本发明涉及分析化学领域，具体涉及一种茶叶鲜样中茶氨酸含量的快速分析方法。
背景技术：
茶是世界三大天然饮料之一，具有独特的香气、丰富的营养和保健功效，深受消费者喜爱。茶叶中含有丰富的氨基酸，它们是构成茶叶滋味的重要成分，直接影响茶叶的品质。其中，茶氨酸是茶叶中特有的一种氨基酸，占茶叶氨基酸总量的50%以上。茶氨酸安全无毒，具有降血压、抗疲劳、抗肿瘤等多种生物学功能，随着茶氨酸生理功能和医药价值的发现，茶氨酸在医疗、保健、食品、饮料和精细化工等领域被广泛利用。茶氨酸的准确定量分析，对于茶叶品质的评价、茶氨酸的应用研究开发及其功能代谢等方面的研究具有十分重要的意义。
目前对茶叶中茶氨酸分析方法的研究中以干样较多和较为成熟，如国标gb/t8303-2013中规定，茶样需磨碎后在电热恒温干燥箱中加热、除去水分至恒重后再用于氨基酸含量的测定。由于干样通常经高温杀青、烘干和粉碎而成，高温过程中蛋白质变性，其蛋白酶的生物活性丧失，易造成蛋白质降解导致氨基酸含量增加，同时烘干等步骤可能会引起茶叶各种生化成分的转化，使得测定的数据并不能反应茶叶中氨基酸的真实水平，从而产生检测误差。
茶叶中茶氨酸的分析方法主要有茚三酮比色法、气相色谱及其质谱联用法、毛细管电泳法、高效液相色谱法等。经典的分析方法一般采用氨基酸分析仪，使用茚三酮作为衍生试剂柱后衍生测定。但氨基酸分析仪价格昂贵，分析时间长，专属性强，只能用于分析茶氨酸等游离氨基酸，限制了其广泛应用。相对于其他几种方法，柱前衍生-高效液相色谱法无需特殊反应装置，具有仪器普及率高、分析时间短、方法灵活多样、灵敏度高、易于推广的优点，逐渐成为茶氨酸检测的常规手段。中国发明专利“利用反相高效液相色谱检测茶叶中游离氨基酸的方法”（专利号zl201510109474.4）以6-氨基喹啉-n-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯为柱前衍生剂，使用氨基酸专用分析柱进行梯度洗脱，结合反相高效液相色谱，实现了对茶叶中茶氨酸等19种氨基酸的定量分析。但该发明采用氨基酸分离专用色谱柱，需要进行复杂的梯度分离，使用成本高，运行周期长（1h左右），在大量样品分析过程中，十分的费时，不利于茶氨酸的快速分析和推广普及。更重要的是，该发明没有对方法的准确性、灵敏性、精密性等进行必要的方法学验，技术效果无法得到有效保障。
技术实现要素：
本发明提供一种茶叶鲜样中茶氨酸含量的快速分析方法，其目的在于解决现有的茶叶茶氨酸分析方法中存在的速度慢、效率低、成本高、基础应用推广难等问题。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种茶叶鲜样中茶氨酸含量的快速分析方法，包括以下两部分：
第一部分，配制溶液，再用高效液相色谱-荧光检测法建立已知梯度浓度的被测的茶氨酸的标准曲线；所述标准曲线的建立由以下步骤组成：
步骤（1），准备茶氨酸标准品，再分别配制0.14mol/l的磷酸盐缓冲液、0.4mol/l的硼酸盐缓冲液、1mg/ml的aqc衍生液、6种浓度的茶氨酸标准工作溶液，茶氨酸标准工作溶液的浓度分别为1μmol/l、5μmol/l、50μmol/l、500μmol/l、1000μmol/l、1250μmol/l；
步骤（2），对所述茶氨酸标准工作溶液进行衍生化反应；
移取6种浓度的所述茶氨酸标准工作溶液，每种浓度的茶氨酸标准工作溶液均取10μl，置于自动进样瓶中，分别加入70μl所述硼酸盐缓冲液，涡旋混合；分别取15μl所述aqc衍生液和5μl乙腈，在涡旋状态下加入自动进样瓶中，涡旋混合，静置后在50~55℃下加热8~15min，取出冷却至室温，供分析用；
步骤（3），用高效液相色谱-荧光检测法测定衍生化的所述茶氨酸标准工作溶液中茶氨酸的色谱峰保留时间和色谱峰面积，以色谱峰保留时间定性，然后以所述茶氨酸标准工作溶液的摩尔浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标绘制出所述标准曲线；
其中，仪器分离条件为：
色谱柱：xbridgec18色谱柱（规格为3.9mm×15cm，4μm）；柱温37℃；流速2.0ml/min；
荧光检测：激发波长250nm，发射波长395nm；
流动相：a为磷酸盐缓冲液，按l:10的体积比用超纯水稀释；b为100%乙腈；c为100%超纯水；梯度洗脱程序：0min，100%a；0.5min，98%a+2.0b%；0.5-9.0min，96.5%a+3.5%b；9.0-9.5min，95.0%a+5.0%b；9.5-11.5min，91.5%a+8.5%b；11.5-13.0min，83.0%a+17.0%b，保持4min；17.0min，60.0%b+40%c，保持2min；19-23min，100%a；进样量10μl；
第二部分，测定茶叶鲜样中所述第一部分中的茶氨酸含量，包括以下步骤：
步骤（1），样品制备；
取茶叶鲜样搅碎并混合均匀，向茶叶鲜样中加入沸水，所述茶叶鲜样与所述沸水的投入比为向每1g茶叶鲜样中投入40ml沸水，在88~92℃条件下浸提18~22min，冷却至室温后，2500~3500r/min离心4~6min，上清液加水定容10ml，过0.45μm微孔滤膜后得到茶鲜叶样品溶液；
步骤（2），对所述茶鲜叶样品溶液进行衍生化反应；
移取10μl茶鲜叶样品溶液，置于自动进样瓶中，加入70μl所述硼酸盐缓冲液，涡旋混合；分别取15μl所述aqc衍生液和5μl乙腈，在涡旋状态下加入自动进样瓶中，涡旋混合，静置后在50~55℃下加热8~15min，取出冷却至室温，供分析用；
步骤（3），根据所述茶氨酸标准工作溶液中茶氨酸的色谱峰保留时间对所述茶鲜叶样品溶液中茶氨酸定性，使用外标曲线法计算茶鲜叶样品溶液中茶氨酸的含量；其中，测定茶鲜叶样品溶液中茶氨酸的仪器分离条件与所述第一部分的步骤（3）中的仪器分离条件相同。
上述技术方案中的有关内容解释如下：
1、上述方案中，在所述第一部分的步骤（1）中，0.14mol/l的磷酸盐缓冲液的配制方法为：称取19.0g三水醋酸钠、1.72g三乙胺溶于1000ml水，用磷酸调节ph至5.05，加edta，用0.45µm滤膜过滤；
0.4mol/l的硼酸盐缓冲液的配制方法为：称取12.36g硼酸，加400ml水溶解，用400g/l氢氧化钠溶液调节ph至8.8，然后加水稀释至500ml；
1mg/ml的aqc衍生液的配制方法为：向1mgaqc粉末中加入1ml乙腈，涡旋混合，在55℃条件下加热至溶解。aqc即指6-氨基喹啉基-n-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯，waters公司生产，乙腈为色谱纯。
茶氨酸标准母液的配制：精密称取茶氨酸标准品适量，置于25ml容量瓶中，加超纯水溶解并定容至刻度，得茶氨酸标准溶液，浓度为12.5μmol/l，于-20℃冰箱保存。再用所述茶氨酸标准母液配制成上述6种浓度的茶氨酸标准工作溶液。
本发明工作原理以及有益效果是：本发明针对现有茶氨酸分析技术中存在的速度慢、效率低、成本高、推广难等问题，通过技术创新，建立了一种快速、实用、高效、准确的茶叶鲜样中茶氨酸的分离分析的方法。将茶叶鲜样搅碎混匀，以超纯水作为萃取溶剂，在90℃条件下浸提20min，离心过滤后，以6-氨基喹啉-n-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯为衍生剂柱前衍生化，使用xbridgec18色谱柱梯度洗脱，用高效液相色谱-荧光检测器分离检测。传统方法均以茶叶干样作为样品来检测茶氨酸含量，这是由于茶叶鲜样比茶叶干样含有更多的水分、色素、水溶性灰分、茶多酚等干扰物质，容易造成后续分离困难，也就是说，现有的测定茶叶干样中茶氨酸的检测方法不适用于茶叶鲜样的测定。本发明以茶叶鲜样代替茶叶干样作为样品，为了解决分离困难的难题，创造性、针对性地选用6-氨基喹啉-n-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯为柱前衍生剂，联合利用xbridgec18色谱柱以及高效液相色谱-荧光检测器分离分析，发现能够快速、高效、准确地分离分析茶叶鲜样中茶氨酸。尤其是选用规格为4μm的高效xbridgec18色谱柱与aqc柱前衍生法联用，在保证分析速度更快的同时，能够很好地分离茶叶鲜样中茶氨酸，从而保证了对茶叶鲜样中茶氨酸的定性定量分析。
与现有茶叶茶氨酸分析技术相比，本发明有益效果：
①首次建立了针对茶叶鲜样中茶氨酸的快速定量分析方法，优点在于以茶叶鲜样作为样品，代替了传统方法中以茶叶干样作为样品来检测茶氨酸含量，避免了高温、烘干等步骤可能引起的茶叶各种生化成分间的转化、导致茶氨酸含量变化而产生的检测误差，测定数据更加精准可靠，可真实地反应茶叶中茶氨酸的含量水平；
②选用xbridgec18色谱柱，代替氨基酸专用分析柱，对茶氨酸进行分离分析，通过技术优化，整个分析周期只有14分钟，大大提高了对茶氨酸的分析效率，可满足大批量样品分析对进度的要求。同时，xbridgec18色谱柱价格相对便宜，专属性不强，可以用于其他物质的检测，在节省分析成本的前提下，弥补了目前基于高效液相色谱不能准确对茶叶中茶氨酸进行快速分析的空缺，特别适合在广大基层检测机构和单位推广使用。
总之，本发明的样品制备快速简单、成本低，精密度、准确度、稳定性以及线性关系良好，整个分析过程快速、灵敏且重现性好，适用于茶叶鲜样中茶氨酸的快速分析，为茶叶中茶氨酸的质量控制提供了有效的分析方法，适宜于推广应用。
附图说明
附图1为本发明茶氨酸标准工作溶液的hplc图谱。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例：一种茶叶鲜样中茶氨酸含量的快速分析方法
所述快速分析方法包括以下两部分：
第一部分，配制溶液，再用高效液相色谱-荧光检测法建立已知梯度浓度的被测的茶氨酸的标准曲线；所述标准曲线的建立由以下步骤组成：
步骤（1），准备茶氨酸标准品，再分别配制0.14mol/l的磷酸盐缓冲液、0.4mol/l的硼酸盐缓冲液、1mg/ml的aqc衍生液、6种浓度的茶氨酸标准工作溶液，茶氨酸标准工作溶液的浓度分别为1μmol/l、5μmol/l、50μmol/l、500μmol/l、1000μmol/l、1250μmol/l；
0.14mol/l的磷酸盐缓冲液的配制方法为：称取19.0g三水醋酸钠、1.72g三乙胺溶于1000ml水，用磷酸调节ph至5.05，加edta，用0.45µm滤膜过滤；
0.4mol/l的硼酸盐缓冲液的配制方法为：称取12.36g硼酸，加400ml水溶解，用400g/l氢氧化钠溶液调节ph至8.8，然后加水稀释至500ml；
1mg/ml的aqc衍生液的配制方法为：向1mgaqc粉末中加入1ml乙腈，涡旋混合，在55℃条件下加热至溶解。
茶氨酸标准母液的配制：精密称取茶氨酸标准品适量，置于25ml容量瓶中，加超纯水溶解并定容至刻度，得茶氨酸标准溶液，浓度为12.5μmol/l，于-20℃冰箱保存。再用所述茶氨酸标准母液配制成上述6种浓度的茶氨酸标准工作溶液。
准备仪器与设备：2695高效液相色谱仪，配2475荧光检测器（waters公司）；tg16-ws台式高速离心机（湖南湘仪实验仪器公司）；k600粉碎机（德国博朗公司）；le-3000电热恒温水浴锅（上海跃进医疗器械公司）；direct-q5uv超纯水机（美国millipore公司）。
步骤（2），对所述茶氨酸标准工作溶液进行衍生化反应；
移取6种浓度的所述茶氨酸标准工作溶液，每种浓度的茶氨酸标准工作溶液均取10μl，置于自动进样瓶中，分别加入70μl所述硼酸盐缓冲液，涡旋混合；分别取15μl所述aqc衍生液和5μl乙腈，在涡旋状态下加入自动进样瓶中，涡旋混合10～20s，静置1min后在55℃下加热10min，取出冷却至室温，供分析用；
步骤（3），用高效液相色谱-荧光检测法测定衍生化的所述茶氨酸标准工作溶液中茶氨酸的色谱峰保留时间和色谱峰面积，以色谱峰保留时间定性，然后以所述茶氨酸标准工作溶液的摩尔浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标绘制出所述标准曲线；
其中，仪器分离条件为：
色谱柱：xbridgec18色谱柱（规格为3.9mm×15cm，4μm，waters公司）；柱温37℃；流速2.0ml/min；
荧光检测：激发波长250nm，发射波长395nm；
流动相：a为磷酸盐缓冲液，按l:10的体积比用超纯水稀释；b为100%乙腈；c为100%超纯水；梯度洗脱程序：0min，100%a；0.5min，98%a+2.0b%；0.5-9.0min，96.5%a+3.5%b；9.0-9.5min，95.0%a+5.0%b；9.5-11.5min，91.5%a+8.5%b；11.5-13.0min，83.0%a+17.0%b，保持4min；17.0min，60.0%b+40%c，保持2min；19-23min，100%a；进样量10μl；
第二部分，测定茶叶鲜样中所述第一部分中的茶氨酸含量，包括以下步骤：
步骤（1），样品制备；
取茶叶鲜样搅碎并混合均匀，称取0.25g，加入10ml沸水，在90℃的水浴锅中浸提20min，冷却至室温后，3000r/min离心5min，上清液加水定容10ml，过0.45μm微孔滤膜后备用得到茶鲜叶样品溶液；
步骤（2），对所述茶鲜叶样品溶液进行衍生化反应；
移取10μl茶鲜叶样品溶液，置于自动进样瓶中，加入70μl所述硼酸盐缓冲液，涡旋混合；分别取15μl所述aqc衍生液和5μl乙腈，在涡旋状态下加入自动进样瓶中，涡旋混合10～20s，静置1min后在55℃下加热10min，取出冷却至室温，供分析用；
步骤（3），根据所述茶氨酸标准工作溶液中茶氨酸的色谱峰保留时间对所述茶鲜叶样品溶液中茶氨酸定性，使用外标曲线法计算茶鲜叶样品溶液中茶氨酸的含量；其中，测定茶鲜叶样品溶液中茶氨酸的仪器分离条件与所述第一部分的步骤（3）中的仪器分离条件相同。
本实施例的试验结果：
1、茶氨酸标准工作溶液的色谱分离
从附图1中可以看出，茶氨酸标准工作溶液经衍生后测定，出峰时间在11min左右，出峰前后无其他干扰，说明此方法可用作茶氨酸准确定性及定量测定。
2、方法的回归方程、相关系数及检出限
配制浓度分别1、5、50、500、1000、1250μmol/l的茶氨酸标液，衍生化后进样测定，以茶氨酸溶液浓度（x）为横坐标、对应峰面积（y）为纵坐标，绘制标准工作曲线，并进行线性回归分析，计算相关系数（表1）。
结果表明，在5～250μmol/l范围内，茶氨酸的浓度与其峰面积的线性关系良好，相关系数为0.9991。以3倍信噪比计算方法的检出限为0.05μmol/l。
表1茶氨酸的线性方程、相关系数和检出限
3、方法回收率
精密称取0.25g已知茶氨酸含量的茶鲜叶样品5份，向其中加入一定体积的标准溶液，添加水平相当于50μmol/l，进行样品制备、衍生反应后测定，采用外标法定量，得出茶氨酸的平均回收率为87.91，rsd为9.02。说明本方法准确度高，重现性好，方法可靠。
4、方法精密度
取适量含茶氨酸的标准溶液，按上述方法衍生后进样分析，连续进样5次，以色谱峰的保留时间和峰面积为指标计算rsd，考察其精密度。得出茶氨酸保留时间rsd为0.49%，峰面积rsd为1.97%，说明本方法精密度较高。
5、方法重复性
取同一茶鲜叶样品5份，按上述方法提取、衍生、测定，以色谱峰的保留时间和峰面积为指标分别计算rsd，考察方法的重复性。茶鲜叶所含茶氨酸峰保留时间rsd为1.68%，峰面积rsd为2.55，重复性较好。
6、方法稳定性
取同一茶鲜叶样品供试溶液，按照上述方法衍生，分别在0、4、8、12、24h进样，以色谱峰的保留时间和峰面积为指标计算rsd，考察茶鲜叶衍生化溶液的稳定性。茶氨酸衍生化产物保留时间rsd为1.50%（n=5），峰面积rsd为2.54%(n=5)。表明氨基酸衍生化溶液在室温下可以稳定24h。
7、方法应用
应用建立的方法，分别对取自苏州洞庭东山和洞庭西山的2个碧螺春茶叶鲜样中的茶氨酸进行测定，结果如表2所示。
表2茶叶鲜样中茶氨酸的检测结果
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。