一种血液游离RNA保护剂及其制备方法与应用与流程

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种血液游离RNA保护剂及其制备方法与应用。

背景技术：

游离循环RNA是一种存在于动植物和人的体液中的细胞外游离状态的RNA，包括：血浆、血清、尿液、前列腺液、支气管灌洗液、唾液、脑脊液、胃液、胆汁、淋巴液及粪便。自游离循环RNA被发现以来，就逐渐被应用到不同领域，发挥着巨大的作用。

在肿瘤应用方面，有研究报道了在恶性肿瘤患者血液中检测到了游离循环RNA-蛋白质复合体，而在良性肿瘤患者血清中则没有检测到，说明游离循环RNA-蛋白质复合体可以作为一种潜在的肿瘤标记物；研究还表明在切除了肿瘤患者的肿瘤后，游离循环RNA-蛋白质复合体很快消失了，证明了肿瘤的生长与这种复合体相关。

在无创性产前应用方面，胎儿RNA分子主要来源于胎盘，不但易于检测，而且还具有无需依赖胎儿性别或父源性多态性位点的明显的应用优势。目前，有研究表明宫内发育迟缓、胎儿非整倍体以及子痫前期等妊娠相关疾病与母血中游离RNA有极大关系，进一步说明可以将孕妇血液中游离RNA作为一种新的胎儿遗传信息材料，这给无创性产前诊断带来了前所未有的契机。

血液游离RNA的检测及其在基因诊断等方面的应用，对于恶性肿瘤、胚胎医学、无创性产前等的诊断和监测具有十分重要的意义。

但在血液中的游离RNA含量少，而血液中RNA酶含量多，游离的RNA在没有保护的状态下很容易降解消失，所以研发一种有效可行的延长血液游离RNA保存期限的保护剂是很有必要的。

技术实现要素：

本发明的目的在于提出一种血液游离RNA保护剂，该保护剂不仅能防止血液凝固，而且能够保护RNA分子，避免被RNA酶降解。该保护剂是由EDTA-3K、IDU、bestain、glycine、AEBSF、核糖核苷复合物按照一定的比例溶解于DEPC水配制而成。把血液与血液游离RNA保护剂以40:1 的比例缓慢充分混匀后，室温放置半小时即可，室温可保存3天，-20℃至-80℃可长期保存。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种血液游离RNA保护剂，所述保护剂是由EDTA-3K、IDU、bestain、glycine、AEBSF、核糖核苷复合物按照一定的比例溶解于DEPC水配制而成，其中各组分在所述溶液中的浓度分别为：EDTA-3K（30g-100g/L）、IDU（200-600g/L）、bestain（0.05-0.3g/L）、glycine（10-60g/L）、AEBSF（0.05-0.4g/L）、核糖核苷复合物（0.2ml-1ml/L）。

作为优选，本发明所述的血液游离RNA保护剂是由EDTA-3K、IDU、bestain、glycine、AEBSF、核糖核苷复合物按照一定的比例溶解于DEPC水配制而成，其中EDTA-3K、IDU、bestain、glycine、AEBSF、核糖核苷复合物在所述溶液中的浓度分别为50g/L、550g/L、0.24g/L、30g/L、0.172g/L、0.5ml/L。

本发明所述的制备血液游离RNA保护剂的方法，具体步骤如下：

1）将各组分按配方称（吸）取到容器中；

2）向1）中加入500ml灭菌的DEPC水，待所有组分溶解后全量转移到1L容量瓶中，多次清洗初次溶解的容器，洗涤液全量转移到容量瓶中，最后使用灭菌的DEPC水定容至1L，将溶液PH值调至7.2-7.8，得到血液游离RNA保护剂。

权利要求1-2任一项所述的血液游离RNA保护剂在血液游离RNA保存中的应用，其特征在于，在所述应用中，将采集的血液与血液游离RNA保护剂以40:1 的比例缓慢充分混匀后，室温至少放置半小时。

根据权利要求4所述的半小时后，其特征在于室温可保存3天，-20℃至-80℃可长期保存。

本发明的优点：

1.第一时间保护血液中的游离RNA；

2.更好地保证标本RNA的完整性。

附图说明

图1为全血样本置于本发明所述的血液游离RNA保护剂中保存0天后进行核酸提取，提取得到的核酸进行β--catenin mRNA基因实时荧光PCR的检测结果。

图2为全血样本置于本发明所述的血液游离RNA保护剂中保存1天后进行核酸提取，提取得到的核酸进行β--catenin mRNA基因实时荧光PCR的检测结果。

图3为全血样本置于本发明所述的血液游离RNA保护剂中保存2天后进行核酸提取，提取得到的核酸进行β--catenin mRNA基因实时荧光PCR的检测结果。

图4为全血样本置于本文所述的血液游离RNA保护剂中保存3天后进行核酸提取，提取得到的核酸进行β--catenin mRNA基因实时荧光PCR的检测结果。

图5为全血样本置于EDTA-Na₂采血管中保存0天后进行核酸提取，提取得到的核酸进行β--catenin mRNA基因实时荧光PCR的检测结果。

图6为全血样本置于EDTA-Na₂采血管中保存1天后进行核酸提取，提取得到的核酸进行β--catenin mRNA基因实时荧光PCR的检测结果。

图7为全血样本置于EDTA-Na₂采血管中保存2天后进行核酸提取，提取得到的核酸进行β--catenin mRNA基因实时荧光PCR的检测结果。

图8为全血样本置于EDTA-Na₂采血管中保存3天后进行核酸提取，提取得到的核酸进行β--catenin mRNA基因实时荧光PCR的检测结果。

具体实施方法

以下实施案例仅用于解释本发明，而并非限制本发明。

实例：

随机抽取8个全血样本，分别按5ml/人份分成8人份，其中4人份为1组，分成2组。其中1组置于常规EDTA-Na₂采血管中，另1组置于本发明所述的血液游离RNA保护剂中，分别常温放置0天、1天、2天、3天后进行核酸提取（Qiagen公司的RNeasy Mini Kit (50) -货号74104试剂盒），以提取的核酸为样本进行人β--catenin mRNA基因的实时荧光PCR检测。检测数据结果如表1。

表1

置于常规EDTA-Na₂采血管和本发明所述的血液游离RNA保护剂中的全血样本，在常温放置不同时间后，分别进行核酸提取，提取的核酸进行人β--catenin mRNA基因的实时荧光PCR检测，其检测结果的Ct值如表1。 由表1可知，血液游离RNA保护剂能够在3天内有效地保护血液中游离的RNA，只有极其轻微的降解；而常规EDTA-Na₂采血管对RNA的稳定性维持时间不到1天且降解情况比较严重。

图1~图8为表1对应的人β--catenin mRNA基因的实时荧光PCR检测结果图，其中图1~图4为全血置于本文所述的游离核酸RNA保护剂中保存不同时间后进行核酸提取，提取得到的核酸进行β--catenin mRNA基因实时荧光PCR的检测结果图，由图可知，在0~3天的检测时间内，所有检测样本都被正确检出，且稳定性良好，血液中的游离核酸得到了有效的保护；图5~图8为全血置于常规EDTA-Na₂采血管中保存不同时间后进行核酸提取，提取得到的核酸进行β--catenin mRNA基因实时荧光PCR的检测结果图，检测结果显示，常规EDTA-Na₂采血管中的游离RNA连1天的稳定性都不能维持，降解情况十分严重。