一种鉴别薯类食品中是否掺杂异种淀粉的方法与流程

本发明涉及食品加工技术领域，尤其涉及一种鉴别薯类食品中是否掺杂异种淀粉的方法。

背景技术：

薯类是世界上仅次于小麦、水稻、玉米的第四大粮食作物。我国是薯类生产大国，2014年我国薯类总产量约1.67亿吨，居世界首位。淀粉约占薯类干重的50-80％，是薯类的主要组成成分，薯类大多被用于制作粉条、粉丝及淀粉相关制品等。其中，由薯类制成的粉条或粉丝深受包括我国在内的广大亚洲国家和地区消费者的喜爱。

目前，薯类食品的相关检测标准缺乏，同时由于不同来源食用淀粉价格的明显差异，造成薯类食品中掺杂异种淀粉现象严重，从而导致薯类食品品质参差不齐，扰乱了市场秩序及企业的公平竞争，侵害了消费者权益，严重阻碍了薯类加工业的健康发展。

传统薯类食品尤其是薯类粉条或粉丝的鉴别方法主要有目测法、光检法、火检法、品尝法或价格法等，其存在的问题是：只能通过观察透明度、闻味、口感、价格高低等来初步推测食品中有无其他杂质或是否添加影响人体健康的物质。

申请号为201510921013.7的中国专利申请公开了采用电泳法对粉条/粉丝中是否掺杂异种蛋白的鉴别方法，该方法①标准品为蛋白纯品，因其不是原料粉中的全蛋白，不能准确反映原料粉中蛋白的全部信息，从而有可能造成漏检；②样品预处理采用Tris-HCl，聚丙烯凝胶电泳胶片上背景颜色较深，特征条带不易识别，鉴别易受干扰。因此，提出新的鉴别方法，对于促进我国薯类加工业的可持续发展，保障我国粮食安全具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种鉴别薯类食品中是否掺杂异种淀粉的方法，该方法直接以待鉴别的异种淀粉作为标准品，可准确反映原料粉中蛋白的全部信息，能够防止漏检，提高鉴别结果的精准度。具体的鉴别方法包括如下步骤：

(1)制备待测样品溶液：取薯类食品，粉碎或熟制后研磨，向其中加入含有十二烷基硫酸钠、甘油、二硫苏糖醇的中性磷酸盐缓冲溶液，使蛋白溶出，取溶有蛋白的溶液，即得；

(2)制备标准样品溶液：取制备所述薯类食品的薯粉原料以及待鉴别的所述异种淀粉的标准品，加入含有或不含有十二烷基硫酸钠的中性磷酸盐缓冲溶液，使蛋白溶出，取溶有蛋白的溶液，即得；

(3)检测与判定：采用凝胶电泳法对所述待测样品溶液和标准样品溶液进行检测，通过电泳条带判定薯类食品中是否掺杂有异种淀粉。

其中，本发明所述的薯类食品是以马铃薯粉/淀粉和/或甘薯粉/淀粉为原料制备而成的食品。所述食品包括但不局限于粉条、粉丝、粉皮、凉粉、薯片、薯条、薯干、薯脯、薯类饮料、薯类馒头、薯类面包、薯类面条、薯类花卷、薯类烤馕、薯类油条、薯类蛋糕、薯类饺子皮、薯类煎饼、薯类窝窝头、薯类发糕、薯类饼干中的一种或几种。具有适用范围广，普适性强的优势。

优选地，所述异种淀粉选自木薯粉、木薯淀粉、玉米粉、玉米淀粉中的一种或多种。所述薯粉原料的标准品选自马铃薯粉、马铃薯淀粉、甘薯粉、甘薯淀粉中的一种或多种。

采用本发明所述的鉴别方法，可用于鉴定马铃薯和/或甘薯食品中是否掺杂有玉米淀粉和/或木薯淀粉，达到快速准确的对马铃薯和/或甘薯食品质量监控的目的。

本领域技术人员可以理解，采用与本发明类似的鉴别方法，同样可以实现其他掺杂粉/淀粉的鉴别，如大米粉/淀粉、小麦粉/淀粉、大豆粉/淀粉、高粱粉/淀粉、大麦粉/淀粉、青稞粉/淀粉、谷子粉/淀粉、糜子粉/淀粉、燕麦粉/淀粉、荞麦粉/淀粉、食用豆粉/淀粉等。

待测样品中成分复杂，发明人分别以不使用蛋白提取液(样品粉碎或熟制后直接与上样缓冲液混合后上样)、以水、中性磷酸盐缓冲溶液、NaCl提取液为蛋白提取液对待测样品进行处理，发现不使用蛋白提取液和以水为蛋白提取液得到的电泳图中条带显示不完全，但电泳胶片背景颜色浅，条带易识别；以NaCl提取液处理后，提取得到的样品含盐量高，电泳条带易扩散；以中性磷酸盐缓冲溶液处理后，得到的电泳图中条带显示不完全，但电泳胶片背景颜色适中，易于辨认。

发明人进一步发现，在所述中性磷酸盐缓冲溶液中添加一定量的SDS、甘油、二硫苏糖醇(DTT)后，由于SDS可增加样品的表面活性，有助于蛋白的溶解，甘油不仅能稳定蛋白且对蛋白具有一定的促溶作用，二硫苏糖醇可还原蛋白中的二硫键，有助于蛋白的有效提取，因此，在三者的协同作用下，蛋白提取效果最佳，且电泳胶片上蛋白条带分离充分，添加物也不会影响胶片颜色，具有最佳的鉴别效果。

因此，本发明对待测样品进行处理的蛋白提取液优选为添加有SDS，甘油和DTT的中性磷酸盐缓冲溶液。其中，SDS，甘油和DTT的添加量均为1-5wt％。

最优选地，用于提取待测样品中蛋白的提取液为含有1-3wt％SDS、3-5wt％甘油和1％-3wt％DTT的中性磷酸盐缓冲溶液。

对于薯粉原料标准品或异种淀粉标准品而言，发明人分别以Tris-isopropanol或60％乙醇为蛋白提取液进行了实验，结果显示，这两种提取液提取得到的样品蛋白提取不充分，电泳条带缺失。而以含有或不含有SDS的中性磷酸盐缓冲溶液为蛋白提取液时，条带完整，电泳胶片背底颜色适中，效果良好。

因此，本发明优选以含有或不含有SDS的中性磷酸盐缓冲溶液为标准品的蛋白提取液。其中，当蛋白提取液中含有SDS时，其添加量为1-5wt％。

优选地，上述任意一种中性磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.2-7.6。

优选地，上述任意一种中性磷酸盐缓冲溶液的浓度为8-12mM。

优选地，步骤(1)和(2)中使蛋白溶出的方法为：对样品进行超声处理，经离心，取上清液，即得。

其中，所述超声处理优选在如下条件下进行：超声波频率20-60kHz，功率20-500W，超声温度25-45℃。

其中，所述离心优选在如下条件下进行：离心速度8,000-10,000g，离心时间10-60min，温度4-25℃。

其中，所述薯类食品样品或标准品与蛋白提取液的用量比为(0.1-0.5)g：(0.5-5)mL。

优选地，对于蛋白含量较低的待测样品，还包括对步骤(1)所得的上清液进行透析和/或超滤离心的步骤。该步骤能够最大程度使得样品中的蛋白被浓缩，排除其他杂质的干扰，在进行凝胶电泳时，得到清晰且分离完全的条带，确保该凝胶电泳法具有极低的检出限和精准的检测效果。

进一步优选地，所述透析采用3500-10000Da的透析膜；所述超滤离心采用3000-10000Da的超滤离心管。

本发明所述凝胶电泳为聚丙烯酰胺凝胶电泳，优选为连续胶浓度为8％-12.5％聚丙烯酰胺凝胶电泳，进一步优选为连续胶浓度为10％-12.5％聚丙烯酰胺凝胶电泳，最优选为12.5％的聚丙烯酰胺凝胶电泳。发明人同时对6％与15％的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行了平行鉴别实验，发现此两种凝胶电泳无法实现具有较小或较大分子量的蛋白质鉴别，而8％-12.5％(尤其是12.5％)聚丙烯酰胺凝胶电泳具有极佳的分离效果，能够很好的实现对待测样品以及标准品中全蛋白的分离和鉴别。

优选地，本发明凝胶电泳采用恒流或恒压方式，恒流或恒压操作不仅能够保证蛋白质具有高的分辨率，且操作简化。

所述恒流的电流优选为20-30mA，恒压的电压优选为80-120V。

优选地，向所述待测样品溶液和标准样品溶液中加入上样缓冲液，混合均匀后再进行电泳，其中，所述上样缓冲溶液为还原型或非还原型上样缓冲液，优选为还原型上样缓冲液。与采用非还原型上样缓冲液相比，采用还原型上样缓冲液得到电泳胶片中蛋白条带分子量差异显著。

上样缓冲液的用量为本领域技术人员所知晓，本发明优选采用1-5倍(最优为5倍)于样品的上样缓冲液。

优选地，电泳结束后，采用考马斯亮蓝染色法或银染法进行染色，优选为银染法。

作为本发明最佳的鉴别方法，包括如下步骤：

(1)制备待测样品溶液：取薯类食品，粉碎或熟制后研磨，向其中加入含有1-3wt％十二烷基硫酸钠、3-5wt％甘油、1％-3wt％二硫苏糖醇的中性磷酸盐缓冲溶液，超声，离心，取上清液，即得；

(2)制备标准样品溶液：取制备所述薯类食品的薯粉原料以及待鉴别的所述异种淀粉的标准品，加入含有或不含有1％-3wt％十二烷基硫酸钠的中性磷酸盐缓冲溶液，超声，离心，取上清液，即得；

(3)检测：分别向所述待测样品溶液和标准样品溶液中加入还原型上样缓冲溶液，采用8％-12.5％的连续胶在恒流或恒压条件下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；

(4)判定：电泳结束后，采用银染法对蛋白染色，根据条带位置判定待测样品中是否掺杂有异种淀粉。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以互相组合，即得本发明各较佳实例。

本发明具有以下优点：

(1)本发明直接以拟鉴别的异种淀粉作为标准品，与以蛋白为标准品相比，具有可准确反映原料粉中蛋白的全部信息、防止漏检的优势。(2)本发明对待测样品的预处理采用含有一定的钾、钠盐离子浓度的磷酸盐缓冲溶液，离子强度高，可以调节蛋白的溶解性、稳定性，从而能将样品中的蛋白最大限度溶出。(3)本发明对于蛋白含量低的待测样品进行透析和/或超滤离心，能够确保该凝胶电泳法具有极低的检出限和精准的检测效果。(4)本发明提供的薯类食品鉴别方法克服了目测法、光检法、火检法、品尝法或价格法等传统掺假方法的缺陷，具有可准确定性、初步定量的特点，满足了消费者对健康饮食的需求。(5)本发明只需要超声装置、离心机及电泳仪等设备，且操作简单，易于薯类食品的快速鉴别，易于大范围推广。

附图说明

图1为本发明实施例2中甘薯、马铃薯、木薯和玉米淀粉中蛋白组成的电泳图。其中，M：分子量标样；泳道1：马铃薯淀粉蛋白；泳道2：甘薯淀粉蛋白；泳道3：木薯淀粉蛋白；泳道4：玉米淀粉蛋白。

图2为本发明实施例3中甘薯粉条鉴别的电泳图。其中，M：分子量标样；泳道1-5为10％木薯淀粉粉条；其中，泳道1：提取液为PBS；泳道2：提取液为PBS+2％SDS；泳道3：提取液为PBS+2％SDS+4％甘油；泳道4：提取液为PBS+2％SDS+4％甘油+3％DTT。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。其中，所述磷酸盐缓冲溶液为浓度10mM，pH为7.4的溶液。

实施例1甘薯粉、马铃薯粉、木薯粉和玉米粉的蛋白组成

1)分别称取0.3g甘薯粉、马铃薯粉、木薯粉及玉米粉，向其中分别加入0.5ml磷酸盐缓冲溶液，混合均匀后超声(超声波频率为50kHz，超声波功率为200W，温度为30℃)处理60min，10,000g离心10min，取上清液；

2)将所得上清液与5倍还原型上样缓冲液混合后进行12.5％聚丙烯酰胺凝胶电泳，上样量10μL，电泳在恒流30mA下进行，电泳完毕后采用考马斯亮蓝法对蛋白进行染色与判定。

结果发现，在还原条件下，甘薯粉主要有两条条带，分别为β-淀粉酶和Sporamin，其分子量分别约为55和25kDa。马铃薯粉主要由两条条带，分别是蛋白酶抑制剂(5-25kDa)和Patatin(39-45kDa)。木薯粉中蛋白的分子量主要分布于15-100kDa之间。玉米粉主要有四条条带，分子量分别约为24、27、54和66kDa。

实施例2甘薯淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉和玉米淀粉的蛋白组成

1)分别称取0.3g甘薯淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉及玉米淀粉，分别向其中加入0.5ml含有2％SDS的磷酸盐缓冲溶液，混合均匀后超声(超声波频率为50kHz，超声波功率为200W，温度为30℃)处理60min，10,000g离心10min取上清液，进行超滤离心；

2)将超滤离心后的上清液与5倍还原型上样缓冲液混合后进行12.5％聚丙烯酰胺凝胶电泳，上样量10μL，电泳在恒流30mA下进行，电泳完毕后采用银染法对蛋白进行染色与判定。

结果如图1所示，在还原条件下，甘薯淀粉主要有两条条带，分别为β-淀粉酶和Sporamin，其分子量分别约为55和25kDa。马铃薯淀粉主要由两条条带，分别是蛋白酶抑制剂(5-25kDa)和Patatin(39-45kDa)。木薯淀粉的分子量主要分布于20-100kDa之间。玉米淀粉的分子量主要分布于15-70kDa之间。

实施例3甘薯粉条的鉴别

以10％木薯淀粉和90％甘薯淀粉为原料制备粉条，所得粉条记为10％木薯淀粉粉条，采用如下方法进行鉴别：

1)取4份重量为3g的10％木薯淀粉粉条熟制、研磨，分别向其中加入10ml磷酸盐缓冲溶液、含有2％SDS的磷酸盐缓冲溶液、含有2％SDS、4％甘油的磷酸盐缓冲溶液、含有2％SDS、4％甘油和3％DTT的磷酸盐缓冲溶液，混合均匀后超声波(超声波频率为50kHz，超声波功率为200W，温度为30℃)处理60min，10,000g离心10min取上清液，然后超滤离心；

2)将超滤离心后的上清液与5倍还原型上样缓冲液混合后进行12.5％聚丙烯酰胺凝胶电泳，上样量10μL，电泳在恒流30mA下进行，电泳完毕后采用银染法对蛋白进行染色与判定，结果如图2。

从图2可以看出，与采用磷酸盐缓冲溶液、含有2％SDS的磷酸盐缓冲溶液、含有2％SDS、4％甘油的磷酸盐缓冲溶液提取的粉条蛋白相比，采用含有2％SDS、4％甘油和3％DTT的磷酸盐缓冲溶液提取的蛋白条带分离效果最好，而其他三种溶液提取的粉条蛋白有缺带现象出现。在10％木薯淀粉粉条中，除了甘薯淀粉中的β-淀粉酶和Sporamin两条条带外，还检测出3条木薯淀粉的特征条带，说明本发明所述的方法能够准确实现异种淀粉的鉴别。

实施例4马铃薯粉条的鉴别

分别以马铃薯淀粉，10％木薯淀粉+90％马铃薯淀粉，20％木薯淀粉+80％马铃薯淀粉，10％玉米淀粉+90％马铃薯淀粉，20％玉米淀粉+80％马铃薯淀粉为原料制备粉条，所得粉条分别记为100％马铃薯淀粉粉条、10％木薯淀粉粉条、20％木薯淀粉粉条、10％玉米淀粉粉条和20％玉米淀粉粉条，采用如下方法进行鉴别：

1)将上述粉条粉碎后，过100目筛，分别取0.3g加入3ml含有2％SDS、4％甘油和3％DTT的磷酸盐缓冲溶液，混合均匀后超声波(超声波频率为50kHz，超声波功率为200W，温度为30℃)处理60min，10,000g离心10min取上清液，然后超滤离心；

2)将超滤离心的上清液与5倍还原型上样缓冲液混合后进行12.5％聚丙烯酰胺凝胶电泳，上样量10μL，电泳在恒流30mA下进行，电泳完毕后采用银染法对蛋白进行染色与判定。

结果显示：在10％和20％木薯淀粉粉条中，除了马铃薯淀粉的胰蛋白酶抑制剂和patatin两条条带外，还检测出3条木薯淀粉的特征条带；在10％和20％玉米淀粉粉条中，除了马铃薯淀粉的胰蛋白酶抑制剂和patatin条带外，还检测出2条玉米淀粉的特征条带。

实施例5马铃薯粉条的鉴别

分别以马铃薯淀粉、5％木薯淀粉+5％玉米淀粉+90％马铃薯淀粉为原料，制备粉条，采用如下方法进行鉴别：

1)分别取3g上述两种粉条熟制、研磨后，向其中加入10ml含有2％SDS、4％甘油和3％DTT的磷酸盐缓冲溶液，混合均匀后超声波(超声波频率为50kHz，超声波功率为200W，温度为30℃)处理60min，10,000g离心10min取上清液，然后超滤离心；

2)将超滤离心后的上清液与5倍还原型上样缓冲液混合后进行12.5％聚丙烯酰胺凝胶电泳，上样量10μL，电泳在恒流30mA下进行，电泳完毕后采用银染法对蛋白进行染色与判定。

结果显示：与100％马铃薯粉条相比，同时添加了5％木薯淀粉和5％玉米淀粉的粉条，除了马铃薯淀粉的胰蛋白酶抑制剂和patatin条带外，还检测出3条木薯淀粉的特征条带，2条玉米淀粉的特征条带，说明本发明所述的方法能够准确实现两种异种淀粉的鉴别。

实施例6粉丝的鉴别

1)取市购某品牌的马铃薯粉丝，粉碎后，过200目筛，取0.2g加入2ml含有2％SDS、4％甘油和3％DTT的磷酸盐缓冲溶液，混合均匀后超声波(超声波频率为40kHz，超声波功率为100W，温度为25℃)处理40min，离心取上清液，透析除盐后浓缩；

2)将所得浓缩液与5倍还原型上样缓冲液混合后进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，上样量10μL，电泳在恒流20mA下进行，电泳完毕后采用银染法对蛋白进行染色与判定，结果显示：该品牌粉丝与马铃薯淀粉的色带一致，该粉丝未掺杂其他异种淀粉。

实施例7粉条的鉴别

1)取市购某品牌的马铃薯粉条，粉碎后，过100目筛，取0.3g加入3ml含有2％SDS、4％甘油的磷酸盐缓冲溶液，混合均匀后超声波(频率为55kHz，超声波功率为100W，温度为25℃)处理60min，离心取上清液，透析除盐后浓缩；

2)将浓缩后溶液与5倍还原型上样缓冲液混合后进行12.5％聚丙烯酰胺电泳，上样量10μL，电泳在恒压80V下进行，电泳完毕后采用银染法对蛋白进行染色与判定，结果显示：该品牌粉条中检测出了木薯淀粉的特征条带，该粉丝掺杂有木薯淀粉。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。