘤蛋白单克隆抗体2D11识别抗原的SDS-PAGE及Westernblot分析结果，其中第1泳道为T6-17细胞的培养上清中肿瘤蛋白P185的SDS-PAGE分析结果，其显示仅存一条带，说明T6-17细胞的膜表面高表达P185，第2泳道为本发明制备的肿瘤蛋白P185单克隆抗体2D11与T6-17细胞的培养上清中肿瘤蛋白P185的WEST-BLOT分析结果，其显示也仅有一条带，说明两者有明显的特异性反应。
3)包被96孔酶标板：采用直接吸附法，用pH为9.6的PBS缓冲液将上述制备的肿瘤蛋白P185单克隆抗体2D11稀释至20～100μg/ml，按100μl/孔的加入量加于96孔酶标板中，在温度为2～8℃的条件下放置过夜，然后用洗涤液洗涤，甩干，即得包被有肿瘤蛋白P185单克隆抗体2D11的96孔酶标板。
4)生物素化肿瘤蛋白P185单克隆抗体3F9：
将上述制备的肿瘤蛋白P185单克隆抗体3F9与活化的生物素混合进行标记，透析去除未结合的生物素，即得生物素标记的肿瘤蛋白P185单克隆抗体3F9。2、肿瘤蛋白P185检测试剂盒的使用步骤如下：
1)加样：
在包被有肿瘤蛋白P185单克隆抗体2D11的96孔酶标板上划分阳性对照孔、阴性对照孔、待测样品孔和空白孔共四组检测孔，阳性对照孔中加入P185阳性血清，阴性对照孔中加入P185阴性血清，待测样品孔中加入待测血清，三种样品的加入量均为100μl/孔，然后在酶标板上加盖或者覆膜，在37℃条件下放置 2h后弃去液体，用洗涤液洗涤，甩干；
2)加生物素标记的肿瘤蛋白P185单克隆抗体3F9：
每个检测孔中加入100μl生物素标记的肿瘤蛋白P185单克隆抗体3F9，在37℃条件下放置1h后弃去液体，每个检测孔中加入350μl洗涤液浸泡1～2min，甩干或轻轻地拍干，洗涤、甩干的动作重复3次；
1、加辣根过氧化物酶-链亲和素：
每个检测孔中加入100μl的辣根过氧化物酶-链亲和素，在37℃条件下放置1h后弃去液体，每个检测孔中加入350μl洗涤液浸泡1～2min，甩干或轻轻地拍干，洗涤、甩干的动作重复5次；
3)加显色底物：
在每个检测孔中依次加入显色液A、显色液B各一滴，在37℃条件下避光，显色；
2、加终止液：按照上述显色底物的加入顺序依次在每个检测孔中加入50μl终止液，终止反应，终止反应的表现为检测孔中的液体由蓝色快速转变成黄色；
3、结果检测：
在加入终止液后15min内，用酶联仪在450nm的波长条件下检测每个检测孔的光密度OD值，检测试剂盒的检测标准为：待测血清的OD值是P185阴性血清的OD值的2.1倍以上时，检测样判为阳性，否则检测样判为阴性。经检测，本发明制备的包被96孔酶标板的变异系数CV值小于10％，对同一批次及不同批次的检测试剂盒进行试验测试，测试结果显示批内及批间的试剂盒的CV值均小于15％，说明本发明的肿瘤蛋白P185检测试剂盒具有高精密性。
3、本发明制备的杂交瘤细胞株2D11、3F9的特性的检定结果：
1)分泌抗体的稳定性：经检测，制备得到的杂交瘤细胞株连续克隆后分泌的单克隆抗体阳性率达100％，在体外传代3个月以上得到的杂交瘤细胞株仍能保持稳定的分泌抗体。
2)细胞核学特征：经检测，上述制备的杂交瘤细胞的核型符合人体的肿瘤细胞分裂中期的染色体核型。
3)支原体检测：采用常规的DNA荧光染色法对杂交瘤细胞株2D11、3F9的 支原体进行检测，具体将vero细胞接种到置于小培养皿中的盖玻片上，在37℃的培养箱中静置24h，采集贴壁或半贴壁的杂交瘤细胞，用无抗生素的培养液传代，3～4天后，杂交瘤细胞呈连续单层生长，长至60％左右汇合，取100μl培养液滴入上述vero细胞的小培养皿中，在37℃条件下培养，3～4天后，用D-hanks平衡盐溶液洗涤小培养皿中的盖玻片，再用固定液固定两次，两次固定时间分别为5min、10min，之后将盖玻片置于小染色缸中，用Hoechst33258染液染色30min，干燥，用封片液封片，最后在荧光显微镜下观察，细胞核外无细小荧光亮点，表明本发明制备的杂交瘤细胞株2D11、3F9均为支原体阴性。4、使用本发明的肿瘤蛋白P185检测试剂盒的临床实验报告：对122例乳腺癌、120例胃癌肿瘤患者及110例正常献血员的肿瘤蛋白P185进行检测，同时，将阳性肿瘤患者的肿瘤组织进行石蜡包埋，免疫组化，然后对阳性肿瘤患者免疫组化的肿瘤组织中的肿瘤蛋白P185进行检测，经t检验，乳腺癌患者组和胃癌患者组的血清中的肿瘤蛋白P185水平均与正常对照组(即献血员组)的血清中的肿瘤蛋白P185水平有显著差异(P<0.05)；
经χ2检验，乳腺癌患者组的血清中肿瘤蛋白P185水平与其肿瘤组织中肿瘤蛋白p185水平高度相关，胃癌患者组的血清中肿瘤蛋白P185水平与与其肿瘤组织中肿瘤蛋白p185水平高度相关(P<0.01)。
为进一步验证患者血清中肿瘤蛋白P185水平与与其肿瘤组织中肿瘤蛋白p185水平高度相关，本发明对四个患者的肿瘤标本进行免疫组织化学法染色分析，采用的是0-3+评分系统，评分标准是0分，1+分，2+分，3+分，其中0分结果显示为阴性，1+、2+和3+分结果显示为阳性，将这四个患者的血清用本发明的检测试剂盒进行肿瘤蛋白P185检测，结果显示，0分肿瘤标本来源的血清OD450为0.296ng/ml(即测波长为450nm条件下样本显色的OD值)，1+分肿瘤标本来源的血清OD450为0.71ng/ml，2+分肿瘤标本来源的血清OD450为1.0ng/m，3+分肿瘤标本来源的血清OD450为2.0ng/ml，说明患者血清中的肿瘤蛋白p185水平与其免疫组化组织中的肿瘤蛋白p185水平高度相关。5、本发明的肿瘤蛋白P185检测试剂盒的稳定性性检测：
1)将各试剂在37℃条件下放置3天；
2)在96孔酶标板上划分10个阳性对照孔和10个阴性对照孔，阳性对照孔中 加入P185阳性血清，阴性对照孔中加入P185阴性血清，样品的加入量均为100μl/孔，然后在酶标板上加盖，在37℃条件下放置1h后弃去液体，用洗涤液洗涤3次，甩干；
3)向每个对照孔加入100μl生物素标记的肿瘤蛋白P185单克隆抗体3F9，在37℃条件下放置1h后弃去液体，每个检测孔中加入350μl洗涤液浸泡1～2min，甩干或轻轻地拍干，洗涤、甩干的动作重复3次，每次3分钟；
4)每个对照孔中加入100μl的辣根过氧化物酶-链亲和素，在37℃条件下放置1h后弃去液体，每个检测孔中加入350μl洗涤液浸泡1～2min，甩干或轻轻地拍干，洗涤、甩干的动作重复3次，每次3分钟；
5)在每个对照孔中依次加入显色液A、显色液B各一滴，在37℃条件下避光，显色；
6)按照上述显色液的加入顺序依次在每个对照孔中加入50μl终止液，终止反应；
7)在加入终止液后15min内，用酶联仪在450nm的波长条件下检测每个对照孔的光密度OD值，经检测，P185阳性血清的OD值是P185阴性血清的2.1以上，10个阳性对照孔中的P185阳性血清以及10个阳性对照孔中的P185阳性血清的符合率均达100％，说明本发明的肿瘤蛋白P185检测试剂盒具备高稳定性。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。