测定2‑氯甲基‑3‑甲基‑4‑(3‑甲氧丙氧基)吡啶盐酸盐中有机杂质的方法与流程

本发明属于分析检测领域，具体涉及一种测定2-氯甲基-3-甲基-4-(3-甲氧丙氧基)吡啶盐酸盐中有机杂质的方法。
背景技术：
：2-氯甲基-3-甲基-4-(3-甲氧丙氧基)吡啶盐酸盐(简称为“雷贝氯化物”)，是一种药物中间体，主要用于制备质子泵抑制剂原料药如雷贝拉唑钠、右旋雷贝拉唑钠、雷贝拉唑镁、右旋雷贝拉唑镁等原料药以及相关制剂。雷贝氯化物的合成路线如下：雷贝氯化物中可能存在的有机杂质有羟化物氯代时产生的二氯代副产物(杂质A)、4-位氯代的羟化物(杂质B)，以及残留的起始原料氮氧化物(杂质C)和中间产物羟化物(杂质D)。雷贝氯化物的质量直接影响以其为关键起始原料的原料药及制剂的质量。关于雷贝氯化物中有机杂质的定量测定方法，未见文献报道，因此，开发一种可定量测定雷贝氯化物中有机杂质的方法，具有重要的现实意义。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种快速准确、专属性强、灵敏度高、操作简捷的测定2-氯甲基-3-甲基-4-(3-甲氧丙氧基)吡啶盐酸盐中有机杂质的方法。为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种测定2-氯甲基-3-甲基-4-(3-甲氧丙氧基)吡啶盐酸盐中有机杂质的方法，所述方法为HPLC方法，所述HPLC方法采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，采用二极管阵列检测器或紫外检测器，按以下方式进行梯度洗脱：设洗脱时间为t，0min＜t≤10min、30min＜t≤40min时，流动相为第一洗脱液，所述第一洗脱液由pH5.5～6.5缓冲溶液与甲醇组成，按体积百分数计，所述pH5.5～6.5缓冲溶液为48％～52％，其余为甲醇；10min＜t≤30min时，流动相为第二洗脱液，所述第二洗脱液由pH5.5～6.5缓冲溶液与乙腈组成，按体积百分数计，所述pH5.5～6.5缓冲溶液为58％～62％，其余为乙腈。上述的测定2-氯甲基-3-甲基-4-(3-甲氧丙氧基)吡啶盐酸盐中有机杂质的方法中，优选的，所述pH5.5～6.5缓冲溶液采用pH6.0缓冲溶液。上述的测定2-氯甲基-3-甲基-4-(3-甲氧丙氧基)吡啶盐酸盐中有机杂质的方法中，优选的，0min＜t≤10min、30min＜t≤40min时，所述流动相为第一洗脱液，所述第一洗脱液由pH6.0缓冲溶液与甲醇组成，按体积百分数计，所述pH6.0缓冲溶液为50％，其余为甲醇；10min＜t≤30min时，所述流动相为第二洗脱液，所述第二洗脱液由pH6.0缓冲溶液与乙腈组成，按体积百分数计，所述pH6.0缓冲溶液为60％，其余为乙腈。上述的测定2-氯甲基-3-甲基-4-(3-甲氧丙氧基)吡啶盐酸盐中有机杂质的方法中，优选的，所述pH5.5～6.5缓冲溶液的浓度范围为0.002mo1/L～0.05mol/L；和/或，检测波长为254nm～300nm；和/或，所述流动相的流速为0.8mL/min～1.2mL/min；和/或，柱温为25℃～40℃。上述的测定2-氯甲基-3-甲基-4-(3-甲氧丙氧基)吡啶盐酸盐中有机杂质的方法中，更优选的，所述pH5.5～6.5缓冲溶液的浓度范围为0.005mo1/L～0.015mol/L；和/或，所述检测波长为264nm；和/或，所述流动相的流速为1.0mL/min；和/或，柱温为30℃。上述的测定2-氯甲基-3-甲基-4-(3-甲氧丙氧基)吡啶盐酸盐中有机杂质的方法中，优选的，所述pH5.5～6.5缓冲溶液为pH5.5～6.5磷酸盐缓冲溶液。上述的测定2-氯甲基-3-甲基-4-(3-甲氧丙氧基)吡啶盐酸盐中有机杂质的方法中，优选的，所述色谱柱为YMCTriart-C18柱。上述的测定2-氯甲基-3-甲基-4-(3-甲氧丙氧基)吡啶盐酸盐中有机杂质的方法中，优选的，所述HPLC方法具体包括以下步骤：(1)有机杂质标准曲线的建立：分别称取杂质A对照品、杂质B对照品、杂质C对照品、杂质D对照品和2-氯甲基-3-甲基-4-(3-甲氧丙氧基)吡啶盐酸盐对照品适量，用甲醇溶解并稀释，配制成一系列不同浓度的混合对照品溶液，其中含杂质A、杂质B、杂质D和2-氯甲基-3-甲基-4-(3-甲氧丙氧基)吡啶盐酸盐的浓度均在4μg/ml～0.5μg/ml范围内，含杂质C的浓度在2μg/ml～0.25μg/ml范围内，在所述HPLC方法的色谱条件下进行测定，记录色谱图，以各组分峰面积对其浓度作图，得到各组分的标准曲线；(2)待测样品中有机杂质含量的测定：将2-氯甲基-3-甲基-4-(3-甲氧丙氧基)吡啶盐酸盐待测样品用甲醇溶解并稀释，制成浓度为1mg/ml的供试品溶液，采用所述HPLC方法，在所述步骤(1)相同的色谱条件下进行测定，记录色谱图，供试品溶液中已知杂质A～D的浓度根据所述步骤(1)中对应杂质的标准曲线求得，供试品溶液中未知杂质的浓度根据所述步骤(1)中2-氯甲基-3-甲基-4-(3-甲氧丙氧基)吡啶盐酸盐的标准曲线求得，再利用供试品溶液中各杂质浓度除以供试品溶液的浓度，得到待测样品中各杂质的含量。上述的测定2-氯甲基-3-甲基-4-(3-甲氧丙氧基)吡啶盐酸盐中有机杂质的方法中，所述有机杂质包括杂质A、杂质B、杂质C和杂质D：所述杂质A为：所述杂质B为：所述杂质C为：所述杂质D为：上述的测定2-氯甲基-3-甲基-4-(3-甲氧丙氧基)吡啶盐酸盐中有机杂质的方法中，所述HPLC方法中，杂质A、杂质B、杂质C、杂质D和2-氯甲基-3-甲基-4-(3-甲氧丙氧基)吡啶盐酸盐均完全分离，各相邻峰之间的分离度均大于1.5；杂质A、杂质B或杂质D在供试品中的质量百分比为0.05％时，信噪比均不低于10，即杂质A、杂质B或杂质D的定量限均达到0.05％；杂质C在供试品中的质量百分比为0.025％时，信噪比不低于10，即杂质C的定量限达到0.025％。本发明的测定方法中，色谱图出峰顺序为杂质C、杂质D、杂质B、雷贝氯化物和杂质A，各相邻峰之间的分离度均大于1.5。供试品溶液的色谱图中如显示出与已知杂质相同保留时间的色谱峰，按外标法以峰面积计算各杂质的含量，杂质C不得过0.1％，杂质A、杂质B和杂质D均不得过0.2％；未知杂质以雷贝氯化物为对照品按外标法以峰面积计算各未知杂质的含量，均不得过0.2％，杂质总量不得过1.0％。与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明对2-氯甲基-3-甲基-4-(3-甲氧丙氧基)吡啶盐酸盐(雷贝氯化物)中有机杂质进行分析，采用C18色谱柱快速准确地测定雷贝氯化物中的有机杂质，保证了雷贝氯化物的质量可控，在原料药合成和制剂生产过程的质量控制方面具有重要意义。目前尚未检索到测定雷贝氯化物中有机杂质的HPLC方法。本发明提供的雷贝氯化物中有机杂质检测方法，可快速准确地检测出雷贝氯化物中有机杂质，该方法的专属性强，灵敏度高，操作简捷，可较好地控制雷贝氯化物生产和应用过程中的质量。附图说明图1为本发明实施例1中空白溶液甲醇的典型HPLC图谱(波长264nm)。图2为本发明实施例1中分离度试验溶液的典型HPLC图谱(波长264nm)。图3为本发明实施例1中灵敏度溶液的典型HPLC图谱(波长264nm)。图4为本发明实施例2中混合对照品溶液Ⅰ的典型HPLC图谱。图5为本发明实施例2中供试品溶液(20160301批)的典型HPLC图谱。具体实施方式以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。以下是本发明测定2-氯甲基-3-甲基-4-(3-甲氧丙氧基)吡啶盐酸盐中有机杂质的方法及对比实验，本发明的方法为HPLC方法，本发明方法的具体内容和条件筛选过程如下：实施例1：流动相组成及检测波长的筛选1.1仪器与试剂液相色谱仪：Agilent1100四元低压液相色谱仪，配有在线真空脱气机、二极管阵列检测器。电子天平：SartoriousBT25S，d＝0.01mg；SartoriousBSA124S，d＝0.1mg。杂质A对照品(纯度为98.97％)、杂质B对照品(纯度为99.59％)、杂质C对照品(纯度为99.55％)、杂质D对照品(纯度为99.47％)及2-氯甲基-3-甲基-4-(3-甲氧丙氧基)吡啶盐酸盐(以下简称雷贝氯化物)对照品(纯度为99.58％)由湖南如虹制药有限公司提供；水为超纯水，甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。杂质A～D的结构式如下：1.2溶液的配制pH6.0磷酸盐缓冲溶液：称取无水磷酸二氢钾8.06g、三水磷酸氢二钾1.16g，加适量的水溶解并稀释至5000ml，摇匀，即得。每升该缓冲溶液中含磷酸二氢钾0.0118mol、含磷酸氢二钾0.00102mol。不同pH值磷酸盐缓冲溶液：取上述pH6.0磷酸盐缓冲溶液适量，用0.1mol/LKOH或磷酸调至所需pH值。分离度试验溶液：取杂质A、杂质B、杂质C、杂质D和雷贝氯化物对照品各适量，精密称定，用甲醇溶解并稀释制成每1ml中含杂质C对照品1μg，含杂质A、杂质B、杂质D对照品各2μg，含雷贝氯化物对照品1mg的混合溶液，即得。灵敏度溶液：取杂质A、杂质B、杂质C、杂质D和雷贝氯化物对照品各适量，精密称定，用甲醇溶解并稀释制成每1ml中含杂质C对照品0.25μg，含杂质A、杂质B、杂质D和雷贝氯化物对照品各0.5μg的混合溶液，即得。灵敏度溶液中杂质A、杂质B、杂质C和杂质D的浓度折算成在1mg/ml雷贝氯化物供试品中的质量百分比分别为0.05％、0.05％、0.025％、0.05％。1.3色谱条件检测器：二极管阵列检测器(DAD检测器)色谱柱：YMCTriart-C18，4.6mm×250mm，5μm；柱温：30℃流速：1.0mL/min；进样量：20μl1.4流动相组成及检测波长的筛选通过调整流动相种类与组成，利用分离度试验溶液进行一系列试验，结果发现当单独采用水-甲醇、水-乙腈、缓冲溶液-甲醇或缓冲溶液-乙腈组成的流动相体系时，虽然尝试了各种不同的水相-有机相组成比例，但不能同时满足杂质A、杂质B、杂质C、杂质D和雷贝氯化物彼此完全分离并具有较高检测灵敏度的要求。通过大量试验发现，当流动相总体由pH5.5～6.5缓冲溶液、甲醇、乙腈组成(按体积百分数计)，并按以下方式进行梯度洗脱：0min＜t≤10min时，流动相为第一洗脱液，第一洗脱液由48％～52％的pH5.5～6.5缓冲溶液与52％～48％甲醇组成；10min＜t≤30min时，流动相为第二洗脱液，第二洗脱液由58％～62％的pH5.5～6.5缓冲溶液与42％～38％乙腈组成；30min＜t≤40min时，流动相为第一洗脱液。在上述条件下，杂质A、杂质B、杂质C、杂质D和雷贝氯化物均能彼此完全分离，各相邻峰之间的分离度均大于1.5。更优选的，流动相由pH6.0磷酸盐缓冲溶液、甲醇、乙腈组成(按体积百分数计)，并按以下方式进行梯度洗脱：0min＜t≤10min，pH6.0磷酸盐缓冲溶液为50％，甲醇为50％，乙腈为0％；10min＜t≤30min，pH6.0磷酸盐缓冲溶液为60％，甲醇为0％，乙腈为40％；30min＜t≤40min，pH6.0磷酸盐缓冲溶液为50％，甲醇为50％，乙腈为0％。在此条件下，各已知杂质峰、雷贝氯化物峰彼此之间均能完全分离，各相邻峰之间的分离度均大于2.0。利用DAD检测器记录分离度试验溶液中各已知杂质及雷贝氯化物的全部光谱，结果发现在264nm处杂质A、杂质B、杂质C、杂质D和雷贝氯化物均有较强吸收，因此对雷贝氯化物样品中有机杂质进行检测时波长优选为264nm。当检测波长采用264nm，流动相由pH6.0磷酸盐缓冲溶液、甲醇、乙腈组成，并进行梯度洗脱(0min＜t≤10min，缓冲溶液为50％，甲醇为50％，乙腈为0％；10min＜t≤30min，缓冲溶液为60％，甲醇为0％，乙腈为40％；30min＜t≤40min，缓冲溶液为50％，甲醇为50％，乙腈为0％)时，空白溶液(甲醇)的典型色谱图见图1，分离度试验溶液的典型色谱图见图2，灵敏度溶液的典型色谱图见图3。图2和图3的详细信息分别见表1和表2。由图1～图3及表1～表2提供的信息可知，空白溶液对测定无干扰，杂质C、杂质D、杂质B、雷贝氯化物和杂质A峰彼此的分离度均大于2.0，表2的结果表明当杂质A、杂质B、杂质C和杂质D在雷贝氯化物供试品中的质量百分比分别为0.05％、0.05％、0.025％和0.05％时，各峰的信噪比均不低于10，表明杂质A、杂质B和杂质D的定量限均可达到0.05％，杂质C的定量限可达到0.025％。表1分离度试验溶液的HPLC图谱信息组分名称保留时间峰高峰面积分离度拖尾因子理论塔板数杂质C6.1649.379180.669---0.813038杂质D7.6111.43336.4812.571.062005杂质B9.2044.729100.9342.610.964678雷贝氯化物21.2393328293.10120.251.0617157杂质A23.6573.035112.9333.071.3210501表2灵敏度溶液的HPLC图谱信息实验结果表明，本发明的方法检测灵敏度高，能实现对2-氯甲基-3-甲基-4-(3-甲氧丙氧基)吡啶盐酸盐中有机杂质进行有效监控的目的。实施例2：实际样品的测定2.1仪器与试剂仪器同实施例1，雷贝氯化物供试品3批(批号：20160301、20160302、20160303)由湖南如虹制药有限公司提供，其他试剂同实施例1。2.2色谱测定条件检测器：二极管阵列检测器(DAD检测器)检测波长：264nm；色谱柱：YMCTriart-C18，4.6×250mm，5μm；柱温：30℃流速：1.0ml/min；进样量：20μl随着洗脱时间的不同，流动相先后采用第一洗脱液、第二洗脱液和第一洗脱液，总体上由pH6.0磷酸盐缓冲溶液、甲醇、乙腈组成(按体积百分数计)，具体按以下方式进行梯度洗脱：0min＜t≤10min时，pH6.0磷酸盐缓冲溶液为50％，甲醇为50％，乙腈为0％；10min＜t≤30min时，pH6.0磷酸盐缓冲溶液为60％，甲醇为0％，乙腈为40％；30min＜t≤40min时，pH6.0磷酸盐缓冲溶液为50％，甲醇为50％，乙腈为0％。2.3溶液的配制pH6.0磷酸盐缓冲溶液：配制方法同实施例1。混合对照品溶液Ⅰ：取杂质A、杂质B、杂质C、杂质D和2-氯甲基-3-甲基-4-(3-甲氧丙氧基)吡啶盐酸盐(雷贝氯化物)对照品各适量，精密称定，用甲醇溶解并稀释制成每1ml中含杂质C约2μg，含杂质A、杂质B、杂质D和雷贝氯化物各约4μg的混合溶液，即得。供试品溶液：取雷贝氯化物供试品适量，精密称定，用甲醇溶解并稀释制成每1ml中含雷贝氯化物约为1mg的溶液，即得。2.4有机杂质标准曲线的建立取混合对照品溶液Ⅰ适量，用甲醇逐级稀释，制得一系列不同浓度的混合对照品溶液，然后精密移取各混合对照品溶液20μl，分别注入色谱仪，记录色谱图。以各杂质浓度X(μg/ml)为横坐标，以各杂质峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，得到杂质C标准曲线方程为：Y＝179.2953X+0.5412(r＝0.9999)；杂质D标准曲线方程为：Y＝19.4881X-1.8909(R＝0.9915)；杂质B标准曲线方程为：Y＝47.5948X+0.7077(R＝0.9996)；杂质A标准曲线方程为：Y＝40.9596X-0.1327(R＝0.9994)；雷贝氯化物的标准曲线方程为：Y＝16.2918X-0.3603(R＝0.9907)。如图4所示，为混合对照品溶液Ⅰ的典型HPLC图谱，保留时间6.187为杂质C，保留时间7.753为杂质D，保留时间9.232为杂质B，保留时间21.594为雷贝氯化物，保留时间23.950为杂质A。2.5待测样品中有机杂质含量的测定精密量取供试品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液的色谱图中如显示与已知杂质相同保留时间的色谱峰，供试品溶液中已知杂质A～D的浓度根据2.4项下杂质A～D的标准曲线求得，供试品溶液中未知杂质浓度根据2.4项下雷贝氯化物标准曲线求得，再利用各杂质浓度除以供试品溶液的浓度，得到供试品中各杂质的百分含量。表3各批雷贝氯化物实际样品的检测结果※备注：表中各杂质的含量均指杂质在供试品中所占质量百分比。图5为供试品溶液20160301批的典型HPLC图谱，由图5可知，保留时间7.681min为杂质D峰，保留时间21.233min为雷贝氯化物峰。由表3可知，各批雷贝氯化物样品中杂质C含量均低于0.1％，杂质A、杂质B和杂质D均低于0.2％，未知杂质含量低于0.2％，杂质总量低于1.0％，表明雷贝氯化物符合要求，本方法可以用于雷贝氯化物的质量检测。由上述实施例可知，本发明的检测方法操作简便，专属性强，能灵敏地检测出雷贝氯化物中有机杂质，适用于雷贝氯化物制备和应用过程中的质量监控。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。当前第1页1 2 3