SR‑A作为类风湿关节炎诊断标志物及干预靶点的应用的制作方法

本发明涉及临床医学技术领域，特别是涉及A类清道夫受体(SR-A)蛋白作为类风湿关节炎诊断标记物及干预靶点的应用。

背景技术：

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是以对称性多关节炎为主要表现的慢性、进行性、侵蚀性的系统自身免疫疾病。全世界类风湿关节炎的患病率约为1％，成年人的发病率为0.03％。在我国该病的患病率为0.24％～0.4％，患病人数约为500万，相当于一座中等城市人口。未经正规治疗致残率达75％。

RA的病变特点为侵蚀性滑膜炎，以及由此造成的关节软骨和骨质破坏，最终导致关节畸形。该病如不能及时诊断和治疗可发展为关节僵直、畸形从而严重影响生活质量。在2006年进行的第二次全国残疾人抽样调查中，致残性关节病在导致肢体残疾的21类病因中位列第二位(20.1％)，仅次于脑血管病(20.6％)，其中79.4％为类风湿关节炎致残。RA病情进展迅速，骨质破坏在第1年中最快，因此针对RA的准确诊断及治疗至关重要。

对于RA的诊断，主流仍然是使用美国风湿病学院1987年拟定的一套标准，主要靠临床表现以及排除其他关节炎从而判断是否为RA，另外，X线改变和类风湿因子也是判断RA的常用标准。但上述方法操作繁琐且特异性不高，容易拖延确诊时间。

对于RA诊断方面的研究，在分子水平上取得了一些进展，例如使用磷酸甘油激酶1(中国专利公开号CN104698194A)、生腱蛋白C(中国专利公开号CN104105967A)、microRNA(miRNA)分子标记物(中国专利公开号CN103805696A)，以及自身抗体结合抗原(中国专利公开号CN104987366A、CN102796173A)等。

目前，临床上最常用的RA诊断方法是通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中抗瓜氨酸化蛋白抗体(ACPA)的滴度。ACPA是RA高度特异性的自身抗体，但是大约只有60～70％的RA患者展现阳性，其余高达30～40％的阴性患者则诊断困难，需要有其他的一些诊断方法来弥补诊断。在RA治疗方面，除了传统的改善病情抗风湿药(DMARDS)外，生物制剂，尤其是抗TNF-α单抗、抗IL-6单抗在RA治疗中展现了优良的治疗效果和前景。这一切均提示生物疗法在RA治疗中具有广泛的临床前景。值得注意的是，目前的治疗药物主要是抑制RA患者体内的炎症反应，对于致残性的RA骨破坏则缺乏较好的治疗药物。

清道夫受体是识别受体家族的重要成员，在天然免疫应答和抵抗微生物感染中扮演重要角色，并参与多种疾病的发生。A类清道夫受体(type A scavenger receptor，SR-A)，又名CD204，是一类约220～250KDa的跨膜蛋白，包含胞内区、跨膜区、间隔区、α螺旋卷曲区、胶原区、亚型特异性富含半胱氨酸C末端区6个结构域。主要表达在髓系来源的细胞表面，如巨噬细胞和树突状细胞。SR-A主要分为SRAⅠ型、SRAⅡ型和SRAⅢ型以及胶原样巨噬细胞受体(MARCO)等型。各型受体结构略有差别，但功能基本相同。

因SR-A是第一个被鉴定的可与变性脂蛋白结合的受体，它在心血管疾病中的作用已被广泛认知。新近的研究提示，其也参与自身免疫性肝炎的发病。然而SR-A的生理功能目前尚未完全清楚，部分研究报道了其在吞噬凋亡细胞、促进细胞粘附、调节细胞活性方面的功能，另外SR-A在动脉粥样硬化形成发展中所起的作用目前尚未完全确定。SR-A是否参与其他自身免疫病，尤其是RA患者的发病缺乏研究。此外，SR-A是否可以作为RA特异性的诊断标记物和治疗靶标尚无报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于帮助准确地诊断类风湿性关节炎；另一个目的是简化诊断方法，节约诊断成本；本发明的第三个目的是提供一种新的治疗类风湿性关节炎的药物作用靶点。

关于本发明的第一个方面，提供了A类清道夫受体蛋白作为标志物在制备类风湿性关节炎诊断试剂中的应用。

发明人通过酶联免疫法等多种方式分析类风湿关节炎、骨关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征病人和健康人的血清样本发现A类清道夫受体蛋白在类风湿关节炎病人中显著升高，并通过一系列后续试验验证了A类清道夫受体蛋白与类风湿性关节炎之间的直接关联性，进而得出该蛋白能够作为标志物参与类风湿性关节炎诊断的结论，当被检测的样本中SR-A显著高于正常对照时，即提示为类风湿性关节炎患者。

优选地，上述应用中，所述诊断试剂能识别生物样本中A类清道夫受体蛋白的表达水平，表达升高提示患有类风湿性关节炎。具体来说，通过提取生物样本中mRNA，反转录后通过荧光定量PCR检测SR-A在样本中的表达水平，这种检测方法为本领域常规的蛋白表达水平检测方法，本发明并不对其具体试剂和程序进行限定。所得检测结果与正常健康样本的表达水平做比较后，如果显示表达量升高，则提示患有类风湿性关节炎。

优选地，上述应用中，所述诊断试剂能检测生物样本中A类清道夫受体蛋白的浓度，浓度升高提示患有类风湿性关节炎。检测蛋白浓度也是一种直接、简便的检测方法。

优选地，上述应用中，所述生物样本为人的血清、血浆或血液。

优选地，上述应用中，所述诊断试剂包括特异性识别A类清道夫受体蛋白的抗体。该抗体可以使用现有的商品化抗体，也可以自行制备，本发明对其不做限定，只要能够满足特异性识别SR-A的功能即可。

本发明的第二个方面，为了简化诊断方法，节约诊断成本，优选的应用方式中，所述诊断试剂具体包括：A类清道夫受体蛋白标准品、与固定相结合且与A类清道夫受体蛋白特异性结合的捕获抗体、由标记物进行标记且特异识别A类清道夫受体蛋白的检测抗体，以及与标记物反应显色的检测试剂。

该试剂组合是基于酶联免疫吸附(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)原理设计的，具有检测快速简便、灵敏度高、稳定性好、易于标准化等优点，更适合规模化生产。

优选地，上述应用中，所述检测抗体为经过辣根过氧化物酶标记且特异性识别A类清道夫受体蛋白的抗体，所述检测试剂为四甲基联苯胺显色底物。

优选地，上述应用中，所述检测抗体为经过生物素标记且特异性识别A类清道夫受体蛋白的抗体，所述检测试剂为亲和素。

本发明的第三个方面，提供了A类清道夫受体蛋白的中和抗体在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。

另外，本发明还提供了A类清道夫受体蛋白的中和抗体在制备单核细胞向破骨细胞分化的抑制剂中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的A类清道夫受体蛋白作为标志物进行类风湿性关节炎的临床诊断准确率达90％。SR-A作为标志物对于RA的诊断特异性非常好，能够明显区分于其他上述几类疾病，大大提高了检测准确性，可以作为RA诊断的指标。在RA治疗方面，SR-A作为治疗靶标也表现出了优异性能，SR-A的中和抗体能够有效阻止RA的病程发展，特别是对于致残性的RA骨破坏体现出了非常好的治疗效果。

附图说明

图1为实施例1酶联免疫(ELISA)检测A类清道夫受体原理示意图。

图2为实施例1类风湿关节炎(RA)、骨关节炎(OA)、系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(SS)病人和健康人(HC)的血清样本中A类清道夫受体的浓度。

图3为实施例1以A类清道夫受体作为生物标记物诊断类风湿关节炎的灵敏度和特异性ROC曲线分析图。

图4为实施例2以A类清道夫受体为靶点治疗类风湿关节炎效果图，左侧分别为两种抗体对单核细胞向破骨细胞分化的抑制作用结果TRAP染色照片，右侧为抑制率分析结果，纵坐标为破骨细胞数量。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。以下实施例中，除特殊说明外，所使用的生物材料及试剂均为市售商品或可以根据常规技术手段配制的，试验方法也均为本领域常规技术。

实施例l SR-A作为标志物诊断RA的灵敏性和特异性

以酶联免疫吸附法(即ELISA法)为基础，使用特异性识别A类清道夫受体蛋白的抗体(鼠抗人SR-A单抗及HRP标记兔抗人SR-A单抗，购自北京义翘神州生物技术有限公司)以及A类清道夫受体蛋白标准品(Recombinant Human SR-A，美国R&D公司)作为诊断试剂，对RA、骨关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征及正常人血清中的SR-A进行检测，以评价SR-A在各种疾病中的分布及其诊断RA的价值。

用于检测受试者血清样本中的SR-A蛋白浓度的试剂组合包括以下成分：A类清道夫受体蛋白标准品、与酶标板结合且与SR-A特异性结合的捕获抗体(capture antibody)、检测抗体(detection antibody，或称酶标二抗，与辣根过氧化物酶HRP结合且能特异性识别SR-A)、显色底物(即TMB试剂，可由HRP催化进行显色反应)。

下面结合附图及具体操作步骤对本发明的应用原理进行进一步的描述。

如图1所示，以受试者血清中的A类清道夫受体作为类风湿关节炎诊断标记物，采用特异性识别抗体检测的方法，使用上述试剂组合，捕获抗体可以捕获血清中的SR-A，捕获到的SR-A被检测抗体识别并结合，当加入显色底物后，结合在检测抗体上的HRP引起显色底物(TMB)的颜色反应，呈现检测信号(Detection signal)，即可检测到血清中的SR-A。

具体操作包括以下步骤：

血清样本：用无抗凝剂采血管抽取2～3mL静脉血，室温静置5分钟后，4000rpm/min离心5分钟获取上清标本。

用含0.1％BSA、0.05％Tween-20的PBS作为稀释液对血清样本进行体积比1:3的稀释。同时也稀释好标准品(已知浓度的A类清道夫受体蛋白)。

用pH 7.2的PBS作为稀释液将capture antibody稀释到2μg/mL，然后加入96孔酶标板(100μL/孔)4℃孵育过夜。

用300μL的0.05％Tween-20PBST浸泡式洗板，2min/次，共4次。

每孔加入300μL含2％BSA、0.05％Tween-20的PBS，室温封闭2小时。

用300μL的0.05％Tween-20PBST浸泡式洗板，2min/次，共4次。

每孔加入100μL稀释好的血清样本，室温孵育2小时。

用300μL的0.05％Tween-20PBST浸泡式洗板，2min/次，共4次。

用含0.5％BSA、0.05％Tween-20的PBS作为稀释液将detection antibody稀释至1μg/mL，每孔加入100μL，室温孵育1小时。

用300μL的0.05％Tween-20PBST浸泡式洗板，2min/次，共4次。

加入100μL的TMB试剂于每孔中，室温避光孵育10-30min。

加入50μL 2M硫酸溶液终止反应，立即在酶标仪上读取450nm和570nm的吸光值。

本实施例共检测80例类风湿关节炎(RA)、30例骨关节炎(OA)、30例系统性红斑狼疮(SLE)、28例干燥综合征(SS)以及70例正常人血清中的SR-A。每个样本均做复孔检测。

本实施例主要通过以下几个方面阐明本发明在RA患者诊断中的意义：

SR-A在不同疾病中的浓度的比较：

SR-A在RA、OA、SLE、SS以及正常对照组的浓度中位值分别为RA 14.1ng/mL(0-49.18)、OA 1.285ng/mL(0-15.5,P<0.001)、SLE 2.190ng/mL(0-20.78,P<0.001)、SS 2.895ng/mL(0-28.37,P<0.001)和正常对照0.3951ng/mL(0-1.591,P<0.001)。RA患者SR-A水平明显高于其他风湿性疾病组以及健康对照组，如附图2所示。

SR-A对RA的诊断价值：

通过对ROC曲线的分析表明，当SR-A对RA诊断阳性率为70％时，其对RA诊断的特异性高达90％。如附图3所示。这表明SR-A作为标志物对于RA的诊断特异性非常好，能够明显区分于其他上述几类疾病，可以作为RA诊断的指标。

实施例2SR-A的中和抗体对RA单核细胞向破骨细胞的分化抑制

通过体外破骨细胞诱导实验，检测SR-A中和抗体对破骨细胞生成的抑制作用，评价SR-A作为RA干预靶点的潜在价值。

无菌分离类风湿关节病人PBMC(外周血单个核细胞)，然后铺至12孔细胞培养板中(5×10⁵细胞/孔)，贴壁两小时后换液，仅保留贴壁的单核细胞(破骨细胞前体细胞)，同时加入30ng/mL的M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)和25ng/ml的RANKL(核因子κB受体活化因子配体)。

在同一病人的两孔细胞中分别加入2μg/mL的anti-SR-A中和抗体(Mouse anti-human SR-A Neutralization Antibody，美国R&D公司)和同型抗体(Mouse IgG1，美国R&D公司)。

每隔3天换液一次，同时补加相应的细胞因子及中和抗体/同型抗体。

经21天破骨诱导之后吸去上清，加入固定液(柠檬酸钠/丙酮/37％的甲醛溶液)固定30s。

弃固定液，37℃蒸馏水充分冲洗。

加入TRAP染色液37℃孵育1h，并用蒸馏水充分冲洗。

加入苏木精复染30s，显微镜下计数破骨细胞。

本研究共检测5例病情活跃RA患者单核细胞在有和无SR-A中和抗体存在的情况下，分化为破骨细胞的差异。结果表明，与同型抗体相比，SR-A中和抗体可以显著抑制RA单核细胞向破骨细胞的分化，如附图4所示。以上结果提示，SR-A有望成为RA的干预靶标。

骨破坏在RA中发挥重要的致病作用；破骨细胞是骨破坏的主要细胞，其分化对于骨破坏至关重要。破骨细胞生成在RA发生发展中至关重要，是导致RA患者肢体残疾的关键步骤。抑制单核细胞向破骨细胞的分化，将有效阻断RA患者的骨破坏和关节致残。目前的RA治疗药物主要是抑制患者体内的炎症反应，对于致残性的骨破坏则缺乏有效而安全的药物。本发明的SR-A中和抗体则可以有效阻断RA患者的破骨细胞生成和骨破坏。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。