一种盐酸曲普利啶有关物质的RT‑HPLC检测方法与流程

本发明涉及药物分析技术领域，特别涉及一种盐酸曲普利啶及其降解杂质、异构体和工艺杂质的反向高效液相色谱检测方法。

背景技术：

盐酸曲普利啶，化学名为(E)-2-[1-(4-甲基苯基)-3-(1-吡咯烷基)-1-丙烯基]吡啶，其结构式如下：

盐酸曲普利啶(tirporlidine hydocrhloirde，TRI)是为新一代高效抗变态反应药物，一种强效的H1受体拮抗剂，具有抗组胺、抗胆碱及中枢镇静作用，临床用于治疗荨麻疹、过敏性鼻炎，缓解感冒所致的流涕、打喷嚏症状，疗效良好，副反应轻微。美国FD A批准作为OTC药物使用，可应用于儿童、孕妇过敏治疗，是一个较好的抗组胺药。

在药物分析中所称的“有关物质(related substances)”是指在原料药生产过程中带入的起始原料、试剂、中间体、副产物和异构体等物质，也可能是制剂在生产、贮藏和运输过程中产生的降解产物、聚合物或晶型转变等特殊杂质。有关物质的种类与药物的合成路线和制剂工艺密切相关，药物在合成和制剂过程中的任何一个因素的改变都可能导致其有关物质的种类不同，因而有关物质的检测和控制过程相对复杂。有关物质的检测是控制药品质量的重要指标。

现有的文献仅见有盐酸曲普利啶异构体限度检查的薄层色谱法的报导，未见有其他相关杂质检测方法的报道。

在盐酸曲普利啶原料药生产过程中带入的起始原料、试剂、中间体、副产物和异构体等杂质，确定相关杂质谱：杂质A、B、C、D、E、F、(见表1)。

表1 盐酸曲普利啶各杂质名称及结构

本发明提供一种能够分离上述杂质和盐酸曲普利啶的分析方法。

目前各国标准采用薄层色谱法测定异构体杂质不得过2％(QP-C)(即下文的实施例1，如图1所示)，该法的准确度和灵敏度都很低。本专利首次采用HPLC分析方法，标准限制为异构体不得过0.5％。

技术实现要素：

本发明提供一种高灵敏度的检测方法，解决将盐酸曲普利啶特征峰与降解杂质、异构体杂质、较多的合成中间体及工艺杂质特征峰分离的问题。

本发明技术方案如下：

盐酸曲普利啶的有关物质杂质的RT-HPLC检测方法，包括下列步骤：

a)配置分析溶液；

b)色谱条件：

色谱柱为反相色谱柱，所述反相色谱柱选自苯基硅烷键合硅胶色谱柱、十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱或八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；以酸及碱或酸及酸铵盐水溶液-有机相的混合液为流动相，水相pH范围2～8，所述的有机相为甲醇或乙腈；采用等度或梯度洗脱方法，所述流动相中水相的体积比为60～90％；所述梯度洗脱中所述流动相的比例按0、20～30、32～35、36～45min时间点，水相体积比为80～75％、80～75％、20～30％、20～80％进行梯度洗脱；

c)上机测定：

取步骤a)制成的分析溶液注入高效液相色谱仪，进行色谱分析，并记录色谱图。

优选方案，盐酸曲普利啶的有关物质杂质的RT-HPLC检测方法，包括下列步骤：

a)配置分析溶液

用甲醇、乙腈单一溶剂或甲醇-水、乙腈-水、甲醇-酸及碱、甲醇-酸及酸铵盐水溶液、乙腈-酸及碱、乙腈-酸及酸铵盐水溶液等混合溶液溶解样品，制成分析溶液；

b)色谱条件

色谱柱为反相色谱柱，所述反相色谱柱选自苯基硅烷键合硅胶色谱柱、十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱或八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

以酸及碱或酸及酸铵盐水溶液-有机相的混合液为流动相，水相pH范围2～8，所述的有机相为甲醇或乙腈；采用等度或梯度洗脱方法，流动相中水相中体积比为90～60％所述梯度洗脱中所述流动相中的比例按0、20～30、32～35、36～45min时间点，水相体积比为80～75％、80～75％、20～30％、20～80％进行梯度洗脱；流速为0.8-1.3ml/min；柱温为25-60℃，检测波长为205-300nm；运行时间40-70min；

c)上机测定

取步骤a)制成的分析溶液5-60μl注入高效液相色谱仪，进行色谱分析，并记录色谱图。

在一些实施例中，所述反相色谱柱的填充剂为苯基硅烷键合硅胶色谱柱或十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱或八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，优选为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。

在一些实施例中，所述反相色谱柱的规格为：柱长介于100mm至300mm，色谱柱内径介于1mm至10mm，粒径介于1μm至10μm，优选为Agilent ZORBAX C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。

在一些实施例中，所述水相的pH 2.0-7.0，优选水相的pH为2.4。

在一些实施例中，所述水相为甲酸及甲酸铵盐水、乙酸及乙酸铵盐水、碳酸氢铵水、三氟乙酸-三乙胺水、三氟乙酸-二乙胺水中之一，优选三氟乙酸-三乙胺水溶液。

优选地，等度洗脱时，所述流动相中水相体积比为90～60％。在一些实施例中，所述流动相中水相体积比为80～60％，优选为70％。

优选地，所述步骤b为所述反相色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，所述流动相为酸及碱或酸及酸铵盐水溶液与乙腈混合液，酸及碱或酸及酸铵盐水溶液pH 2.4，所述流动相中酸及碱或酸及酸铵盐水溶液-乙腈的0、20、35、38min时间点，水相体积比为80％、80％、30％、80％进行梯度洗脱。优选地，所述步骤b所述反相色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，所述流动相中有机相为乙腈，所述水相的pH为2.4，所述流动相中,水相体积比为80～65％进行等度洗脱。

所述样品为盐酸曲普利啶原料药或其制剂，所述制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、眼用制剂、鼻用制剂、栓剂、丸剂、软膏剂乳膏剂、糊剂、吸入制剂、喷雾剂、气雾剂、凝胶剂、散剂、糖浆剂、搽剂、涂剂、涂膜剂、酊剂、贴剂、口服溶液剂、植入剂、膜剂、洗剂、冲洗剂、煎膏剂、膏药、露剂、茶剂。

有益效果：

本发明能够有效的测定盐酸曲普利啶溶液中各种相关杂质的存在，尤其实现了谱图中盐酸曲普利啶特征峰与盐酸曲普利啶降解杂质特征峰、异构体杂质特征峰及其相关中间体、工艺杂质特征峰的分离。同时本发明的方法还可用于盐酸曲普利啶制剂的有关物质检测。

上述方法的检测可以确保产品的质量可控。

附图说明

图1实施例1方法梯度洗脱的色谱图；

(注：图中1‐3分别为杂质C、盐酸曲普利啶粗品、盐酸曲普利啶)

图2实施例1方法等度洗脱的色谱图；

(注：图中1‐7分别为杂质B、A、E、盐酸曲普利啶、C、D、F)

图3实施例1方法梯度洗脱的色谱图；

(注：图中1‐7分别为杂质A、B、E、盐酸曲普利啶、C、D、F)

图4实施例1方法梯度洗脱的色谱图；

(注：图中1‐7分别为杂质A、B、E、盐酸曲普利啶、C、D、F)。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟知的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

(1)仪器与色谱条件

薄层展开缸、紫外灯(254nm)

展开剂：丁酮-二甲基甲酰胺(1:1)

(2)实验步骤

取盐酸曲普利啶适量，用乙腈溶解并稀释成每1ml中约含盐酸曲普利啶10mg的溶液。取杂质C适量，用乙腈溶解并稀释成每1ml中约含杂质C 2mg的溶液。

取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以丁酮-二甲基甲酰胺(1:1)为展开剂，展开，晾干，置紫外灯(254nm)下检视。结果见附图1。该方法确定的异构体限度为2％，范围较大，仅控制杂质C。未对其他工艺杂质进行控制。

实施例2

(1)仪器与色谱条件

高效液相色谱仪：u3000高效液相色谱系统及工作站；

色谱柱：Thermo Syncronis C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

配置0.1％三乙胺水溶液，三氟乙酸调节pH至2.5为水相，流动相中水相-乙腈的比例按75:25进行等度度洗脱，设置流速为1.0ml/min，检测波长为260nm，柱温30℃。

(2)实验步骤

分别取盐酸曲普利啶、杂质A、B、C、D、E、F适量，用乙腈-水(70:30)溶解并稀释成每1ml中约含盐酸曲普利啶及杂质各5μg的混合溶液，作为分析溶液；

取上述分析溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见附图2，可以看出该条件下盐酸曲普利啶主峰和其他杂质峰完全分离。

实施例3

(1)仪器与色谱条件

高效液相色谱仪：U3000高效液相色谱系统及工作站；

色谱柱：Phenomenex Luna C₈(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

配置0.1％三乙胺水溶液，三氟乙酸调节pH至3.0为水相，流动相中水相-乙腈的比例按0、28、34、40、60min时间点，水相体积比为75％、75％、25％、75％、75％进行梯度洗脱，流速1.0ml/min；柱温35℃，检测波长260nm；

(2)实验步骤

分别取盐酸曲普利啶、杂质A、B、C、D、E、F适量，用乙腈-水(70:30)溶解并稀释成每1ml中约含盐酸曲普利啶及杂质各10μg的混合溶液，作为分析溶液；

取上述分析溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见附图3，可以看出该条件下萘帕芬胺主峰和其他杂质峰完全分离。

实施例4

(1)仪器与色谱条件

高效液相色谱仪：U3000高效液相色谱系统及工作站

色谱柱：Agilent ZORBAX C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱

配置0.1％三乙胺水溶液，三氟乙酸调节pH至2.4为水相，流动相中水相-乙腈的比例按0、20、35、38、45min时间点，水相体积比为80％、80％、30％、80％、80％，设置流速为1.0ml/min，检测波长为260nm，柱温55℃。

(2)实验步骤

分别取盐酸曲普利啶、杂质A、B、C、D、E、F适量，用甲醇-水(70:30)溶解并稀释成每1ml中约含盐酸曲普利啶各5μg的混合溶液，作为分析溶液；

取上述分析溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见附图3，可以看出该条件下盐酸曲普利啶主峰和其他杂质峰完全分离。

各色谱峰分离情况