本发明属于石墨烯功能材料的应用领域，具体涉及一种基于大面积单层石墨烯的柔性拉曼增强基底及其制备方法以及基于该基底的定量分析方法。
背景技术：
表面增强拉曼散射技术的发展给拉曼光谱的应用提供的空前的前景，并实现了单分子水平的高灵敏度检测。受限于粗糙金属基底的增强效应，表面增强的优点和缺点同样明显，比如化学吸附、金属-分子间电荷转移与金属催化的副反应等等因素都造成了表面增强信号复杂性、不真实性和不可重复性。设计与发展新型的拉曼增强基底，进而彻底克服传统表面增强技术的局限性是当前的关键问题。
石墨烯在电学、光学、热学以及力学等方面表现出的优良性质，自其被发现以来就引起物理、化学、生物和材料等各领域的广泛关注，但是在拉曼定量分析领域，并未有使用石墨烯来解决前述问题的报道。
现有技术中已经有使用柔性表面增强拉曼光谱基底的报道，但是受限制于材料，其不能很好的实现背入射式检测模式，并且无法实现拉曼光谱的在线检测。
技术实现要素：
本发明的一个目的借助于新型二维原子层材料石墨烯，利用新型的石墨烯作为壳层的基底，定量在线监测溶液中的拉曼分子，拓展壳层隔绝纳米粒子增强拉曼光谱(shiners)在拉曼定量分析领域中的应用。
本发明提供了一种新的基于石墨烯的柔性增强拉曼基底，所述柔性基底包括一单层的石墨烯，其特征在于：所述石墨烯上有厚度为1-100nm的金属镀层，所述金属镀层上涂布有聚合物，所述金属镀层包括若干岛状的颗粒，所述颗粒的尺寸为10-1000nm，所述颗粒间的间隔为2-500nm
作为上述技术方案的一个优选，所述金属镀层的厚度为1-30nm。
作为上述技术方案的进一步优选，所述金属镀层的厚度为5-20nm。
作为上述技术方案的进一步优选，所述金属镀层的厚度为6-10nm，更优选8nm。
作为上述技术方案的一个优选，所述聚合物的厚度为0.1-1000微米。所述聚合物为柔性拉曼基底提供支持，本领域技术人员可以根据需要调整聚合物的厚度，如选择1-10、10-20、20-40、40-100、100-200、200-300、300-400、400-600以及600-1000微米。
作为上述技术方案的一个优选，所述聚合物为聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚二甲基硅氧烷(pdms)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚乙烯醇(pva)中的一种或多种的混合物。
作为上述技术方案的一个优选，所述岛状颗粒的尺寸为10-20、20-40、40-100、100-200、200-300、300-400、400-600或600-1000nm，本领域技术人员可以根据需要调节蒸镀的工艺并获得具有不同镀层的颗粒大小的产品。
作为上述技术方案的一个优选，所述岛状颗粒的间隔为2-10、10-20、20-40、40-100、100-200、200-300、300-400或400-500nm，本领域技术人员可以根据需要调节蒸镀的工艺并获得具有不同镀层的颗粒间隔的产品，并用于调节薄膜的光性能。
作为上述技术方案的一种更好的选择，所述石墨烯上有厚度为8nm的金属镀层，所述金属镀层上涂布有聚合物，所述金属镀层包括若干岛状的颗粒，所述颗粒的尺寸为5-100nm，所述颗粒间的间隔为2-5nm。
本发明还提供了上述基于石墨烯的柔性增强拉曼基底的制备方法，包括：
1)通过化学气相沉积法直接在牺牲模板上生长单层石墨烯；
2)在单层石墨烯表面构筑蒸镀金属层；
3)在金属层的表面涂布聚合物层，该聚合物层可以通过被烘干或者晾干的方式形成稳定的结构；
4)去除牺牲模板。去触摸板后的产物即为基于石墨烯的柔性增强拉曼基底，其可以通过水洗以及后续洗涤得到可用的石墨烯的柔性增强拉曼基底。
作为上述技术方案的一种较好的选择，所述牺牲层的材质为铝、锌、镍、铁、锡或铜。
作为上述技术方案的一种较好的选择，所述金属层为金、银或铜中的一种或多种。
在本发明的实施例内记载了一种制备基于石墨烯的柔性增强拉曼基底的方法：
(1)化学气相沉积(cvd)法直接在牺牲模板(如cu箔或al箔)上生长单层石墨烯。
(2)在石墨烯表面构筑电磁场耦合热点贴近石墨烯表面的金属纳米结构(au和ag)。这里可以蒸镀的方法，优化蒸镀速率和蒸镀厚度为
(3)将pmma(poly(methylmechacrylate)，聚甲基丙烯酸甲酯，sigma-aldrich)或者pdms(poly(dimethylsiloxane)，聚二甲基硅氧烷，sigma-aldrich)滴加于基底上，以2000r/min转速进行旋涂，然后自然晾干或者170℃以下加热烘干，备用。
(4)进行烘烤、等离子体轰击，再放入铜刻蚀剂fecl3溶液，祛除模板，加几滴盐酸以促进刻蚀，约1h刻蚀完成。
(5)水洗，得到漂浮于刻蚀液表面的基于石墨烯的柔性增强拉曼基底(g-sers基底)，取出用去离子水、稀盐酸、去离子水依次仔细冲洗，备用。
本发明利用了石墨烯超薄、超致密的特性使g-sers基底集成了金属/分子隔离和电磁增强热点富基于表面的特点，本发明制备获得的柔性基底主要包即石墨烯媒介层(mediatior)、镶嵌结构的金属活性层(electromagneticenhancer)和聚合物支撑层(supporter)。本发明制备获得的基底结构良好的透光性、较好的柔韧性，且可以实现自支撑，表面热点丰富，实现了金属/分子隔离，易于保存，可以实现直接和无损检测，并具备普适性。
在毫米级别范围的g-sers基底中，石墨烯对单个金属纳米粒子热点覆盖率以上内达到100％，这有效地隔离待测分子与金属增强层的直接接触，消除了传统基底中由于化学吸附、金属-分子间电荷转移与金属催化等副反应造成的表面信号复杂、不真实和不可重复的缺点，发挥了壳层隔绝增强拉曼光谱技术的优势。由于g-sers基底具有柔性和透光性，g-sers基底可以用于进行任意形貌(溶液、平整和粗糙表面)表面分子的直接、无损检测。
本发明利用柔性g-sers实现了一系列形貌基底表面分子的拉曼定性分析，并实现了对结晶紫、罗丹明b(rhb)水溶液体系的在线定量分析，以及定量在线监测罗丹明b(rhb)分子在半透膜中的透析速率。本发明的g-sers基底克服了以往基底难以进行拉曼在线监测、难以循环使用的问题，提供了一种新型的便捷、快速、在线定量检测的方法。
利用上述方法得到的g-ser柔性基底可以进行拉曼定性和定量分析，并具有如下的优势：
(1)g-sers基底具有柔性、透明等特点，因此能够将其贴合于任意形貌基底的表面进行拉曼定性检测，包括水相、有机相以及固相表面等。
(2)g-sers基底能够贴合于水相体系表面，因此能够利用g-sers基底对水相中的拉曼分子进行定性和定量分析。在拉曼定量分析手段中，sers基底必须满足的两个条件是信号的可重复性和准确性，而g-sers就很好地同时满足了这两个要求：a)石墨烯是一层完全均匀铺展的一层内标分子，可以排除纳米结构热点不均一的影响；b)拉曼信号简单，使得背景区域信号干净；c)金属/分子隔离层使得拉曼增强信号更加干净、重复性更好，避免了传统增强基底中金属和分子直接接触导致的化学吸附于变形、光漂白与分子碳化、金属/分子电子转移、等离子体催化等副反应的发生。基于g-sers基底以上的一系列优点，可以将g-sers基底用于对溶液体系进行实时、在线、定量监测。
本发明提供的柔性g-sers基底可以采用“正入射式”和“背入射式”两种检测模式，其中“正入射式”模式需要将待测分子放在基底活性面上，即石墨烯一侧，这种模式需要溶解制样/分子加载的过程，对某些的体系检测是有损的；“背入射式”模式即将基底的活性面直接贴到待测物表面，活性层面背对着入射光方向朝下放置，这是一种直接、无损的检测模式，但是需要基底具有理想的透光性。本发明中g-sers基底具有良好的透光性，良好地满足了前述要求。
附图说明
图1为g-sers基底制备过程示意图；
图2为柔性基底的表征图，其中a-e分别为图g-sers柔性基底的sem、tem、tem局部放大图、afm表征图和高度图。
图3为利用g-sers柔性基底对(a)水相中的罗丹明(r6g)分子；(b)乙醇溶液中的酞菁铜；(c)平整基底表面的patp分子的单分子层自组装膜；(d)粗糙的蔬菜表面的农药残留；(e)细胞表面的叠氮化合物的检测而分别得到的拉曼光谱。
图4a和4b为拉曼定量分析模型图以及液相中的拉曼定量分析模型图。
图5分别为(a)转移到si/sio2基底上的单层石墨烯的光学图像；(b)在(a)中标区域中结晶紫在(cv)1180cm-1处的峰的拉曼强度分布图；(c)图b所对应的拉曼光谱。(d)在g-sers基底上cv分子的一系列具有不同激光聚焦状态和不同扫描位置的拉曼光谱；图(e)和图(f)分别为cv分子在1180cm-1处的峰强度统计，以及使用石墨烯的2d峰作为内标的强度比ir的统计。
图6(a)和图6(b)分别为g-sers基底检测到的4×10-8mcv水溶液的拉曼光谱以及拉曼强度ir随时间的变化，其显示了cv分子在石墨烯上的吸附在～10分钟达到饱和。图6(c)和图6(d)为g-sers基底检测到的10-6mrhb水溶液拉曼光谱以及拉曼强度ir随时间的变化，其表明了rhb在石墨烯上的吸附在
图7(a)为在10-8m～10-5m范围内的不同浓度结晶紫(cv)溶液的拉曼光谱；图7(b)为使用石墨烯(2d峰)作为内标，cv分子在810cm-1，916cm-1，1365cm-1和1621cm-1处的四个峰的ir随溶液浓度浓度的变化曲线；图7(c)为在10-8m至10-7m的低浓度范围内的放大曲线；图7(d)为浓度为10-8m的cv的放大光谱，插图为cv分子的化学结构式；图7(e)为校准强度ir作为表面覆盖的函数。所有光谱在633nm激发下获得，(*)为石墨烯的2d峰。
图8为表面覆盖度(θ)和溶液中cv浓度之间的关系，插图显示的是在低浓度范围内的关系曲线放大图。
图9(a)添加了rhb(10-6m)饮料以及rhb的分子结构示意图；图9(b)为定量在线检测浓度在10-7m～10-5m范围内不同浓度的rhb溶液；图9(c)为用g-sers基底测定的空白的饮料(曲线3)、添加了10-6mrhb的饮料(曲线2)以及具有10-6m浓度的rhb水溶液(曲线1)的拉曼光谱；图9(d)为rhb的特征峰(1651cm-1)对石墨烯的2d峰(2650cm-1)的相对强度ir与浓度的依赖关系)。图中的(1)和(2)分别对应于图9(c)中相应的曲线(1)和(2)的测量数据。插图显示了ir对石墨烯表面rhb的表面覆盖度的关系图，图中的星号(*)标记的峰是石墨烯的2d峰。
图10(a)为使用g-sers基底实时原位监测rhb分子在透析膜中的释放过程示意图；图10(b)为rhb分子在透析膜中释放的实时原位监测的拉曼光谱，rhb分子在透析袋中的初始浓度为1.5×10-5m，在～40h后达到终浓度；图10(c)为rhb的拉曼强度随时间的依赖关系，插图显示了相应的浓度与透析时间的依赖关系。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明通过如下的方式来制备基于石墨烯的柔性增强拉曼基底：
(1)化学气相沉积(cvd)法直接在牺牲模板(如cu箔或al箔)上生长单层石墨烯。
(2)在石墨烯表面构筑电磁场耦合热点贴近石墨烯表面的金属纳米结构(au和ag)。此处可以使用蒸镀的方法，推荐的蒸镀速率和蒸镀厚度为
(3)将pmma(poly(methylmechacrylate)，聚甲基丙烯酸甲酯，sigma-aldrich)或者pdms(poly(dimethylsiloxane)，聚二甲基硅氧烷，sigma-aldrich)滴加于基底上，以2000r/min转速进行旋涂，然后自然晾干或者170℃以下加热烘干，备用。
(4)进行烘烤、等离子体轰击，再放入铜刻蚀剂fecl3溶液，祛除模板，加几滴盐酸以促进刻蚀，约1h刻蚀完成。
(5)水洗，得到漂浮于刻蚀液表面的柔性g-sers基底，取出用去离子水、稀盐酸、去离子水依次仔细冲洗，备用。
请参见图1和图2，本发明得到的基于石墨烯的柔性增强拉曼基底，所述柔性基底包括一单层的石墨烯，所述石墨烯上有厚度为1-100nm的金属镀层，所述金属镀层上涂布有聚合物，所述金属镀层包括若干岛状的颗粒，所述颗粒的尺寸为10-1000nm，所述颗粒间的间隔为2-500nm。
作为上述技术方案的一个优选，本领域技术人员可以控制得到的金属镀层的厚度为1-30nm，优选5-20nm。
作为上述技术方案的进一步优选的，本领域技术人员可以控制得到的金属镀层的厚度为6-10nm，优选8nm。
作为上述技术方案的一个优选，本领域技术人员可以控制得到的所述聚合物的厚度为0.1-1000微米。
作为上述技术方案的一个优选，所述聚合物为聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚二甲基硅氧烷(pdms)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚乙烯醇(pva)中的一种或多种的混合物。下述实例中所采用的g-sers基底的制备过程如图1所示。图2为g-sers基底的sem、tem以及afm表征，从sem和tem形貌表征可以发现，热蒸镀法制备的au膜形貌在较大面积区域内比较均匀，金膜岛状颗粒平均间隙为2～5nm。同时，利用afm表征可以对g-sers基底的平整度进行考察，从afm表征图中可以看到，不同于传统sers基底，柔性g-sers基底表面非常平整(起伏≤±2nm)。
如下为利用本发明的柔性增强拉曼基底进行拉曼光谱的测定方法。
实施例1、利用g-sers基底对不同形貌表面的拉曼分子进行定性分析
(1)g-sers基底对水相体系的检测。如图3a所示，上图为g-sers基底检测溶液体系的典型实验装置图。从下图中可以看到，在超纯水表面时，拉曼光谱中只观察到石墨烯自身的信号峰(谱线i)；而当同样的基底置于1.0×10-5m的r6g水溶液中进行检测时，可以在拉曼光谱中清晰地看到r6g分子的特征峰(谱线ii)；当将该柔性基底经过去离子水冲洗之后重新放置在水溶液表面，r6g分子的信号完全消失，只看到石墨烯的信号(谱线iii)。这说明柔性g-sers基底可以被用于循环检测过程，这进一步降低了该分析方法的成本。
(2)g-sers基底用于非水相体系的拉曼检测。对于有机相体系，g-sers基底不能在有机液体表面直接漂浮进行检测。然而在一定的条件下人们需要在非水相中进行拉曼检测。当把g-sers基底直接放在乙醇溶液中时，基底不能漂浮在液面上，并会下沉，其原因为乙醇的密度和表面张力比较小。为了发展非水溶剂中柔性g-sers基底的直接检测方法，本发明设计了塑料泡沫“救生圈”，即将g-sers基底连接在塑料泡沫救生圈的窗口上，就可将g-sers基底漂浮在乙醇液面上。利用该装置的g-sers基底对乙醇溶液中的1.0×10-5m的肽菁铜(cupc)分子进行g-sers实验，并得到了cupc分子的信号(图3b，上方的黑色谱线)。作为对照的空白溶液表面观察不到cupc分子的信号，而只能观察到乙醇溶剂分子自身的拉曼信号峰(红色谱线所示)。因此，通过对柔性g-sers基底的一个小改进，本发明实现了g-sers分析方法在非水体系(乙醇溶液)中的检测。
(3)平整金基底表面分子的拉曼检测。本发明利用g-sers基底检测了平整的金基底表面的对巯基苯胺(patp)单分子自组装膜的信号检测。平整金基底是通过在sio2/si基底上蒸镀50nm厚度的au膜制得。采用溶液浸泡法将金基底浸泡在浓度为8×10-3m的patp乙醇溶液中静置6小时进行自组装，获得patp分子基底上的自组装单分子膜，取出后用去离子水冲洗3次，用于sers实验。如图3c所示，平整基底自身没有patp分子的信号，但是在柔性g-sers基底的增强作用下，则可以清晰的看到patp分子在1074cm-1，1184cm-1处的分子信号峰。
(4)粗糙表面物种的直接检测。本发明应用柔性的g-sers基底对菜花表面吸附的cupc分子进行了检测。如图3d所示，在柔性g-sers基底增强区域可以看到cupc分子的拉曼信号和菜花表面其他物种的荧光信号(下图中的黑色曲线所示)，而在未增强区域只能看到菜花表面原本物种的荧光信号。
(5)生物细胞表面代谢分子的检测。本发明还利用g-sers基底对细胞表面代谢分子进行直接检测。如图3e所示，将2-氨基-4-叠氮丁酸分子取代海拉(hela)细胞代谢过程中需要的甲硫氨酸(met)。体系中加入1mmmet(对照)或者1mmaha，培养3h，吸出培养基，细胞用pbs缓冲溶液洗3次，用胰酶将细胞消化下来后，转移到放置了固定基底的培养皿中，在含met的培养基中继续培养8h。之后吸去培养基，用pbs洗3次，用4％多聚甲醛固定细胞15min，用pbs洗3次，将基底取出，用拉曼显微镜测试细胞的拉曼光谱。实验结果发现，加入aha分子培养的细胞表面出现了叠氮化合物在2100cm-1处的特殊峰，而在met培养的细胞表面未检测到特殊峰。这个结果说明可以通过g-sers基底来直接检测细胞表面的代谢产物。
实施例2、应用g-sers基底进行结晶紫(cv)分子的定量分析
本发明中柔性g-sers基底可以用于拉曼定量检测。
g-sers基底用于定量分析的前提是待测分子在石墨烯表面可以均匀吸附。石墨烯表面均匀吸附分子形成待测分子和内标分子的双层结构，使得分子与石墨烯内标分子的相对值为确定值，从而达到定量的目的，其所涉及的定量模型如图4a以及图4b所示。
为了验证拉曼分子在石墨烯表面的分布是均一的，首先利用转移在si/sio2基底表面的石墨烯作为拉曼增强基底，检测分子在石墨烯表面吸附的均一性，结果如图5a-c所示。将石墨烯增强基底浸入10-6m的cv溶液中1h，然后将基底取出并用超纯水轻轻冲洗，室温干燥30min之后进行拉曼检测。根据图5b所示，石墨烯表面吸附的cv分子在1180cm-1处的峰强度分布是均一的，其最大值和最小值分布在1.14×104～1.24×104之间，计算得到其强度的相对标准偏差(rsd)为9％，说明分子在石墨烯表面的信号非常均一(rsd<10％)。石墨烯本身在2650cm-1处的峰的rsd值为6％，这说明石墨烯具有很好的均一性，可以很好地作为内标分子。
如上所述，石墨烯作为内标分子可以消除系统误差，包括热点分布不均和仪器误差，结果如图5d-f所示。选择表面15个不同的测试点进行测试，每个点的激光聚焦状态和扫描位置发生变化，其拉曼光谱如图5d所示，从图中可以看到分子和石墨烯的拉曼光谱强度发生同步增大或减小。对这些点的分子的峰强度进行统计分析，其相对标准偏差(rsd)高达69％，说明激光强度聚焦强度变化导致了很大检测误差。但是当选择石墨烯作为内标分子，将分子的峰与石墨烯2650cm-1处的峰的相对强度(ir)作为分子的拉曼信号时，其ir值的相对标准偏差降为～10％，这说明利用石墨烯作为内标分子可降低测定的相对标准偏差，提高了检测的准确性和可重复性。
本发明中g-sers基底在溶液表面吸附时间的确定主要采用如下步骤：将g-sers基底置于待测溶液表面，并立即进行拉曼检测和计时，每隔1min进行一次拉曼检测，直到拉曼强度不发生变化。如图6a-d显示的是结晶紫(cv)分子和罗丹明b(rhb)分子的吸附稳定时间，从图中可以看到，cv分子和罗丹明b分子在石墨烯表面的吸附在5～10min之内均能达到稳定，标志是分子的拉曼信号不再随着时间的变化发生变化。在本发明的所有拉曼检测试验中，将基底放置在溶液表面并吸附10min以上再进行检测。
本发明应用g-sers基底在线定量检测了溶液中的cv分子，如图7a-e所示。图7a显示了一系列不同浓度的cv溶液的拉曼光谱，cv溶液的浓度在图中标出。拉曼光谱的检测均在上述的10min的吸附稳定时间之后进行。可以看出，cv分子的强度随着浓度的增加而增加，而石墨烯的峰值强度也略有波动，这可能是由于不同样品的不同聚焦状态导致的。g-sers基底对cv分子的检测限(lod)为10-8m(即4.1ng/ml)。为了证明sers定量的可靠性，选择了cv分子的四个具有代表性的峰来校准强度波动，即在810cm-1(面外模式)、916cm-1(面内模式)、1365cm-1(面内模式)和1621cm-1(面内模式)，并获得四个峰的ir在10-8m～10-5m浓度范围内的拉曼强度-浓度变化曲线，结果参见图7b。图7c显示在10-8至10-7m的低浓度范围内，ir和cv的浓度呈一定的线性关系。分子在石墨烯表面的吸附数量可以从石墨烯上分子的表面覆盖度获取，是sers定量分析的基础，这个值可以从langmuir等温吸附模型获得：
其中c是溶液中cv分子的浓度；imax和ie分别是图7b中的平台区域中的最大拉曼强度和浓度为c的溶液的拉曼强度；kt是吸附常数(l·mol-1)，主要与分子在石墨烯表面的亲和力和吸附能相关。利用公式(1)拟合图7b中的数据，图中的实线为拟合曲线，拟合结果发现ir-c的拟合符合langmuir吸附曲线，其拟合度r2高达0.998。对于选取的四个标志性的拉曼振动模，获得的langmuir常数(kt)为(3.35±0.25)×106m-1，相对的标准偏差很小(<10％)。然后，可以从拟合得到的kt根据公式(2)获得不同浓度的分子的表面覆盖度：
公式(2)中覆盖度(θ)与cv分子浓度(ccv)的关系如图8所示，可以看到在低浓度范围内覆盖度与分子的浓度呈线性关系，并且随着溶液浓度的增加表面覆盖度逐渐偏离线性，并在较大的浓度范围内呈langmuir吸附模型。这主要是由于在低浓度范围内，分子间的作用力较弱，分子在石墨烯表面的量主要与分子在溶液中的浓度和吸附常数有关，因此在这个范围内分子的拉曼强度与浓度呈线性关系。在较大的浓度时，由于表面吸附的分子逐渐达到饱和，从而使得表面覆盖度的增加不再是呈线性。cv分子具有扇叶式结构，每个扇叶由一个苯环和一个氨基组成，三个分支之间的夹角为120°，分子中心与末端基团之间的距离大约为
n＝alaser/amole＝3.9×105molecules(3)
根据公式(3)中计算出的分子检测的总量以及覆盖度的大小，可以相应地得到在不同浓度下石墨烯表面分子的个数。相应地，也可以根据测到的拉曼光谱的值得到相应地表面覆盖度，从而计算出溶液中cv分子的浓度，从而达到定量分析的目的。
实施例3、应用g-sers基底进行实际体系中罗丹明b(rhb)分子的定量检测
本发明应用g-sers基底对罗丹明b(rhb)分子的实际体系进行定量分析。rhb分子是一种具有亮玫瑰红色的合成染料分子，常用作造纸和皮革等工业染料，但是也有一些不法商人将其用于食品添加，而长期摄入这种染料分子会导致癌症的发生。本发明检测了一系列的不同浓度的rhb的标准溶液的拉曼光谱，并得到测定曲线。如图9c中所示，对于纯的rhb溶液和添加了rhb分子的饮料样品，可以清楚地看到rhb在1651cm-1(芳香环c-c弯曲振动和c＝c伸缩振动)处的代表峰，而空白的饮料样品则未出现rhb的拉曼峰。通过计算可以得到ir值分别为0.165和0.147，对应rhb的浓度分别为(1.13±0.11)×10-6m和(0.83±0.08)×10-6m。饮料样品中测得的rhb浓度略低17％，这可能是由于其他组分的竞争性吸附，这表明sers定量测试时可能存在一定的缺陷，即需要克服复合体系中非待分析物的竞争吸附。但是该方法获取的值是比较接近真实浓度的，说明利用本发明的方法具有较好的可信度。
实施例4、应用g-sers基底检测分子在透析膜中的释放过程
为了进一步证明在g-sers基底的原位定量的实际应用，本发明还利用g-sers基底实现了对分子在半透析膜中释放过程的实时监测。本发明利用g-sers基底实时检测rhb分子穿透截止分子量为500d的透析袋来模拟其实际应用(例如实际应用中的药物的控释过程)。图10a显示了使用g-sers基底检测rhb分子通过渗透膜的示意图，将装有1.0ml初始浓度为1.5×10-5m的rhb溶液的透析袋置于14.0ml超纯水中，将g-sers基底置于溶液表面，每隔2h～5h进行拉曼监测。图7b中绘制了透析袋外的rhb分子的拉曼强度随时间的变化曲线，插图为相应浓度与时间的依赖关系。从图中可以看出，～40小时后透析袋内外达到平衡浓度(1.0×10-6m)。从扩散的角度看，在溶液表面和膜的外表面之间存在浓度梯度，并且扩散过程应该利用菲克第二定律进行描述。然而，由于rhb分子在溶液中的扩散以及在石墨烯上的吸附平衡时间(～5分钟)比检测间隔(2小时)短得多，因此在拉曼测量期间溶液中的浓度可认为是均匀的，因而可以通过g-sers表面检测到的rhb信号来得到体相溶液中的浓度。从图10c可以得到～50％的分子在透析5小时后释放，～90％在31h后释放。对于具有较大针孔尺寸(例如截止分子量1000d)的透析膜，分子在膜中的释放过程快得多，即约40分钟的平衡时间。使用g-sers基底检测溶液中的痕量物种是非常简便的，在这些实验中(对于cv和rhb)，基底对待测分子的检测限分别为10-7m至10-8m，而且这些检测限可以进一步通过优化g-sers基底中的金属纳米层的结构来改善，如设计不同的纳米阵列。