一种淀粉霉新菌株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种淀粉霉（Amylomyces?rouxii）新菌株CZ1，其保藏号为CGMCC?No.6874，保藏日期为2012年11月23日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明还公开了含有其的菌剂。在堆体中接种本发明的淀粉霉新菌株CZ1，在北方低温季节能迅速提高堆体温度，且能使堆体保持50℃以上的高温15天，缩短了发酵周期，能有效杀灭动物粪便中的病原物和寄生虫。堆肥发酵结束后，堆肥产物养分含量高，pH8.0左右，可作为优良的植物有机肥使用。
【专利说明】一种淀粉霉新菌株及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于堆肥领域，具体涉及一种堆肥用微生物及其应用。
【背景技术】
[0002]我国畜禽养殖业经过近30年的快速发展，极大的满足了城乡居民对于肉蛋奶的需求。然而我国畜禽养殖迅速发展的同时，不可避免带来每年超过20亿吨畜禽粪污的产生，同时有大量的畜禽粪便不能及时消纳，特别是快速兴起的养殖小区的出现，导致粪污大面积堆积或随意丢弃，不但使农业资源不能及时有效地利用，也已成为土壤、水体污染的主要污染源，并且将限制养殖业的可持续发展。2013年中共中央国务院一号文件再次重申了“强化农业生产过程环境监测，积极开展农业面源污染和畜禽养殖污染防治”工作；北京市十二五发展规划也将“研究废弃物无害化处理和资源利用技术与装备的系列化、标准化，提高生产能力”和“在调整高端农业产业布局的同时，高度关注农业发展对环境、能源和水资源的影响”列入工作重点。因此，在确保畜禽养殖产业有效发展、确保农民收入的前提下，有效地处置、利用畜禽废弃物、减少环境和生态的污染风险迫在眉睫。
[0003]目前好氧堆肥是实现畜禽粪便资源化利用的最主要手段。然而传统自然堆肥法由于堆肥初期有益微生物数量少，繁殖速度慢，因此发酵时间长、易产生臭味，堆肥效率低下。而在堆肥化过程中添加外源菌剂有利于畜禽粪便堆肥腐熟。但是当前市场上成熟的商品菌剂多为国外引进，价格昂贵，种类不多，应用范围宽泛。接种这些外源菌剂，在初期容易出现堆料中土著微生物与之激烈的竞争，导致外源菌剂无法在堆料中快速定殖，因此发挥的作用大打折扣。同时，由于已有的商品菌剂大多缺乏针对性，在北方低温季节接种后，堆料很难迅速升温，无法及时发挥应有的作用。目前我国北方地区在低温季节存在粪污无法及时的连续处理导致大量堆积、需要增加额外的粪污存储场地或设施、有机肥生产在低温季节无法正常运行等问题。因此筛选能在低温季节使堆料迅速升温的微生物菌株，对于解决北方地区粪污的连续处理和有机肥生产周年进行具有重要的实用价值。
【发明内容】
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[0004]本发明首先提供淀粉霉(Amylomyces rouxii)新菌株CZl。
[0005]本发明还提供含有所述淀粉霉CZl的菌剂。
[0006]本发明的菌株分离与筛选过程如下:
[0007]①采用平板稀释法分别从新鲜牛粪、高温发酵阶段牛粪以及腐熟后的牛粪中进行微生物分离。称取各样品各IOg分别放入装有90mL无菌水的三角瓶中，在摇床上振荡30min，使样品充分分散，静置20min后即为KT1稀释液，然后连续稀释制成10_2_10_8浓度的稀释液备用。取100 μ L各浓度的稀释液，采用常规涂抹法用涂布器在改良高氏I号固体培养基上涂布，每个浓度梯度三个重复，分别置于25°C、35°C、50°C恒温培养箱中培养。3d后挑取平板上长出的单菌落，进一步纯化培养，并于4°C保存。
[0008]改良高氏I号培养基，其中葡萄糖10.0g/L、蛋白胨5.0g/L、KNO3L Og/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4.7Η200.5g/L、NaCl0.5g/L、FeSO40.01g/L、水 1000ml、pH7.2、琼脂
1.5%-2.0%。
[0009]②根据菌株在纤维素一刚果红平板上形成透明圈的快慢、透明圈明晰程度、透明圈与菌落直径比值(D/d)的大小，筛选出了 I株中温菌，该菌株在培养的第2天即出现清晰的透明圈，在培养第4天D/d达到10.7。该菌株菌落边缘不整齐绒毛长，草丛状，洁白色，毛上有黑色孢子。
[0010]③测定该菌株的ITS序列进行分子生物学鉴定，所用引物为ITSl:TCCGTAGGTGAACCTGCGG (SEQ ID N0.2) ；ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC (SEQ ID N0.3)，序列如SEQ ID N0.1所示，与其它公布的淀粉霉的ITS序列同源性为99%以上，鉴定为淀粉霉(Amylomyces rouxii),命名为CZl,并于2012年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC N0.6874。
[0011]本发明的淀粉霉CZl可制备成菌剂，其中，淀粉霉CZl的活菌数可为50亿/克以上，优选为100亿/克以上。
[0012]本发明还提供所述生物菌剂的制备方法，其为在液体发酵培养基中发酵淀粉霉CZ1，将得到的发酵液即为生物菌剂。
[0013]其中，优选的发酵培养基为高氏I号液体培养基。
[0014]优选的，所述的制备方法可具体包括如下步骤:
[0015]将淀粉霉CZl接种至改良高氏I号固体培养基斜面，于35°C恒温条件培养48_72h得到斜面种子；`
[0016]将斜面种子接种至改良高氏I号液体培养基，于35°C恒温条件，120-200r/min转速振荡培养48-72h得到液体种子；
[0017]将液体种子以0.5-10% (V/V，即每100ml液体培养基接种0.5-lOml液体种子)接种量，接种到液体发酵罐中的生产培养基中，进行菌种生产，于持续通气条件下，35°C恒温培养3-4天。培养结束后，将菌种盛放于灭菌的容器内，置于阴凉干燥处保存。
[0018]优选的，还可以根据本领域常规方法将制备的淀粉霉CZl发酵液进行冷冻干燥，从而制备冻干粉形式的生物菌剂。
[0019]在堆体中接种本发明的淀粉霉新菌株CZ1，能在环境温度为8°C左右的条件下，使堆肥迅速起爆，且能使堆体保持50°C以上的高温15天，缩短了发酵周期，能有效杀灭动物粪便中的病原物和寄生虫。堆肥发酵结束后，堆肥产物养分含量高，PH8.0左右，可作为优良的植物有机肥使用。该菌株适于北方低温季节畜禽粪便的堆肥化处理，对于解决北方地区低温季节粪污无法及时处理而导致粪污堆积、额外增加粪污存储场地或设施、有机肥生产暂停等问题具有重要的应用价值，可以实现北方地区养殖粪污的连续处理和有机肥生产周年进行。
[0020]本发明提供了一种适于北方低温季节畜禽粪便堆肥化处理的微生物菌株。该菌株来源于不同发酵阶段的畜禽粪便，经过驯化配比后又应用于畜禽粪便堆肥过程，保证了菌剂的分离环境与目标应用环境的相似性，提高了菌剂的有效性，解决了通常情况下堆肥添加外源菌剂无法与堆料中土著微生物竞争，导致在堆料中难于快速定殖的困难。同时解决了北方地区低温季节粪污无法及时处理而导致的粪污堆积、额外增加粪污存储场地活设施，有机肥生产暂停等局面，可以实现北方地区粪污的连续处理和有机肥生产周年进行。
[0021]说明书附图
[0022]图1所示为不同堆肥处理温度变化情况。
【具体实施方式】
[0023]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0024]若无特别说明，本发明中所述的“份”是指“重量份”;
[0025]实施例1淀粉霉菌剂的制备
[0026]将淀粉霉CZl接种至改良高氏I号固体培养基斜面，于35°C恒温条件培养72h得到斜面种子；
[0027]将斜面种子接种至改良高氏I号液体培养基，于35°C恒温条件，180r/min转速振荡培养72h得到液体种子；
[0028]将液体种子以5% (V/V,即每100ml液体培养基接种5ml液体种子)接种量,接种到液体发酵罐中的生产培养基中，进行菌种生产，于持续通气条件下，35°C恒温培养4天。培养后的发酵液即可作为菌剂使用。
[0029]所述的改良高氏I号固体培养基成分为:其中葡萄糖10.0g/L、蛋白胨5.0g/L、KNO3L Og/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4.7Η200.5g/L、NaCl0.5g/L、FeSO40.01g/L、水 1000ml、pH7.2、琼脂2.0%，分装入试管中，每管5-10ml，塞上棉塞，高温高压灭菌20min，之后摆成斜
面。`
[0030]所述的改良高氏I号液体培养基成分同前，无琼脂。
[0031]实施例2
[0032]将新鲜牛粪与粉碎秸杆以一定比例进行混合，调整堆料的C/N为28-32，含水量为60%。
[0033]将实施例1生产的菌剂按照质量比5%。接种到堆料混合物中，定期翻堆通气，进行堆肥发酵。同时以不接入本发明的菌剂的堆体为对照。
[0034]接种本发明所述微生物菌剂的堆料与自然堆肥的堆料相比(见表1及图1)，在低温环境条件(5°C左右)下，堆料起爆速度快，升温迅速，堆体最高温度高，发酵周期短，其C/N下降迅速，这些结果表明向以牛粪为主的堆料中接种本发明所述的微生物菌剂能够在北方低温季节加快堆料的腐熟进程。
[0035]堆肥结束后及时取样，用小土钻钻取堆体表层下40~50cm处样品，风干后研磨，测定有机质、全氮、全磷、全钾含量。通过对比分析接种本发明所述微生物菌剂的堆肥产物与自然堆肥的产物中养分含量(见表2)，发现接种本发明所述微生物菌剂的堆肥产物中，其全氮、全磷、全钾以及有机质含量均显著高于自然堆肥的产物，这表明向以牛粪为主的堆料中接种本发明所述的菌剂更有利于堆料中养分转化与保存。
[0036]表1本发明所述微生物菌剂对堆肥腐熟程度的影响
[0037]
【权利要求】
1.一种淀粉霉(Amylomyces rouxii)新菌株 CZl，其保藏号为 CGMCC N0.6874。
2.含有权利要求1所述菌株的生物菌剂。
3.根据权利要求2所述的生物菌剂，其中淀粉霉CZl的活菌数为50亿/克以上。
4.制备权利要求2或3所述的生物菌剂的方法，其为在液体发酵培养基中发酵淀粉霉CZ1，将得到的发酵液即为生物菌剂。
5.如权利要求4所述的方法，其还包括将淀粉霉CZl发酵液进行冷冻干燥，制备成的冻干粉为生物 菌剂。
【文档编号】C12R1/645GK103497898SQ201310425145
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】刘克锋, 王顺利, 王红利, 高程达, 石爱平 申请人:北京农学院