本发明属于基因检测领域，涉及一种用于儿童鼻炎的复方药物的代谢检测试剂盒。
背景技术：
：鼻炎即鼻腔炎性疾病，是病毒、细菌、变应原、各种理化因子以及某些全身性疾病引起的鼻腔黏膜的炎症。鼻炎的主要病理改变是鼻腔黏膜充血、肿胀、渗出、增生、萎缩或坏死等。主要的病因有以下几种：病毒感染是其首要病因，或在病毒感染的基础上继发细菌感染。已知有100多种病毒可引起本病，最常见的是鼻病毒，其次是流感和副流感病毒、腺病毒、冠状病毒、柯萨奇病毒及黏液和副黏液病毒等。病毒传播方式主要是经过呼吸道吸入，其次是通过被污染体或食物进入机体。遗传因素：有变态反应家族史者易患此病。患者家庭人员多有哮喘、荨麻疹或药物过敏史。以往称此患者为特应性个体，其体内产生IgE抗体的能力高于正常人。申请人在前期的研究也发现，比如(北京地区1-12岁儿童变应性鼻炎变应原谱分析，戴伟利等，山东大学耳鼻喉眼学报，第28卷第1期，第39-45页)也公开了儿童变应性鼻炎患者吸入组变应原是主要原因。在(幼儿变应性鼻炎临床特征分析，戴伟利等，中华耳鼻咽喉头颈外科杂志2011年11月第46卷第11期)中也公开了吸人组变应原、食物组变应原是鼻炎的主要诱导之一。但近年有人发现，孪生与普通人群中的发病率无显著差异。鼻黏膜易感性：易感性的产生源于抗原物质的经常刺激，但其易感程度则视鼻黏膜组织中肥大细胞、嗜碱性粒细胞的数量和释放化学介质的能力。现已证实，变应性鼻炎患者鼻黏膜中上述细胞数量不仅高于正常人，且有较强释放化学介质的能力。抗原物质：刺激机体产生IgE抗体的抗原物质称为变应原。该变应原物质再次进入鼻黏膜，便与相应的IgE结合而引起变态反应。引起本病的变应原按其进入人体的方式分为吸入性和食物性两大类。目前在治疗上主要找出全身和局部病因，及时治疗全身性慢性疾病、鼻窦炎、临近感染病灶和鼻中隔偏曲等。改善生活和工作环境，锻炼身体，提高机体抵抗力。局部治疗：(1)鼻内用糖皮质激素慢性鼻炎首选用药，具有良好抗炎作用，并最终产生减充血效果。根据需要可较长时间应用，疗效和安全性好。(2)鼻腔清洗鼻内分泌物较多或较黏稠者，可用生理盐水清洗鼻腔，以清除鼻内分泌物，改善鼻腔通气。(3)鼻内用减充血剂可选用盐酸羟甲唑啉喷雾剂，连续应用不宜超过7天。若需继续使用，则需间断3～5天。长期应用0.5％～1％麻黄碱滴鼻液可损害鼻黏膜纤毛结构，应尽量避免。若不得不使用，应少量间断使用。禁用滴鼻净，因已证实其可引起药物性鼻炎。(4)其他治疗包括封闭疗法、针刺疗法等，已很少应用。在以上治疗方法中，目前西药治疗是最为普遍，常用的治疗方式，而在儿童鼻炎的复方药物组合物中，有效剂量的盐酸去氧肾上腺素也是常见的药物组成，比如在CN105796578A中公开了一种用于儿童鼻炎的复方药物组合物，其中包含有效剂量的盐酸去氧肾上腺素。由于盐酸去氧肾上腺素属于α肾上腺素受体激动药，该药物可导致升压和心动过速，过量使用对于儿童的健康还是具有一定的危害，因此，建立一种快速检测体液中的盐酸去氧肾上腺素对于研究所属药物的代谢，以及后续的临床指导具有较为重要的意义。现有技术中一般采用液相色谱进行检测，但是该检测对于仪器要求比较高，并且检测复杂不利于实时监测。基于现有技术中检测盐酸去氧肾上腺素的手段的局限性，寻找一种有效的能够快速检测盐酸去氧肾上腺素的方法是亟待解决的问题。技术实现要素：为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种盐酸去氧肾上腺素检测的试剂盒。相比传统的盐酸去氧肾上腺素检测方法，使用本试剂盒来诊断盐酸去氧肾上腺素具有及时性、特异性和灵敏性。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明提供了检测盐酸去氧肾上腺素的产品在制备诊断试剂盒中的应用。本发明另外提供一种盐酸去氧肾上腺素特异性结合的适配子，所述适配子的序列如SEQIDNO：1-9任一所示。本发明另外提供一种盐酸去氧肾上腺素适配子的筛选方法，所述方法包括提供随机数据库，通过磁珠偶联目标化合物进行初筛，复筛选，通过PCR获得目标适配子。本发明的另外一个目的是提供一种检测盐酸去氧肾上腺素的方法，该方法是基于本发明所述的适配体利用本领域常规的方法制备获得的电化学生物传感器实现检测的。本发明的有益效果在于：提供了一种对目标盐酸去氧肾上腺素非常敏感的适配体作为分子识别元件。基于该适配体，制备得到相应的适配体电化学生物传感器，可以将盐酸去氧肾上腺素目标物的存在转变为电信号进行快速检测。它将电化学方法的高灵敏性和适配体高度特异性识别作用相结合，制备简单、灵敏度高、检测费用低、易于微型化、可再生，不受样品中脂血、溶血情况干扰，降低了检测成本和检测方案的复杂性。具体的实施方式实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行操作即可。实施例1Neo-synephrine适配子的筛选人工合成单链DNA序列，构建单链DNA随机序列寡核苷酸库，单链DNA随机寡核苷酸库包括的DNA序列为：5’-TTGCAGGGAACATTCAGACT-N36-CGTTACTCGTGGTCATGTCC-3’所述单链DNA随机寡核苷酸库的DNA序列包括中间随机序列N36和两端固定序列，所述中间随机序列N36为36个碱基的随机序列，所述两端固定序列为：TTGCAGGGAACATTCAGACT，CGTTACTCGTGGTCATGTCC，所述两端固定序列为PCR扩增引物结合区；(2)制备盐酸去氧肾上腺素-微磁珠复合物：将0.75ml带有活化氨基的微磁珠与10mg盐酸去氧肾上腺素在偶联缓冲液(15mM磷酸钾盐缓冲液，0.20MNaCl,1mMDTT,pH5.9)中混合，加入200ul偶联剂溶液(含65％的二甲基氨基丙基乙基碳酰胺)，25℃反应条件下轻混30小时，使盐酸去氧肾上腺素的末端共价连接到微磁珠上，在分离装置中用清洗液洗涤得到盐酸去氧肾上腺素-微磁珠复合物。(3)初次筛选靶物质-核酸复合物：将4nmol单链DNA文库溶于结合缓冲液(100mMNaCl,20mMTris-HClpH7.6,2mMMgCl2,5mMKCl,1mMCaCl2,0.02％Tween20,1mMDTT)，进行加热处理，90℃加热10min，置于冰上15min，然后温度放置5min，单链DNA文库于没有结合盐酸去氧肾上腺素的磁珠孵育后，收集不结合磁珠的DNA随机寡核苷酸库的液体；将步骤2)盐酸去氧肾上腺素-微磁珠复合物与热处理后收集不结合磁珠的DNA随机寡核苷酸库在结合缓冲液中37℃温育15min，用洗脱缓冲液(20mMTris-HClpH7.6,200mMNaCl,10mMEDTA)洗涤盐酸去氧肾上腺素-寡核苷酸-微磁珠复合物，除去不与盐酸去氧肾上腺素结合的和非特异结合的寡核苷酸序列，盐酸去氧肾上腺素-寡核苷酸-微磁珠复合物在洗脱缓冲液中95℃孵育10min后，回收带有单链寡核苷酸序列的洗脱缓冲液。(4)制备次级单链DNA寡核苷酸库：将步骤3)中回收得到带有单链寡核苷酸序列的洗脱缓冲液进行PCR扩增，PCR扩增产物以链霉亲和素微磁珠为基质进行分离，经过碱变性解链，过滤，纯化，获得次级单链DNA寡核苷酸库，用于下一轮筛选；PCR扩增工艺条件为：94℃预变性5min，95℃35s，48℃1min，72℃1min,扩增23个循环，最终延伸反应为72℃10min，引物1：5’-TTGCAGGGAACATTCAGACT-3’，引物2：5’-Biotin-CGTTACTCGTGGTCATGTCC-3’，引物2的5’端生物素标记。(5)筛选并鉴定盐酸去氧肾上腺素核酸适体：将步骤4)所得的次级单链DNA寡核苷酸库经过23轮链霉亲和素微磁珠为基质分离筛选，获得目标寡核酸序列，克隆并测序所述目标寡核酸序列，目标寡核酸序列为SEQIDNO:1-9，命名为Neo-synephrine1～9。实施例2解离常数的测定将适配子分别取1.5μg，用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)37℃消化1h，纯化回收去磷酸化的适配子；通过T4多核苷酸激酶标记[γ-32P]ATP于去磷酸化的适配子分子末端。10nmol放射性标记的适配子分别与不同浓度(1-200nM)的盐酸去氧肾上腺素37℃孵育30min，各组反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品平行做两次测定。计算各个适配子与盐酸去氧肾上腺素的解离常数。结果如下：名称解离常数Kd(nM)Neo-synephrine-132.5Neo-synephrine-220.9Neo-synephrine-310.6Neo-synephrine-445.1Neo-synephrine-544.3Neo-synephrine-613.9Neo-synephrine-722.1Neo-synephrine-823.5Neo-synephrine-924.6通过特异性检测分析，发现所述的适配子只与盐酸去氧肾上腺素相结合，而与其它常见的肾上腺素、人血白蛋白均不能结合，表现了很好的特异性。实施例3适配体电化学生物传感器的构建(1)裸金电极表面的抛光及活化处理将裸金电极用0.3μm的氧化铝粉末打磨10分钟，再用0.05μm的氧化铝粉末打磨20分钟，然后用超纯水超声清洗2次，每次5分钟，彻底去除非特异性吸附在裸金电极表面的氧化铝粉末。将清洗好的裸金电极浸入新鲜配制的热的Piranha溶液(浓硫酸:30％H2O2＝7:3，V:V)于室温下活化10分钟，得到活化的裸金电极。然后分别用超纯水和无水乙醇超声清洗2次，每次5分钟。(2)适配体电化学传感器的修饰取2μL浓度100μmol/L的盐酸去氧肾上腺素适配体溶液加入到98μL浓度1mol/L的NaCl溶液中，配制成2μmol/L适配体组装液，转入50mL离心管中；将步骤(1)抛光活化处理后的裸金电极放入50mL离心管并浸入适配体组装液中，密封后，4℃下组装24小时，即得到盐酸去氧肾上腺素核酸适配体修饰的电极。核酸适配体序列3’端修饰了3’-NH2-(CH2)7-。以浓度为0.1pg/mL、1.0pg/mL、10.0pg/mL、1.0×102pg/mL、1.0×103pg/mL、1.0×104pg/mL的盐酸去氧肾上腺素标准液浓度的对数为横坐标，以这6种标准液对应的阻抗变化值△Ret为纵坐标作图，按照本领域常规的电极检测方法建立标准曲线。最终得到盐酸去氧肾上腺素检测限为1.0pg/mL。实施例4血液中盐酸去氧肾上腺素的检测血液样品的处理：分别取100pg的盐酸去氧肾上腺素加入到10mL血液中，室温混匀处理24h，做10个平行样品。将Neo-synephrine-1～9分别采用磁珠进行标记，并加入到前述的血液混合液中，混匀30min，以磁性分离，按照标准浓度换算得到各个适配子检测得到的最终结果如下：测试结果如上表所示。所测得样品的相对标准偏差在2.5％～3.1％之间，加标回收率在96.3％～97.2％之间，具有较好的回收效率和检测精确度。上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。序列表〈110〉戴伟利〈120〉一种用于儿童鼻炎的复方药物的代谢检测试剂盒〈210〉1〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉Neo-synephrine-1TTGCAGGGAACATTCAGACTTCATCACACCCCGCCCTTCCAACTACCCTCTCCTTAGGACATGACCACGAGTAACG〈210〉2〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉Neo-synephrine-2TTGCAGGGAACATTCAGACTAATCCTCCCACACACCTCACTTATAAAAATCCAACCGGACATGACCACGAGTAACG〈210〉3〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉Neo-synephrine-3TTGCAGGGAACATTCAGACTCTCCTTTACTCCTCATTAAATCCAATTTCACTTTAAGGACATGACCACGAGTAACG〈210〉4〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉Neo-synephrine-4TTGCAGGGAACATTCAGACTATAATCTTATTCTCCCTCATTTCCATATTCTCCTTCGGACATGACCACGAGTAACG〈210〉5〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉Neo-synephrine-5TTGCAGGGAACATTCAGACTTATCCTATCTACCAATCTCTTCCCTCCCTCCACACCGGACATGACCACGAGTAACG〈210〉6〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉Neo-synephrine-6TTGCAGGGAACATTCAGACTAACTCCCATACTTACCTACTAACCAATCACAATACAGGACATGACCACGAGTAACG〈210〉7〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉Neo-synephrine-7TTGCAGGGAACATTCAGACTCATTCTATAATTAACCTCCACTAATTCCTCATCCTAGGACATGACCACGAGTAACG〈210〉8〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉Neo-synephrine-8TTGCAGGGAACATTCAGACTACACCAATCACACAATCTTAATCCACCACATAAAATGGACATGACCACGAGTAACG〈210〉9〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉Neo-synephrine-9TTGCAGGGAACATTCAGACTACCACCCAAATCATTCTTCATCTAACATTCCCCCTTGGACATGACCACGAGTAACG当前第1页1 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