本发明涉及水产学领域，具体地说，是一种利用眼睛晶体研究头足类不同生活史阶段摄食生态的方法。
背景技术：
头足类为软体动物门头足纲动物的统称，它们是重要的海洋经济种类，广泛分布于世界各大洋和南极等海域。头足类在海洋生态系统中起着承上启下的作用，因此其摄食生态是头足类的重点研究内容，一直以来受到国内外学者广泛关注。胃含物分析是分析头足类摄食生态的传统方法，近年来，随着氮稳定同位素分析法的兴起，肌肉、内壳和角质颚等组织被广泛用于头足类的摄食生态分析。然而，肌肉只能分析头足类最近几周的摄食生态，内壳和角质颚尽管可以分析整个生活史过程的摄食生态，但是由于其自身结构的生长特征而无法准确的分析不同生活史阶段头足类的摄食生态。本方法通过分析不同生长阶段眼睛晶体的碳氮稳定同位素来分析头足类的摄食生态，为头足类的摄食生态研究提供了一个新方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种利用眼睛晶体研究头足类不同生活史阶段摄食生态的方法，该方法利用体积大、容易提取、生长规律的眼睛晶体来研究头足类的摄食生态，包括头足类不同生活史阶段眼睛晶体断面的剥离和碳氮稳定同位素测定，主要步骤为提取、清洗、保存、晶体分层剥离、烘干、研磨、包埋、稳定同位素测定和摄食生态分析等过程；对眼睛近端晶体由外围向核心对代表不同时间段的不同断面分层剥离取样，在同位素比质谱仪上对不同断面的晶体进行碳氮稳定同位素的测定和摄食生态分析。
本发明的第一方面，提供一种利用眼睛晶体研究头足类不同生活史阶段摄食生态的方法，包括如下步骤：
A、分离：取出眼睛晶体，移除较小的远端晶体，保留较大的近端晶体；
B、浸泡：用蒸馏水浸泡近端晶体5分钟，使其充分吸水；
C、测量：(用游标卡尺)测量步骤B处理过的近端晶体的直径；
D、微取样：在解剖镜下，由晶体最外层向晶体核心剥离0.5mm左右宽的晶体(微取样采用无水酒精消毒过的宽头镊子，以免造成取样时交叉污染)；
E、再测量：(用游标卡尺)测量步骤D剥离晶体后剩余晶体的直径；
F、重复以上步骤D和步骤E的过程，直至晶体核心部分直径约为0.5mm，依据晶体大小的不同可得若干个晶体不同时间断面的晶体样品；
G、标样选取：分别选取USGS 24(-16.049‰V-PDB)和USGS 26(53.7‰V-N2)的标准品作为碳和氮稳定同位素的校准；
H、碳氮稳定同位素的测定：在同位素比质谱仪上对不同时间断面的晶体样品进行碳氮稳定同位素的测定；
I、根据碳氮稳定同位素值确定头足类不同生活史阶段的摄食生态(营养级每增加一级碳稳定同位素升高0.5‰-1.5‰，氮稳定同位素升高2.0‰-3.5‰)。
优选的，所述的步骤A分离之前对眼睛晶体进行预处理，包括如下步骤：
i、提取：用手术刀划破眼球，用镊子取出一对晶体；
ii、清洗：用清水将晶体表面清洗干净；
iii、保存：将经步骤ii处理的晶体放入75％的酒精中保存。
优选的，所述的步骤H中用于碳氮稳定同位素的测定的晶体样品的制备方法包括以下步骤：
a、烘干：将不同断面的晶体样品，分别放入干燥箱中烘干；
b、研磨：烘干后的样品在冷冻混合球磨仪中研磨成粉末，并用100目的筛子过筛；
c、称量：用百万分之一电子天平称量过筛粉末约1.5mg；
d、包埋：称取的粉末置于锡舟中包埋，得到用于碳氮稳定同位素的测定的晶体样品。
本发明的第二方面，提供一种头足类不同生活史阶段眼睛晶体断面的剥离方法，包括以下步骤：
A、分离：取出眼睛晶体，移除较小的远端晶体，保留较大的近端晶体(将较小的远端晶体移除，同时保留较大的近端晶体，以保证微取样时有足够的晶体量来完成稳定同位素测定)；
B、浸泡：用蒸馏水浸泡近端晶体5分钟，使其充分吸水(浸泡时使晶体充分吸水，这样有助于晶体的剥离)；
C、测量：(用游标卡尺)测量步骤B处理过的近端晶体的直径；
D、微取样：在解剖镜下，由晶体最外层向晶体核心剥离0.5mm左右宽的晶体(微取样采用无水酒精消毒过的宽头镊子，以免造成取样时交叉污染)；
E、再测量：(用游标卡尺)测量步骤D剥离晶体后剩余晶体的直径；
F、重复以上步骤D和步骤E的过程，直至晶体核心部分直径约为0.5mm，依据晶体大小的不同可得若干个晶体不同断面的晶体样品。
本发明实施时，可根据眼晶体生长纹与头足类日龄的关系，确定眼睛体生长纹的周期性(即多少条生长纹代表1日龄)，然后根据仔鱼期、稚鱼期、亚成鱼期、成鱼期等各期头足类的日龄范围确定各期的眼睛体直径，从而确定各期眼睛体的取样点范围。
优选的，所述的步骤A分离之前对眼睛晶体进行预处理，包括如下步骤：
i、提取：用手术刀划破眼球，用镊子取出一对晶体；
ii、清洗：用清水将晶体表面清洗干净；
iii、保存：将经步骤ii处理的晶体放入75％的酒精中保存。
本发明的第三方面，提供一种头足类不同生活史阶段眼睛晶体断面碳氮稳定同位素测定方法，包括如下步骤：
步骤一，标样选取：分别选取USGS 24(-16.049‰V-PDB)和USGS 26(53.7‰V-N2)的标准品作为碳和氮稳定同位素的校准；
步骤二，碳氮稳定同位素的测定：在同位素比质谱仪上对不同断面的样品进行碳氮稳定同位素的测定。
优选的，所述的步骤二中用于碳氮稳定同位素的测定的晶体样品的制备方法包括以下步骤：
a、烘干：将不同断面的晶体样品，分别放入干燥箱中烘干；
b、研磨：烘干后的样品在冷冻混合球磨仪中研磨成粉末，并用100目的筛子过筛；
c、称量：用百万分之一电子天平称量过筛粉末约1.5mg；
d、包埋：称取的粉末置于锡舟中包埋，得到用于碳氮稳定同位素的测定的晶体样品。
本发明优点在于：
1、本发明提供的一种利用眼睛晶体研究头足类不同生活史阶段摄食生态的方法，眼睛晶体容易提取、剥离方便，信息储存稳定，眼睛晶体分析头足类不同生活史阶段的摄食生态更直接、更准确；
2、本发明方法中选择较大的近端晶体确保了微取样时每一个生活史阶段都有足够的晶体样本来完成稳定同位素测定，此外用水浸泡晶体有助于不同时间段晶体层的分离，体高了不同生活阶段摄食生态分析的准确性；
3、由于头足类尤其大洋性柔鱼类不同生活史阶段的样本很难获取，因此无法直接掌握其不同生活史阶段的摄食生态信息，本发明通过以眼睛晶体不同时间断面的碳氮稳定同位素的测定，可间接获取头足类不同生活史阶段的摄食生态信息，为头足类摄食生态的研究提供了新途径。
附图说明
图1.头足类眼睛晶体不同时间断面碳氮稳定同位素取样示意图(取样点1、2、3、4分别代表仔鱼、稚鱼、亚成鱼和成鱼期的眼晶体断面)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1：利用眼睛晶体研究头足类不同生活史阶段摄食生态的方法
操作步骤如下：
1、提取：用手术刀划破眼球，用镊子取出一对晶体；
2、清洗：用清水将晶体表面清洗干净；
3、保存：将经步骤(2)处理的眼晶体放入75％的酒精中保存；
4、分离：取出晶体，移除晶体的远端，保留晶体近端；
5、浸泡：用蒸馏水浸泡近端晶体5分钟，使其充分吸水；
6、测量：用游标卡尺测量步骤(5)处理过的近端晶体的直径；
7、微取样：在解剖镜下，用经过无水酒精消毒过的宽头镊子由晶体最外层向晶体核心剥离0.5mm左右宽的晶体；
8、再测量：用游标卡尺测量步骤(7)剥离晶体后剩余晶体的直径；
9、重复以上步骤(7)和(8)的过程，直至晶体核心部分直径约为0.5mm，依据晶体大小的不同可得若干个晶体不同时间断面的晶体样品；
具体见图1，图1是头足类眼睛晶体不同时间断面碳氮稳定同位素取样示意图(取样点1、2、3、4分别代表仔鱼、稚鱼、亚成鱼和成鱼期的眼晶体断面)。
10、烘干：将不同断面的晶体样品，分别放入干燥箱中烘干；
11、研磨：烘干后的样品在冷冻混合球磨仪中研磨成粉末，并用100目的筛子过筛；
12、称量：用百万分之一电子天平称量过筛粉末约1.5mg；
13、包埋：称取的粉末置于锡舟中包埋；
14、标样选取：分别选取USGS 24(-16.049‰V-PDB)和USGS 26(53.7‰V-N2)的标准品作为碳和氮稳定同位素的校准；
15、碳氮稳定同位素的测定：在同位素比质谱仪上对不同断面的样品进行碳氮稳定同位素的测定；
16、根据碳氮稳定同位素值确定头足类不同生活史阶段的摄食生态(营养级每增加一级碳稳定同位素升高0.5‰-1.5‰，氮稳定同位素升高2.0‰-3.5‰)。
实施例2：头足类不同生活史阶段眼睛晶体断面的剥离方法
操作步骤如下：
(1)分离：取出晶体，移除晶体的远端，保留晶体近端；将较小的远端晶体移除，同时保留较大的近端晶体，以保证微取样时有足够的晶体量来完成稳定同位素测定；
(2)浸泡：用蒸馏水浸泡近端晶体5分钟，使其充分吸水，这样有助于晶体的剥离；
(3)测量：用游标卡尺测量步骤(2)处理过的近端晶体的直径；
(4)微取样：在解剖镜下，用经过无水酒精消毒过的宽头镊子由晶体最外层向晶体核心剥离0.5mm左右宽的晶体；微取样前要用无水酒精消毒镊子，以免造成取样时交叉污染；
(5)再测量：用游标卡尺测量步骤(4)剥离晶体后剩余晶体的直径；
(6)重复以上步骤(4)和(5)的过程，直至晶体核心部分直径约为0.5mm，依据晶体大小的不同可得若干个晶体不同断面的晶体样品。
在步骤(1)分离之前要对眼睛体进行预处理，包括如下步骤：
(1)提取：用手术刀划破眼球，用镊子取出一对晶体；
(2)清洗：用清水将晶体表面清洗干净；
(3)保存：将经步骤(2)处理的眼晶体放入75％的酒精中保存。
实施例3：头足类不同生活史阶段眼睛晶体断面碳氮稳定同位素测定方法
操作步骤如下：
(1)标样选取：分别选取USGS 24(-16.049‰V-PDB)和USGS 26(53.7‰V-N2)的标准品作为碳和氮稳定同位素的校准；
(2)碳氮稳定同位素的测定：在同位素比质谱仪上对不同断面的样品进行碳氮稳定同位素的测定。
其中，步骤(2)中碳氮稳定同位素的测定步骤为：
(1)烘干：将不同断面的晶体样品，分别放入干燥箱中烘干；
(2)研磨：烘干后的样品在冷冻混合球磨仪中研磨成粉末，并用100目的筛子过筛；
(3)称量：用百万分之一电子天平称量过筛粉末约1.5mg；
(4)包埋：称取的粉末置于锡舟中包埋。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。